陳凱 董靜 趙學飛

心肌梗死（心梗）是全球范圍內(nèi)心血管疾病患者死亡的主要原因之一[1]。心室重構(gòu)是發(fā)生于心梗急性期的一種代償機制，是導致左心室擴張和心力衰竭的主要原因[2-3]。減輕心梗后不良心室重構(gòu)是改善心?；颊哳A后的有效途徑。沉默信息調(diào)控因子1（Sirt1）是一種組蛋白去乙?；浮Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)，外周血中Sirt1 與心室重構(gòu)程度呈負相關(guān)[4]，提示Sirt1在預測和治療心肌梗死、延緩心室重構(gòu)等方面具有良好的應用前景。槲皮素（Que）是一種黃酮醇類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌、擴張冠狀動脈（冠脈）、增加冠脈血流量等生物活性，對癌癥、心血管疾病的防治具有重要價值。已有研究證實，Que 可通過上調(diào)Sirt1 的表達，降低心肌缺血再灌注微血管的通透性[5]。本研究旨在觀察Que 對心梗后心室重構(gòu)的影響及對Sirt1 的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF 級SD 雄性大鼠60 只，8 周齡，體質(zhì)量220～250 g。飼養(yǎng)于適宜環(huán)境，室溫（22±3）℃，濕度50%～70%，12 h/12 h 光/暗循環(huán)，標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水、進食。動物適應性飼養(yǎng)7 d 后用于實驗研究。Que（純度≥98%）購于上海阿拉丁生化科技公司；Sirt1 抑制劑EX527 購于上海源葉生物公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、Masson 三色染色試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)（TUNEL）凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司；兔抗Sirt1、胱天蛋白酶-3（caspase-3）、B 淋巴細胞瘤-2蛋白（Bcl-2）、B 淋巴細胞瘤-2 相關(guān)蛋白（Bax）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）、Beclin-1、p62 抗體，鼠抗β-actin 抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG 二抗，HRP 標記的山羊抗鼠IgG 二抗購于美國Abcam 公司；增強化學發(fā)光反應液購于北京中源合聚生物科技有限公司。

1.2 大鼠心梗模型建立及實驗分組

所有大鼠稱量并記錄體質(zhì)量，用1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，剪開大鼠頸部皮膚，分離氣管后行氣管插管，連接小動物呼吸機機械通氣，于大鼠左胸部皮膚后第4 肋間處橫切打開胸腔，暴露心臟，剪開心包，在肺動脈圓錐與左心耳交界下方2 mm 處用6-0 手術(shù)線穿線結(jié)扎左前降支，觀察大鼠左心室前壁心肌變蒼白，術(shù)后24 h 大鼠心電圖ST 段弓背向上抬高或T 波高聳表明心梗大鼠模型建立成功。將造模成功的大鼠隨機分為心梗組、Que 組、EX527 組、Que＋EX527 組，每組12 只。另取12 只大鼠設為假手術(shù)組，假手術(shù)組同上述操作，但只穿線不結(jié)扎左前降支。術(shù)后給予所有大鼠青霉素1 000 U 預防感染。

1.3 給藥方法

Que 組大鼠尾靜脈注射10 mg/kg Que，EX527組大鼠尾靜脈注射1 mg/kg EX527，Que＋EX527組大鼠尾靜脈注射10 mg/kg Que 和1 mg/kg EX527，心梗組和假手術(shù)組大鼠尾靜脈注射同等劑量的生理鹽水。每天1 次，連續(xù)給藥6 周。

1.4 大鼠血流動力學指標測定

末次給藥結(jié)束12 h 后，稱量大鼠體質(zhì)量，1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，分離左側(cè)頸總動脈，將內(nèi)徑約1 mm、充有肝素-生理鹽水的導管逆行插入左心室，連接四導生理記錄儀，穩(wěn)定20 min 后測量壓力曲線，計算左室內(nèi)壓最大上升速率（＋dp/dtmax）、左室內(nèi)壓最大下降速率（－dp/dtmax）、左室收縮壓（LVSP）和左室舒張末期壓力（LVEDP），同時測量計算平均動脈壓（MAP）。

1.5 標本采集和心臟質(zhì)量參數(shù)測定

血流動力學測定后，收集大鼠頸動脈血液樣本，3 000 g 離心10 min，分離并收集血清，儲存于－80 ℃冰箱中備用。采血結(jié)束后，經(jīng)插管向大鼠左心室推注10%氯化鉀溶液2～3 mL，使大鼠心臟停搏于舒張期，迅速打開胸腔取出心臟，用預冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱量心臟質(zhì)量；沿房室環(huán)剪去左右心房和右心室，稱量左心室（包括室間隔）質(zhì)量，計算心臟質(zhì)量指數(shù)（HMI）、左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）。HMI＝心臟質(zhì)量/體質(zhì)量，LVMI＝左心室質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.6 HE染色觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)學變化

大鼠左室心肌組織固定于4%多聚甲醛，常規(guī)處理后石蠟包埋，制成厚度為5 μm 的石蠟切片，根據(jù)HE 染色試劑盒說明書，用蘇木精和伊紅染液染色，光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)學變化。

1.7 Masson染色觀察大鼠心肌組織纖維化

取大鼠石蠟切片，脫蠟至水，用Weigert 氏鐵蘇木精染液染色10 min，鹽水酒精分化10 s，蒸餾水洗1 min，麗春紅酸性品紅染色5 min，2%冰醋酸水溶液浸洗、1%磷鉬酸水溶液分化3 min，苯胺藍復染5 min，依次水洗、脫水、二甲苯透明，封片后光學顯微鏡下觀察染色結(jié)果，其中心肌細胞被染成紅色，膠原纖維被染成藍色。

1.8 TUNEL染色檢測大鼠心肌細胞凋亡

取大鼠石蠟切片，脫蠟至水，加入蛋白酶K 溶液消化組織蛋白，磷酸緩沖液（PBS）漂洗后，加入TNUEL 反應液50 μL，37 ℃孵育60 min，加入抗熒光素抗體，DAB 顯色，隨后蘇木素復染，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，光鏡下凋亡細胞核呈綠色，正常細胞核呈藍色，計算細胞凋亡指數(shù)（AI），AI＝凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.9 Western blot法檢測大鼠心肌組織中Sirt1蛋白、凋亡蛋白及自噬蛋白表達

取大鼠左室心肌組織，加入蛋白裂解緩沖液裂解提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。取50 μg 蛋白上樣，用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，室溫下將膜與含5%脫脂奶粉的TBST 緩沖液混合封閉2 h，加入一抗（Sirt1、caspase-3、Bcl-2、Bax、LC3、Beclin-1、p62、β-actin） 稀釋液（1 ∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入HRP 標記的山羊抗兔IgG（1 ∶3 000）或山羊抗鼠IgG（1 ∶3 000）二抗，室溫下孵育2 h，增強化學發(fā)光反應液顯影，分析蛋白條帶圖。目的蛋白相對表達量＝目的蛋白條帶值/β-actin 條帶值。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Que改善大鼠心梗后血流動力學指標

與假手術(shù)組比較，心梗組大鼠±dp/dtmax、LVSP、MAP均顯著降低，LVEDP顯著升高（P均＜0.05）；與心梗組比較，Que 組大鼠±dp/dtmax、LVSP、MAP 均顯著升高，LVEDP 顯著降 低（P均＜0.05），EX527組大鼠±dp/dtmax、LVSP、MAP、LVEDP 均無顯著變化；與Que 組比 較，Que＋EX527組大鼠±dp/dtmax、LVSP、MAP 均顯著降低，LVEDP 顯著升高（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心梗后血流動力學指標比較（n＝10）

2.2 Que改善大鼠心梗后心臟質(zhì)量參數(shù)

與假手術(shù)組比較，心梗組大鼠HMI、LVMI 均顯著升高（P均＜0.05）；與心梗組比較，Que 組大鼠HMI、LVMI 均顯著降低（P均＜0.05），EX527組大鼠HMI、LVMI 均無顯著變化；與Que 組比較，Que＋EX527 組大鼠HMI、LVMI 均顯著升高（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心梗后心臟質(zhì)量參數(shù)比較（n＝10）

2.3 Que改善大鼠心梗后心肌組織病理形態(tài)學變化

假手術(shù)組大鼠心肌細胞排列整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，心肌纖維呈束狀排列，結(jié)構(gòu)均勻，細胞間質(zhì)無明顯水腫和結(jié)締組織增生；心梗組和EX527 組大鼠心肌細胞排列紊亂，大量變性壞死，細胞間隙增寬，心肌纖維斷裂，細胞間質(zhì)水腫充血，可見較多結(jié)締組織增生及炎性細胞浸潤；Que 組和Que＋EX527 組大鼠心肌細胞排列較為整齊，心肌纖維基本完整，部分心肌纖維斷裂，細胞間質(zhì)水腫減輕，結(jié)締增生組織減少，少量炎性細胞浸潤，心肌組織損傷明顯減輕，且Que 組大鼠心肌組織損傷改善較Que＋EX527 組明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠心梗后心肌組織病理形態(tài)學變化（HE染色，×400）

2.4 Que改善大鼠心梗后心肌組織纖維化

假手術(shù)組大鼠心肌細胞間質(zhì)有少量膠原纖維，膠原組織分布較少；心梗組和EX527 組大鼠心肌組織存在大量膠原纖維增生，心肌纖維化嚴重；Que組和Que＋EX527 組大鼠心肌組織膠原纖維增生減少，心肌纖維化改善，且Que 組大鼠心肌纖維化改善較Que＋EX527 組明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠心梗后心肌組織纖維化情況（Masson染色，×100）

2.5 Que抑制大鼠心梗后心肌組織細胞凋亡

與假手術(shù)組比較，心梗組大鼠心肌組織AI 及caspase-3、Bax 的蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P均＜0.05）；與心梗組比較，Que 組大鼠心肌組織AI 及caspase-3、Bax 的蛋白表達水平均顯著降低，Bcl-2 的蛋白表達水平顯著升高（P均＜0.05），EX527 組大鼠心肌組織AI 及caspase-3、Bax、Bcl-2 的蛋白表達水平均無顯著變化；與Que 組比較，Que＋EX527 組大鼠心肌組織AI 及caspase-3、Bax 的蛋白表達水平均顯著升高，Bcl-2 的蛋白表達水平顯著降低（P均＜0.05）。見圖3、圖4、表3。

圖3 各組大鼠心梗后心肌組織細胞TUNEL染色情況

表3 各組大鼠心梗后心肌組織細胞凋亡指數(shù)及凋亡蛋白表達水平比較（n＝10）

圖4 各組大鼠心梗后心肌組織細胞凋亡蛋白表達情況

2.6 Que上調(diào)大鼠心梗后心肌組織中Sirt1蛋白表達并調(diào)控自噬蛋白表達

與假手術(shù)組比較，心梗組大鼠心肌組織Sirt1 的蛋白表達水平，自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的蛋白表達水平均顯著下調(diào)，p62 的蛋白表達水平顯著上調(diào)（P均＜0.05）；與心梗組比較，Que 組大鼠心肌組織Sirt1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 的蛋白表達水平均顯著上調(diào)，p62 的蛋白表達水平顯著下調(diào)（P均＜0.05），EX527 組大鼠心肌組織Sirt1 蛋白和自噬蛋白的表達水平均無顯著變化；與Que 組比較，Que＋EX527 組大鼠心肌組織Sirt1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 的蛋白表達水平均顯著上調(diào)，p62的蛋白表達水平顯著下調(diào)（P均＜0.05）。見圖5、表4。

表4 各組大鼠心梗后心肌組織Sirt1蛋白及自噬蛋白表達水平比較（n＝10）

圖5 各組大鼠心梗后心肌組織Sirt1蛋白及自噬蛋白表達情況

3 討論

心室重構(gòu)是心梗后心力衰竭進展的決定性因素，在缺血性損傷的過程中，缺血心肌和遠處非梗死心肌發(fā)生進行性左心室重構(gòu)，包括心肌細胞凋亡、肥大和纖維化等，使得心室功能持續(xù)下降，嚴重影響患者心功能[6-7]。本研究結(jié)果顯示，心梗后大鼠左心收縮和舒張功能明顯受損，表現(xiàn)為心梗組大鼠±dp/dtmax、LVSP、MAP 明顯下降，LVEDP 明顯升高，這與文獻報道結(jié)果一致[8]。Que 作為一種具有廣泛生物活性的天然化合物，被證實在心肌缺血再灌注損傷和心肌梗死等多種心血管疾病中對心肌細胞具有保護作用[9-10]。在本研究中，Que 可以有效改善心梗后左心室收縮和舒張功能，還能夠減輕心梗大鼠左心室重構(gòu)和心肌組織病理損傷，這對于改善心梗后不良預后具有重要意義。

心梗引起心肌組織損傷后，心肌細胞外基質(zhì)增生，誘導心肌纖維化發(fā)生，而心肌纖維化可加重心室重構(gòu)，降低心臟順應性，增加心源性猝死風險[11-12]。相關(guān)研究報道，血管緊張素受體奈普利蛋白酶抑制劑 LCZ696 通過減少心肌纖維化，減輕心梗后的心臟重構(gòu)和功能障礙[13]，提示改善心肌纖維化有助于減輕心梗后心室重構(gòu)。本實驗顯示，心梗大鼠心肌組織存在大量膠原纖維增生，經(jīng)過Que 干預后，心梗大鼠心肌組織膠原纖維增生明顯減少，表明Que 能夠有效抑制心肌纖維化，這與既往研究結(jié)果一致[14]。

心肌細胞凋亡是心梗后心室重構(gòu)的重要機制之一，抑制心肌細胞凋亡可以減輕心室重構(gòu)，改善心功能。Hou 等[15]報道，心肌細胞二甲基精氨酸二甲胺水解酶1 通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化應激水平和細胞凋亡，減輕心梗后左心室重構(gòu)。Wang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，過表達精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶4 可促進心肌細胞凋亡，加重心梗后的心室重構(gòu)。上述結(jié)果均提示心肌細胞凋亡與心梗后心室重構(gòu)關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示，心梗大鼠心肌組織存在大量細胞凋亡，AI 明顯升高，Que 干預顯著降低心梗大鼠心肌細胞凋亡，提示Que 可抑制心肌細胞凋亡。Li等[17]研究表明，Que 可以通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax 和caspase-3 的水平，抑制心肌細胞凋亡，進而發(fā)揮心肌保護作用。本研究進一步檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 和caspase-3 的表達，發(fā)現(xiàn)在心梗大鼠模型中，Que 可顯著下調(diào)caspase-3 和Bax 蛋白表達，顯著上調(diào)Bcl-2 蛋白表達，證實Que可通過調(diào)控凋亡蛋白表達，抑制心梗后大鼠心肌細胞凋亡，進而減輕心梗后心室重構(gòu)。

自噬是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的生理過程。多項研究表明，自噬激活可作為適應性機制，應對缺血性心臟病引起的心力衰竭[18-19]。Sciarretta 等[20]報道，海藻糖誘導的自噬激活可改善心梗后的心室重構(gòu)，提示自噬激活是減輕心室重構(gòu)和心功能障礙的有效策略。LC3 是自噬體形成的關(guān)鍵蛋白，有Ⅰ型和Ⅱ型之分，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值與自噬呈正相關(guān)；Beclin-1 被稱為自噬基因，主要作用是調(diào)節(jié)自噬過程；p62 是自噬選擇性底物，自噬-溶酶體通路可調(diào)控其降解，該降解過程是通過與LC3 相互作用實現(xiàn)的，p62 表達水平與自噬呈負相關(guān)[21]。本研究結(jié)果顯示，心梗大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 蛋白表達水平明顯下降，p62 蛋白表達水平明顯升高，而Que 能夠顯著上調(diào)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 的蛋白表達水平，顯著下調(diào)p62 的蛋白表達水平，提示Que 通過激活心梗大鼠心肌細胞自噬，改善心梗后的心室重構(gòu)。

Sirt1 作為一種去乙酰化酶，可通過調(diào)控相應蛋白的去乙?；?，在細胞代謝、細胞凋亡、自噬等生物學過程中發(fā)揮重要作用。Luo 等[22]研究報道，Sirt1 通過促進細胞自噬、抑制缺氧誘導的細胞凋亡保護心肌細胞免受缺氧應激的損傷。Pires 等[23]研究結(jié)果顯示，Sirt1 通過促進真核細胞延伸因子2激酶（eEF2K）/真核細胞延伸因子2（eEF2）依賴的自噬，保護心臟免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的損傷，表明Sirt1 通過調(diào)控自噬和細胞凋亡保護心肌組織。本研究結(jié)果顯示，Que 顯著上調(diào)心梗大鼠心肌組織中Sirt1 的表達水平，提示Que 可能通過調(diào)控Sirt1發(fā)揮心臟保護作用。因此，本研究采用Sirt1 抑制劑EX527 干預心梗大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EX527 顯著降低Que 對心梗大鼠心功能、左室重構(gòu)、心肌損傷、心肌纖維化及心肌細胞凋亡的改善作用，且顯著逆轉(zhuǎn)Que 對心梗大鼠心肌凋亡蛋白和自噬蛋白表達的調(diào)控作用，提示Que 可能是通過上調(diào)Sirt1，激活自噬，抑制凋亡，改善大鼠心梗后的心室重構(gòu)。

綜上所述，本研究證實Que 通過影響Sirt1 表達，調(diào)控自噬和抑制凋亡，改善心梗后的心室重構(gòu)，這為Que 治療心梗后心室重構(gòu)提供了依據(jù)。