孫 敏, 劉玉龍, 劉 科, 劉玲玲, 張魯寧, 顏貴明, 卞 海

(安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012)

缺血性腦卒中是最多見(jiàn)的腦血管疾病,占全部腦中風(fēng)的69.6%～70.8%[1]。腦卒中后,及時(shí)恢復(fù)血氧供應(yīng)是臨床治療的首要原則,但這極大可能會(huì)引發(fā)二次傷害[2]。除神經(jīng)受損外,缺血后再灌注可加劇腦損傷[3]。已有數(shù)據(jù)表明氧化應(yīng)激是腦缺血再灌注損傷的強(qiáng)有力介質(zhì)[4]。

《金匱要略》中對(duì)瓜蔞薤白湯有所記載,表明其由瓜蔞、薤白和白酒構(gòu)成,常用于治療冠心病和心梗等病癥。李明明[5]研究說(shuō)明瓜蔞薤白湯能明顯提升心肌缺血再灌注損傷大鼠模型的血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、減少丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。瓜蔞薤白湯中瓜蔞子醇提物可通過(guò)清除DPPH自由基和ABTS自由基來(lái)發(fā)揮抗氧化作用[6]。薤白的汁液對(duì)大鼠血清和T淋巴細(xì)胞中的SOD和CAT有明顯的保護(hù)作用,可抑制血清脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成[7]。本研究建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,以瓜蔞薤白湯為干預(yù)手段,研究此方對(duì)于腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)大鼠的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物及主要試劑

瓜蔞薤白湯:取48 g瓜蔞、24 g薤白,用白酒濃縮回流提取,使藥物濃縮至含生藥1 g/mL。瓜蔞和薤白(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)；陽(yáng)性藥物為尼莫地平片(20 mg/片,批號(hào):2006090);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):520C031)；SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào):20210617)；丙二醛(MDA)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào):20210616)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

水浴鍋(常州國(guó)宇儀器制造有限公司);OLYMPUSBX51正置顯微鏡(上海富萊光學(xué)科技有限公司);K3酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

40只SPF級(jí)SD雄性大鼠(240±20) g,飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2017-0003。所有動(dòng)物均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),動(dòng)物倫理編號(hào):AHUCM-rats-2021047。

1.4 制備CIRI模型

實(shí)驗(yàn)分為4組:假手術(shù)組、模型組、瓜蔞薤白湯組和尼莫地平組,每組10只大鼠。采用改良線栓法制作大鼠局灶性CIRI模型[8]:腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉大鼠,右側(cè)頸部脫毛,在頸部脫毛部位擦拭碘伏剪去表皮,分離組織,找出頸總動(dòng)脈。先分離右側(cè)頸總動(dòng)脈,再分離頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈,小心剝離迷走神經(jīng),避免其損傷。從頸總動(dòng)脈向上剝離,結(jié)扎頸總動(dòng)脈下端和頸外動(dòng)脈,用動(dòng)脈夾夾住頸內(nèi)動(dòng)脈,用眼科剪在頸總動(dòng)脈處切開(kāi)一個(gè)小口,插入深度約為1.8～2.2 cm的0.285 mm線栓,然后縫合肌肉組織。缺血2 h后取出部分線栓,再灌注24 h觀察模型。假手術(shù)組僅進(jìn)行鈍性分離縫合,不做任何其他處理。

1.5 神經(jīng)功能損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

灌注24 h后,根據(jù)Longa等[9]的5點(diǎn)評(píng)分系統(tǒng),由不了解研究方案的研究者對(duì)神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分系統(tǒng)如下:(1)正常行走或無(wú)神經(jīng)功能缺損:0分。(2)不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪或輕度局灶性神經(jīng)功能缺損:1分。(3)向?qū)?cè)盤(pán)旋或中度局灶性神經(jīng)功能缺損:2分。(4)向?qū)?cè)墜落或嚴(yán)重的局灶性神經(jīng)功能缺損：3分。(5)意識(shí)水平為4級(jí)的抑郁癥患者不能自發(fā)行走：5分。

1.6 給藥方法

灌胃給藥,瓜蔞薤白湯2.16 g/(kg·d),陽(yáng)性藥[4]尼莫地平0.01 g/(kg·d),假手術(shù)組與模型組持續(xù)3 d灌胃給予等量生理鹽水。

1.7 取材

3 d后取材,使大鼠處于麻醉狀態(tài)下,首先腹主動(dòng)脈取血,隨后快速取出腦組織,每組大鼠取多個(gè)腦組織作冠狀切片,隨后用4%多聚甲醛中固定不動(dòng),48 h后脫水包埋。此外,每組再取5只置于-20 ℃冷凍20～30 min后用于TTC染色,剩余組織置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.8.1 TTC染色測(cè)腦梗死體積 取出腦組織,制作薄厚約2 mm的冠狀切片,將切片后的腦片放入六孔板中,添加2%TTC染液,37 ℃恒溫孵育,孵育全過(guò)程中適度轉(zhuǎn)動(dòng)冠狀切片,20 min后取出。將TTC染色的切片置于組織固定液中,24 h后取出拍照,用Image-Pro Plus 6.0測(cè)算各切片腦梗死體積以及占大腦半球體積的百分?jǐn)?shù)。

1.8.2 HE染色觀察腦組織病理形態(tài) 取組織脫水，包埋在石蠟中,并切成5 μm的組織切片。通過(guò)脫蠟、脫水處理后,切片用蘇木精和伊紅染色,隨后用中性樹(shù)膠封片,放置在高倍顯微鏡下(×400)觀察病理形態(tài)。

1.8.3 SOD、MDA的測(cè)定 腹主動(dòng)脈取血后,將大鼠血清在常溫下放置30 min,以3 500 r/min離心15 min,取上層血清。根據(jù)SOD、MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定大鼠血清中SOD、MDA的含量。

1.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能損傷評(píng)分

通過(guò)幾名與本實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)人員對(duì)成模后的大鼠神經(jīng)功能評(píng)分,結(jié)果如表1所示,造模成功后除假手術(shù)組外,其余各組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分情況

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較

結(jié)果表明,假手術(shù)組動(dòng)物處于正常狀態(tài),腦組織無(wú)缺血現(xiàn)象。模型組腦梗死體積明顯高于假手術(shù)組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);瓜蔞薤白湯組和尼莫地平組與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);瓜蔞薤白湯組與尼莫地平組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果如圖1和表2所示。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色結(jié)果

表2 各組大鼠腦梗死體積百分比

2.3 各組大鼠腦組織病理變化

模型組腦組織受損,間質(zhì)水腫,核質(zhì)分離,排列散亂,間隙較大(見(jiàn)圖2中黑色箭頭處);與模型組相比,瓜蔞薤白湯組和尼莫地平組腦損傷程度明顯改善,細(xì)胞排列更規(guī)則有序,細(xì)胞間隙更小;假手術(shù)組腦組織未見(jiàn)損傷,神經(jīng)細(xì)胞排列有序,包膜完整,細(xì)胞間隙正常(圖2)。

圖2 各組大鼠腦組織HE染色(×400),比例尺=25 μm

2.4 大鼠血清中SOD、MDA含量

機(jī)體清除氧自由基的能力用SOD來(lái)表示,自由基對(duì)細(xì)胞攻擊的嚴(yán)重程度用MDA來(lái)表示。如表3所示,與假手術(shù)組相比,模型組SOD活力顯著降低,MDA含量顯著升高(P<0.05);瓜蔞薤白湯治療后SOD活力顯著升高,MDA含量顯著降低(P<0.05);瓜蔞薤白湯組與尼莫地平組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清中SOD、MDA的含量變化

3 結(jié)論與討論

中藥是臨床應(yīng)用的主要形式,是由多種單味中藥按內(nèi)在質(zhì)量比組合而成,以達(dá)到療效和減少副作用的目的,已被千百年來(lái)廣泛的臨床實(shí)踐所證明。薤白與瓜蔞、半夏、枳殼、銀杏等合用,形成瓜蔞薤白湯、瓜蔞薤白半夏湯、枳實(shí)薤白桂枝湯治療胸梗阻心絞痛[10]。迄今,在這3個(gè)方劑的基礎(chǔ)上,加上中藥,發(fā)展出了眾多的加味方劑。瓜蔞薤白湯主治胸痹,近年來(lái),也用于腦缺血再灌注損傷的治療[11]。瓜蔞薤白湯為理氣劑,具有通陽(yáng)散結(jié),行氣祛痰的功效。瓜蔞桂枝湯已應(yīng)用于中風(fēng)后肢體痙攣的治療,療效良好,副作用少[12]。Chen等[13]在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),瓜蔞桂枝湯可通過(guò)改善肢體肌肉張力和運(yùn)動(dòng)功能來(lái)促進(jìn)腦卒中后的恢復(fù),從而提高腦卒中患者的生活質(zhì)量。目前,關(guān)于瓜蔞薤白湯抗CIRI的具體機(jī)制研究較少。本研究從氧化應(yīng)激的角度對(duì)其具體機(jī)制進(jìn)行初步探討。

CIRI大鼠存在神經(jīng)功能缺損和運(yùn)動(dòng)障礙,因此腦組織的血液供應(yīng)對(duì)機(jī)體具有特殊意義。TTC染色和HE染色顯示研究模型成功建立。除假手術(shù)組外,其余各組大鼠皆在造模后顯現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)功能受損和病理學(xué)損傷。結(jié)果表明,瓜蔞薤白湯可以改善腦缺血再灌注模型大鼠的腦組織病理學(xué)損傷。

腦缺血后血氧供應(yīng)恢復(fù)引起的再灌注損傷涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和程序性細(xì)胞死亡等多種病理機(jī)制[14]。腦缺血時(shí)ROS過(guò)度產(chǎn)生,再灌注后缺氧部分引入新的氧分子,使得ROS再度增長(zhǎng),導(dǎo)致缺血腦組織抗氧化能力超負(fù)荷,最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷、神經(jīng)功能障礙乃至細(xì)胞死亡[2]。MDA作為ROS的主要產(chǎn)物,可以在一定程度上反映ROS造成的損傷,進(jìn)而表現(xiàn)出氧自由基的含量。SOD是體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子,一般來(lái)說(shuō),腦血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物歧化酶。作為唯一能特異性清除O2的抗氧化酶,SOD能發(fā)生歧化反應(yīng),阻斷過(guò)氧化引起的毒性作用[15]。ROS通過(guò)消耗SOD阻止機(jī)體抗凋亡信號(hào)通路的激活,導(dǎo)致腦損傷。因此,抑制缺血再灌注后細(xì)胞內(nèi)MDA的含量,促進(jìn)SOD的活力是抵抗CIRI的途徑之一。本研究結(jié)果顯示,瓜蔞薤白湯可以顯著降低腦缺血再灌注損傷大鼠血清中MDA的含量,顯著升高SOD的活力,表明瓜蔞薤白湯可能是通過(guò)抗氧化應(yīng)激發(fā)揮的腦保護(hù)作用。

研究結(jié)果表明,瓜蔞薤白湯可改善神經(jīng)功能受損,使腦梗塞體積減少,降低腦組織的病理?yè)p傷,可通過(guò)上調(diào)SOD和下調(diào)MDA含量來(lái)治療CIRI。本研究從氧化應(yīng)激角度對(duì)瓜蔞薤白湯抗CIRI的機(jī)制進(jìn)行了初步探索,對(duì)于抗氧化應(yīng)激的相關(guān)通路機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。