李志樂 韋秋宇 言緯 劉燕 韋寶敏 黃照河

急性心肌梗死（AMI）是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┳畛Ｒ姷募蔽Ｖ匕Y[1-2]。再灌注治療是挽救AMI 患者的有效治療手段。但心肌缺血再灌注損傷（MIRI）嚴(yán)重影響患者的臨床預(yù)后。如何有效防治MIRI 是心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題。研究表明，AMI 患者體內(nèi)精氨酸嚴(yán)重不足，可導(dǎo)致機(jī)體功能及能量代謝紊亂，但是直接補(bǔ)充外源性精氨酸并不能使患者臨床獲益，甚至可能導(dǎo)致死亡率增加，其原因可能與精氨酸/瓜氨酸-一氧化氮循環(huán)中產(chǎn)生的一氧化氮（NO）效應(yīng)分子有關(guān)[3-5]。基于瓜氨酸可負(fù)反饋調(diào)節(jié)NO 生成并內(nèi)源性合成精氨酸的特點(diǎn)，本研究通過構(gòu)建MIRI 兔模型，探討L-瓜氨酸對MIRI 兔心肌的保護(hù)機(jī)制，為臨床MIRI 防治提供新的方向和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-瓜氨酸購自北京索萊寶科技有限責(zé)任公司，用超純水對L-瓜氨酸溶解稀釋，濃度為100 μg/L，置于4 ℃冰箱供實(shí)驗(yàn)使用。心肌酶譜類測定系列試劑盒購自德國ProDia GmbH 公司，2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色液購自上海博湖生物科技有限公司，原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）試劑購自英國Abcam 公司。7170 型全自動生化分析儀購自深圳市庫貝爾生物科技公司，ECG-2350 心電圖機(jī)購自日本光電公司，DMR＋550 型病理圖像分析儀購自德國Leica 公司，SAR-830 小型動物呼吸機(jī)購自北京世聯(lián)博研科技有限公司。

1.2 分組及處理方法

選取成年健康新西蘭大白兔30 只，清潔級，雄性，3 個(gè)月齡，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購自右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。本實(shí)驗(yàn)獲得右江民族醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組與實(shí)驗(yàn)組，各10 只。手術(shù)前禁食12 h，大白兔稱量體質(zhì)量后，予20%氨基甲酸乙酯耳緣靜脈注射麻醉，麻醉后仰位固定于手術(shù)操作臺上，ECG-2350 心電圖機(jī)連接于四肢，行氣管內(nèi)插管并連接SAR-830 小型動物呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)。常規(guī)備皮消毒，沿胸骨正中線依次切開皮膚、胸骨，撐開胸廓并固定，充分暴露心臟。參照文獻(xiàn)[6]，采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支30 min，再灌注2 h 的方法構(gòu)建在體兔MIRI 模型，實(shí)驗(yàn)組在構(gòu)建兔MIRI 模型前1 h 予經(jīng)股靜脈注射L-瓜氨酸100 μg/L 預(yù)處理；模型組給予經(jīng)股靜脈注射等量的生理鹽水。對照組只開胸不結(jié)扎。評估MIRI 模型成功的心電圖標(biāo)準(zhǔn)[7]：結(jié)扎左冠狀動脈前降支30 min 后，T 波高尖或ST 段明顯抬高；再灌注2 h后，T 波回落或已抬高的ST 段下降50%以上。

1.3 血清心肌酶檢測

再灌注實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別采集兔腹主動脈血2 mL，靜置30 min 后3 000 轉(zhuǎn)/min 離心15 min，分離血清備測。采用7170 型全自動生化分析儀檢測血清心肌酶包括肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）和乳酸脫氫酶（LDH）的水平。

1.4 心肌組織蘇木精-伊紅染色

再灌注實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分離取出兔心臟，用生理鹽水沖洗并分離左心室前壁心肌組織，置于10%緩沖甲醛液中固定24 h，石蠟包埋，心肌組織連續(xù)切片，厚度約為5 μm，常規(guī)進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。

1.5 TTC染色檢測心肌梗死面積

再灌注實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在分離的左心室前壁心肌組織中，選取左心室相同區(qū)域缺血與再灌注部位心肌組織制成2 mm 切片。在暗室避光操作，將切片置于2%TTC 染色液中，用錫箔紙蓋住后，置于37 ℃溫箱30 min，翻動切片，使之充分接觸染色液。切片晾干拍照，采用病理圖像分析儀評估心肌梗死面積。

1.6 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡

再灌注實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將獲取的心肌組織于10%緩沖甲醛液中固定，石蠟包埋，制成5 μm 切片，將切片置于染色缸中，予二甲苯脫蠟，不同濃度無水乙醇水化，PBS 漂洗2 次后加入蛋白酶K 溶液（20 μg/mL），置于室溫水解30 min。用含2%過氧化氫的PBS 漂洗2 次，置于室溫反應(yīng)5 min。按TUNEL 試劑盒說明書方法，在暗室避光操作，首先進(jìn)行生物素標(biāo)記，然后予DAB 顯色、蒸餾水沖洗、甲基綠復(fù)染、正丁醇沖洗、二甲苯脫水及中性樹膠封片。切片干燥后，每個(gè)切片選取10 個(gè)不同區(qū)域在光學(xué)顯微鏡（×400）下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，細(xì)胞染色呈棕色的為TUNEL 陽性細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較和組內(nèi)比較分別采用配對t檢驗(yàn)和單樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在體兔MIRI模型的評估

模型組兔左冠狀動脈前降支結(jié)扎30 min 后，心電圖顯示ST 段明顯抬高，伴有T 波增高，表現(xiàn)為ST-T 改變；再灌注2 h 后，ST 段和T 波較缺血時(shí)明顯下降或回落，但較缺血前仍有明顯增高（P＜0.05），表明在體兔MIRI 模型構(gòu)建成功。見圖1 和表1。

圖1 模型組兔心肌缺血再灌注前后心電圖的演變

表1 模型組兔心肌缺血再灌注前后心電圖的變化

2.2 L-瓜氨酸對MIRI兔心肌酶指標(biāo)的影響

與對照組相比，模型組和實(shí)驗(yàn)組兔血清中CK、CK-MB 及LDH 的水平均明顯升高（P均＜0.05）。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組兔血清中CK、CK-MB 及LDH 的水平均顯著下降（P均＜0.05），提示L-瓜氨酸可明顯減輕兔MIRI 導(dǎo)致的急性心肌損傷。見表2。

表2 3組兔血清中CK、CK-MB及LDH水平比較

2.3 L-瓜氨酸對MIRI兔心肌組織病理改變的影響

HE 染色結(jié)果顯示，對照組兔心肌組織結(jié)構(gòu)層次完整清晰，細(xì)胞排列整齊有序，細(xì)胞核清晰可見，染色濃淡均勻一致。模型組兔心肌組織結(jié)構(gòu)層次欠完整清晰，纖維細(xì)胞和肌節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂，可見纖維斷裂現(xiàn)象，細(xì)胞核固縮，染色顏色變深，細(xì)胞間紅細(xì)胞滲出，可見較多空泡。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組兔心肌組織結(jié)構(gòu)層次較為規(guī)則，可見心肌纖維水腫減輕，細(xì)胞核染色均勻，胞漿濃染減輕，細(xì)胞間紅細(xì)胞滲出減少，提示L-瓜氨酸可改善MIRI 導(dǎo)致的兔心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化。見圖2。

圖2 3組兔心肌組織病理形態(tài)學(xué)結(jié)果（HE染色，×400）

2.4 L-瓜氨酸對MIRI兔心肌梗死面積的影響

采用TTC 染色檢測心肌梗死面積，結(jié)果顯示對照組兔心肌未見梗死灶，模型組心肌梗死面積[（78.02±5.66）%]明顯高于對照組[（5.01±0.32）%]，實(shí)驗(yàn)組心肌梗死面積[（36.24±3.78）%]顯著低于模型組（P均＜0.05），提示L-瓜氨酸能夠明顯減少M(fèi)IRI 所致的兔心肌梗死面積。見圖3。

圖3 3組兔心臟大體和切片TTC染色結(jié)果

2.5 L-瓜氨酸對MIRI兔心肌細(xì)胞凋亡的影響

采用TUNEL 法檢測心肌細(xì)胞凋亡的情況，褐黑區(qū)為凋亡細(xì)胞。結(jié)果顯示對照組兔心肌細(xì)胞凋亡率為（4.05±0.32）%，模型組兔心肌細(xì)胞凋亡率[（46.26±6.58）%]明顯高于對照組，實(shí)驗(yàn)組兔心肌細(xì)胞凋亡率[（28.42±3.52）%]顯著低于模型組（P均＜0.05），提示L-瓜氨酸能夠減輕MIRI 導(dǎo)致的兔心肌細(xì)胞凋亡。見圖4。

圖4 3組兔心肌細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果（×400）

3 討論

AMI 是嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病，即使早期靜脈溶栓成功或通過介入術(shù)開通梗死相關(guān)血管，臨床上仍約有30%的患者發(fā)生MIRI[8-9]，加重不可逆的心肌細(xì)胞死亡，導(dǎo)致左室重構(gòu)，影響AMI患者的遠(yuǎn)期預(yù)后。目前MIRI 的形成機(jī)制尚不明確，與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞凋亡等因素密切相關(guān)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死或程序性死亡[10]，誘發(fā)再灌注心律失常、心肌頓抑、微血管栓塞及致死性心肌再灌注損傷等心血管不良事件，前兩者是可逆的，而后兩者不可逆[11]，研究成功構(gòu)建在體兔MIRI 模型，通過心肌組織病理分析發(fā)現(xiàn)，模型組兔心肌組織結(jié)構(gòu)層次欠完整清晰，纖維細(xì)胞和肌節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂，纖維斷裂，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞間紅細(xì)胞滲出，出現(xiàn)較多的空泡。CK、CK-MB、LDH 是臨床上最常用的心肌壞死標(biāo)志物，可作為反映MIRI 程度的檢測指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，模型組兔血清中CK、CK-MB、LDH 水平，心肌梗死面積，心肌細(xì)胞凋亡率均明顯高于對照組，提示MIRI 可加重心肌損傷，擴(kuò)大梗死面積，增加心肌凋亡，影響AMI 的臨床預(yù)后。臨床上針對MIRI的防治原則是有效縮短心肌缺血再灌注時(shí)間窗，降低心肌組織氧耗，藥物干預(yù)保護(hù)缺血心肌再灌注，緩解或防止再灌注損傷的發(fā)生[12-13]。然而，藥物防治MIRI 仍然未能達(dá)到理想效果，需進(jìn)一步探索開發(fā)新藥物。

近期研究發(fā)現(xiàn)AMI 患者體內(nèi)精氨酸嚴(yán)重不足，但直接補(bǔ)充外源性精氨酸不能使患者臨床獲益[3-5]。瓜氨酸作為L-α-氨基酸，具有擴(kuò)血管、降血壓等作用[14]，在心血管疾病治療領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。瓜氨酸可通過瓜氨酸-NO 循環(huán)，參與細(xì)胞內(nèi)精氨酸合成NO 并發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。機(jī)體內(nèi)NO 生成過多可介導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致MIRI 時(shí)心肌損傷或凋亡，而瓜氨酸對NO 有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，并參與內(nèi)源性精氨酸合成，可以有效補(bǔ)充AMI 患者體內(nèi)精氨酸，減輕MIRI 導(dǎo)致的心肌損傷或凋亡[5]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組兔血清中CK、CK-MB 及LDH 水平明顯低于模型組，提示L-瓜氨酸可減輕MIRI 導(dǎo)致的急性心肌損傷。通過心肌組織病理分析也發(fā)現(xiàn)，L-瓜氨酸對MIRI 兔心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其具體機(jī)制尚未明確，可能與以下幾方面有關(guān)：（1）抑制炎性反應(yīng)。MIRI 可誘發(fā)炎性反應(yīng)，而白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18 等炎性因子的活化和表達(dá)，可引起心肌損傷或凋亡[15]，導(dǎo)致MIRI 加重。L-瓜氨酸可明顯抑制機(jī)體內(nèi)促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并維持巨噬細(xì)胞的遷移[16-17]，從而抑制炎性反應(yīng)，減輕心肌凋亡，發(fā)揮對MIRI 兔心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。（2）減輕氧化應(yīng)激。MIRI 時(shí)心肌組織或細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），可影響線粒體功能，引起基因破壞甚至蛋白功能喪失，介導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的病理過程[18]，L-瓜氨酸可減少ROS 的產(chǎn)生[19]，減輕MIRI，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。生理?xiàng)l件下NO作為體內(nèi)重要的心血管內(nèi)皮舒張因子，可以有效防止體內(nèi)抗氧化劑的減少，減輕氧化應(yīng)激損傷。因此，L-瓜氨酸可能通過改善L-精氨酸/NO 途徑，負(fù)性調(diào)控NO 生成而減輕氧化應(yīng)激，從而改善MIRI[20]。

綜上所述，本研究提示補(bǔ)充L-瓜氨酸對兔MIRI 的保護(hù)作用與其抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，這可為瓜氨酸在MIRI 防治中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，L-瓜氨酸有望成為MIRI 藥物防治的潛在靶點(diǎn)。