陸佳 蔡利棟 吳曉宇 丁羽 鞏超

成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞是心臟內(nèi)2 種含量最豐富的細(xì)胞類(lèi)型[1-2]。正常情況下，成纖維細(xì)胞在心肌細(xì)胞增殖分化、電信號(hào)擴(kuò)布以及機(jī)械應(yīng)力的傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[3-5]。然而，在某些疾病狀態(tài)下，如急性心肌梗死、炎性反應(yīng)、高血壓等，心臟組織內(nèi)兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)及某些促炎性因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)水平異?？梢詫?dǎo)致心臟內(nèi)靜止?fàn)顟B(tài)的心臟成纖維細(xì)胞激活，使成纖維細(xì)胞的生物學(xué)性狀發(fā)生顯著改變[6-8]。在這種情況下，心臟內(nèi)成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞之間的生理平衡勢(shì)必發(fā)生改變。外泌體是一種直徑為30～150 nm 的微小囊泡狀結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞間的信號(hào)傳遞中發(fā)揮著重要的作用[9-10]。本研究擬通過(guò)小鼠動(dòng)物模型，研究成纖維細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)主動(dòng)脈縮窄（TAC）后心臟重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

小動(dòng)物呼吸機(jī)（DW-2000 型）購(gòu)自中國(guó)上海偉業(yè)醫(yī)療公司；雷卡倒置熒光顯微鏡、小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)購(gòu)自美國(guó) Leica 公司；小鼠源抗肌動(dòng)蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；鬼筆環(huán)肽、外泌體細(xì)胞標(biāo)記熒光染料PKH67 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；AlexaFluor 594 標(biāo)記的驢抗小鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Life Technologies 公司。

1.2 原代細(xì)胞獲取

將出生1～3 d C57 乳鼠的心臟組織剪成1 mm3的組織塊，在37 ℃雜交爐中利用混合酶液（2.5%不含EDTA 的胰酶、0.1%Ⅳ型膠原酶、0.05%DNA 酶混合）消化組織塊，利用血清中和酶液，直至組織塊消失，收集消化液，離心、重懸、鋪板，利用成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞不同的貼壁時(shí)間，將兩者分開(kāi)。

將體外心肌細(xì)胞按處理方式不同分為3 組，即正常組、PBS 組及外泌體組。外泌體組以促炎性因子TGF-β（10 ng/mL）刺激原代心臟成纖維細(xì)胞48 h，將提取出來(lái)的外泌體（1 μg/mL）與心肌細(xì)胞體外孵育48 h。PBS 組加入等體積PBS 溶液。正常組不做特殊處理，正常培養(yǎng)。

1.3 外泌體提取、預(yù)處理與鑒定

外泌體提?。盒募〕衫w維細(xì)胞體外培養(yǎng)至P2 代，TGF-β（10 ng/mL）刺激原代心臟成纖維細(xì)胞48 h，收集培養(yǎng)基，3 000 g 離心20 min，收集上清，100 000 g 離心70 min，收集下層沉淀，加入15 mL PBS 重懸，100 000 g 離心1 h，棄上清，收集所得的沉淀即為外泌體。用400 μL PBS 重懸后，－80 ℃保存。

外泌體熒光標(biāo)記處理：將新鮮提取的外泌體與PKH67 預(yù)混，體積比為1 000 ∶1，孵育1 h 后，加入15 mL PBS 重懸，100 000 g 離心20 min，棄上清，再次加入15 mL PBS，重復(fù)100 000 g 離心20 min，以去除多余染料。

外泌體鑒定：（1）電鏡檢查。將超高速離心獲得的外泌體6 μL 滴至300 nm 的銅網(wǎng)上，而后加入8 μL 2%醋酸雙氧鈾，靜置3 min，通過(guò)投射電鏡觀察外泌體形態(tài)及粒徑大小。（2）外泌體表面蛋白標(biāo)志物檢測(cè)。Western blot 檢測(cè)外泌體所特有的分子標(biāo)記物TSG101、CD63。

1.4 免疫熒光染色

將心肌細(xì)胞接種在共聚焦培養(yǎng)皿中，體外培養(yǎng)24 h 后，按1.2 處理各組細(xì)胞，細(xì)胞干預(yù)處理后以4 %多聚甲醛固定，0.3%Triton X-100 通透10～15 min，封閉后加入小鼠源抗肌動(dòng)蛋白抗體4 ℃孵育過(guò)夜，AlexaFluor594 標(biāo)記的驢抗小鼠二抗室溫孵育2 h，DIPA 標(biāo)記細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察，拍照留存，并利用ImageJ 軟件計(jì)算心肌細(xì)胞表面積。

鬼筆環(huán)肽（phalloidin）染色：將心肌細(xì)胞接種在共聚焦培養(yǎng)皿中，體外培養(yǎng)或者外泌體干預(yù)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后，4 %多聚甲醛固定，PBS 清洗，加入鬼筆環(huán)肽（1 ∶10 000 稀釋?zhuān)?，室溫孵?0 min，去除上清，加入DIPA 標(biāo)記細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

利用Trizol 試劑提取心肌細(xì)胞RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物見(jiàn)表1，實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃，1 min；55 ℃，1 min；72 ℃，1 min；72 ℃，6 min；連續(xù)進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。利用2-ΔΔCT法計(jì)算心房利鈉肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）和β 肌球蛋白重鏈（β-MHC）mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 PCR引物序列

1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康成年雄性C57 小鼠32 只，1 周齡，體質(zhì)量22～25 g，由上海市第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、假手術(shù)組、TAC-對(duì)照組及TAC-外泌體組，每組8 只。

TAC 組小鼠進(jìn)行TAC 模型構(gòu)建。取C57 小鼠，術(shù)前常規(guī)脫毛、禁食、禁水，異氟烷氣體麻醉，氣管插管。設(shè)置呼吸機(jī)參數(shù)，潮氣量為200 μL/次，呼吸頻率為110 次/min。在腋前線(xiàn)距離胸骨左緣2 mm 處切口，鈍性分離皮下筋膜，撥開(kāi)胸腺及肺組織，用手術(shù)鑷取6.0 手術(shù)線(xiàn)從無(wú)名和左頸總動(dòng)脈之間穿過(guò)胸主動(dòng)脈，連同8 G 針頭一起固定于主動(dòng)脈弓，再此基礎(chǔ)上撤走針頭，以保證主動(dòng)脈的縮窄程度同針頭大小一致，關(guān)胸縫合。假手術(shù)組小鼠在異氟烷氣體麻醉、氣管插管、開(kāi)胸后，不進(jìn)行主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，而是直接關(guān)胸。TAC-外泌體組小鼠自手術(shù)第二天開(kāi)始，每日通過(guò)尾靜脈注射20 μg 外泌體，連續(xù)注射4 周；TAC-對(duì)照組則注射等體積PBS 溶液。

1.7 小鼠心臟超聲

術(shù)后8 周，禁飲、禁食12 h 后，利用小動(dòng)物心臟超聲儀評(píng)估各組小鼠心功能狀態(tài)。異氟烷麻醉狀態(tài)下，取胸骨旁左室長(zhǎng)軸及心尖四腔切面，連續(xù)記錄4 個(gè)心動(dòng)周期中小鼠左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）及左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）的平均值，并計(jì)算短軸縮短率（FS）及左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.8 組織切片麥胚凝集素染色

術(shù)后8 周，處死小鼠，取出心臟組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，予以麥胚凝集素（WGA)染色，利用熒光顯微鏡觀察各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心室肥厚程度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定

對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞激活后釋放的外泌體進(jìn)行鑒定。投射電鏡下成纖維細(xì)胞來(lái)源的微小囊泡呈杯口狀結(jié)構(gòu)，直徑在110 nm 左右，符合典型的外泌體結(jié)構(gòu)特征[11]。Western blot 結(jié)果顯示該微小囊泡狀結(jié)構(gòu)表面攜帶有外泌體形成的特異性分子標(biāo)記物CD63 及TSG101[12-13]，提示本研究中提取的心肌成纖維細(xì)胞上清液中的微小囊泡為外泌體。見(jiàn)圖1。

圖1 成纖維細(xì)胞來(lái)源外泌體的鑒定

2.2 肌成纖維細(xì)胞來(lái)源外泌體促進(jìn)心肌細(xì)胞病理性肥厚

用PKH67 綠色熒光對(duì)外泌體膜進(jìn)行標(biāo)記，Phalloidin 紅色熒光對(duì)原代心肌細(xì)胞膜進(jìn)行標(biāo)記，圖2A 示外泌體可以被心肌細(xì)胞吞噬。與正常組及PBS 組相比，外泌體組心肌細(xì)胞肥厚相關(guān)基因ANP、BNP、β-MHC的mRNA 表達(dá)水平及心肌細(xì)胞表面積均顯著增加（P均＜0.05）。見(jiàn)圖2B、表2。

表2 各組心肌細(xì)胞心肌肥厚相關(guān)指標(biāo)的mRNA表達(dá)水平及心肌細(xì)胞表面積比較

圖2 肌成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體促進(jìn)心肌細(xì)胞病理性肥厚

2.3 肌成纖維細(xì)胞來(lái)源外泌體促進(jìn)TAC術(shù)后小鼠心臟病理性重構(gòu)進(jìn)展

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟超聲及WGA 染色檢測(cè)結(jié)果顯示，TAC 手術(shù)8 周后，小鼠LVEF、FS 均顯著下降，LVESD、LVEDD 以及左心室心肌細(xì)胞表面積均顯著增加（P均＜0.05）。相對(duì)于TAC-對(duì)照組，TAC-外泌體組小鼠心功能進(jìn)一步惡化，表現(xiàn)為小鼠LVEF、FS 進(jìn)一步下降，以及LVESD、LVEDD、左心室心肌細(xì)胞表面積進(jìn)一步增加，見(jiàn)表3、圖3、圖4。

圖3 各組小鼠代表性超聲心動(dòng)圖

圖4 各組小鼠左心室麥胚凝集素染色情況（×200）

表3 各組小鼠心功能參數(shù)及左心室心肌細(xì)胞表面積比較

3 討論

研究表明，人體內(nèi)器官之間、細(xì)胞之間通過(guò)某些生物活性分子如激素、脂質(zhì)小分子、非編碼RNA 等，保持功能上的緊密聯(lián)系[14-18]。人體內(nèi)生物信號(hào)鏈的有效傳遞對(duì)于正常生理代謝功能的維持具有重要作用，多種疾病的發(fā)生，如甲狀腺功能亢進(jìn)性心肌病、肝腎綜合征、心腦綜合征等，也與內(nèi)信號(hào)傳遞的異常存在密切關(guān)系[19-21]。成纖維細(xì)胞是心臟內(nèi)含量最豐富的細(xì)胞類(lèi)型，正常情況下，成纖維細(xì)胞對(duì)于心肌細(xì)胞電信號(hào)與機(jī)械應(yīng)力的傳遞具有重要作用，可以通過(guò)旁分泌機(jī)制促進(jìn)心肌細(xì)胞形態(tài)及功能的維持[22-23]。然而，在某些疾病狀態(tài)下，尤其是在急性心肌梗死、風(fēng)濕性心臟病、高血壓等病理狀態(tài)下，心肌組織內(nèi)異常升高的促纖維化因子，如TGF-β、溶血磷脂酸（LPS）、TNF-α 等，可以導(dǎo)致靜止?fàn)顟B(tài)下的心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)為功能狀態(tài)活躍的肌成纖維細(xì)胞[24-26]。

外泌體是細(xì)胞信號(hào)傳遞的重要媒介，人體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞均可以通過(guò)釋放外泌體完成其在組織器官及細(xì)胞間的信號(hào)傳遞。鑒于細(xì)胞釋放的外泌體與細(xì)胞本身的功能狀態(tài)存在密切關(guān)系，本研究探討疾病模型中異常激活的成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)心肌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。利用TGF-β 誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞激活，并將激活狀態(tài)下成纖維細(xì)胞來(lái)源外泌體與心肌細(xì)胞共同孵育，結(jié)果顯示，外泌體干預(yù)后的心肌細(xì)胞表面積以及肥厚相關(guān)基因ANP、BNP和β-MHC的表達(dá)顯著升高，提示激活狀態(tài)下成纖維細(xì)胞來(lái)源外泌體可以顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞的病理性肥大。為進(jìn)一步明確肌成纖維細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)心肌細(xì)胞病理性肥厚的影響，本研究利用尾靜脈注射技術(shù)，對(duì)小鼠予以在體肌成纖維細(xì)胞來(lái)源外泌體干預(yù)，并通過(guò)心臟超聲、WGA 染色等技術(shù)，檢測(cè)肌成纖維細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)心肌肥厚的影響，結(jié)果顯示，激活狀態(tài)下成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體可使小鼠LVEF、FS 顯著降低，LVESD、LVEDD、心肌細(xì)胞表面積顯著增加，提示成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以顯著促進(jìn)TAC 模型小鼠心肌組織的病理性肥厚，加速其心功能惡化，這與之前的研究報(bào)道一致[22]。

外泌體是細(xì)胞膜凹陷形成的囊泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含多種生物活性物質(zhì)，如短肽、信使RNA、細(xì)胞膜受體蛋白等，尤以微小RNA（miRNA）含量最為豐富[27]。MiRNA 是一種小分子非編碼RNA，通過(guò)與mRNA 的3'UTR 結(jié)合，影響mRNA 穩(wěn)定性，進(jìn)而參與外泌體對(duì)細(xì)胞功能活性的調(diào)控[28-29]。由于miRNA 在外泌體內(nèi)的豐度遠(yuǎn)大于其他小分子物質(zhì)，我們推測(cè)miRNA 很可能是外泌體中介導(dǎo)心肌細(xì)胞病理性肥大的效應(yīng)分子。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)激活狀態(tài)下的成纖維細(xì)胞來(lái)源外泌體可以顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞的病理性肥大，加速心臟重構(gòu)，提示生物信號(hào)鏈對(duì)機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要性。本研究為延緩心臟病理性重構(gòu)提供了新的思路及潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。