程小燕 徐 猛 歐陽健明

(暨南大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，生物礦化與結(jié)石病防治研究所，廣州 510632)

0 引 言

腎結(jié)石是最常見的疾病之一，世界上大約有10%的人正遭受到腎結(jié)石帶來的痛苦[1]。腎結(jié)石形態(tài)的多種多樣與其化學(xué)成分密切相關(guān)。草酸鈣(CaC2O4)是腎結(jié)石的主要成分，其中一水草酸鈣(COM)的發(fā)生率是二水草酸鈣(COD)的2倍左右[2]。CaC2O4結(jié)石可呈鹿角狀、不規(guī)則形和桑葚樣。

CaC2O4腎結(jié)石的形成是一個與晶體成核、生長、聚集和黏附密切相關(guān)的復(fù)雜的生物調(diào)控過程，其形成機制至今尚未被完全闡明[3]。腎小管上皮細胞(REC)損傷是促進CaC2O4結(jié)石形成的一個重要誘因[4]，損傷的細胞不但為晶體成核提供了有效位點，而且增強了細胞膜與礦物微晶的黏附，加速腎結(jié)石形成。COM對腎小管上皮細胞的損傷大于COD。

尿液中的各種蛋白影響CaC2O4結(jié)石的形成[5]。尿液中不但存在帶負電荷的蛋白質(zhì)如Tamm-Horsfall蛋白、凝血酶原、人血清白蛋白、糖蛋白、骨橋蛋白等，還存在帶正電荷的蛋白如組織蛋白酶G、嗜酸性細胞陽離子蛋白和髓過氧化物酶前體等。腎結(jié)石的形成還與尿液中的微晶密切相關(guān)，尿液中的COM微晶有拉長六邊形、圓形、菱形和不規(guī)則形。由于個體的差異及飲食等生活習(xí)慣的差異，導(dǎo)致腎管液中結(jié)石鹽的過飽和度、pH和抑制劑濃度及生物大分子等存在差異；此外，尿微晶滯留在尿液中的時間不同，也會導(dǎo)致不同尺寸、不同晶相、不同形貌的尿微晶生成[6-7]。但目前這些不同性質(zhì)的晶體對腎小管上皮細胞的毒性差異仍不清楚。

生物大分子在生物晶體形成中具有指導(dǎo)作用。由于原位研究生物礦化過程存在一定的困難，人們常常采用模擬體系在體外模擬生物礦物的形成[8]。Chen等[9]利用明膠作為輔助模板合成了具有良好分散性的片狀ZSM-5沸石，體系中明膠濃度變化會影響明膠鏈的展開和體系pH的變化，從而影響晶體的形貌、尺寸等。晶體的生成與體系溫度、pH、攪拌速度、環(huán)境和剪切力等密切相關(guān)。根據(jù)經(jīng)典的Ostwald熟化理論，晶體形成的驅(qū)動力是粒子相總表面積的降低，即產(chǎn)生的總界面自由能的降低，由于小尺寸粒子比表面積(即吉布斯自由能)高于大尺寸粒子，因此小尺寸粒子在熟化過程中會向大粒子沉積[10]。Pitto等[11]研究了溫度對晶體生長的影響，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溫度越高，晶體越容易出現(xiàn)團簇，生長的速度也越快，尺寸越大。隨著溶液攪拌速度增加，顆粒發(fā)生旋轉(zhuǎn)，剪切力增大，溶質(zhì)均勻分布在顆粒周圍，會增加成核并抑制生長，獲得小尺寸的顆粒[12]。

晶體尺寸的不同會導(dǎo)致晶體聚集程度、與細胞的接觸面積、細胞毒性等發(fā)生變化。姚菊明等[13]通過控制反應(yīng)溶液的pH和運用水熱法、化學(xué)沉淀法合成了3種不同長徑比的納米磷酸鈣顆粒：長徑比約為6∶1的棒狀磷酸鈣、3∶1的梭狀磷酸鈣和球形磷酸鈣。實驗表明長徑比的差異會造成磷酸鈣顆粒比表面積、晶面化學(xué)組分及與細胞間接觸面積的不同，導(dǎo)致對蛋白質(zhì)的吸附存在差異，進而影響了與細胞的黏附和增殖。Tamura等[14]研究了不同尺寸Ti對嗜中性粒細胞的毒性差異，大尺寸的Ti顆粒(10、45和150 μm)對細胞損傷較小，也無法進入細胞，而2 μm的小尺寸Ti對細胞的損傷顯著增加，導(dǎo)致細胞超氧化物陰離子、乳酸脫氫酶(LDH)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)的表達量明顯增加。

為了探究尿液中不同尺寸、不同形貌尿微晶對腎結(jié)石形成的影響，我們合成4種具有不同長寬比的COM晶體，并比較研究了其對正常人腎近端上皮細胞(HK-2)的損傷能力差異，期望為進一步闡明腎結(jié)石形成機理、抑制腎結(jié)石形成提供新的啟示。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

明膠為生物試劑?？讖?.22 μm的有機系微孔濾膜購自上海興亞公司。胎牛血清、細胞培養(yǎng)基(DMEM/F-12)、胰酶均購自Gbico生化產(chǎn)品有限公司(北京)。CCK-8細胞活性檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒均購自凱基生物(Keygen)技術(shù)有限公司?；钚匝?ROS)檢測試劑盒、4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液、牛血清白蛋白(BSA)、4%多聚甲醛均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。其他常規(guī)試劑為分析純試劑，實驗用水為蒸餾水。

主要儀器有XL30型環(huán)境掃描電子顯微鏡(SEM，荷蘭Philips公司)、D/max2400X射線粉末衍射儀(XRD，日本理學(xué))、傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR，美國Nicolet公司)、Nano-ZS型納米粒度和ζ電位分析儀(英國Malvem公司)、Tristar 3000比表面積及孔隙度分析儀(美國Micromeritics公司)。

1.2 不同長寬比COM的合成

COM-1∶2：取8 g明膠加20 mL水，加熱至完全溶解，離心除去明膠中的雜質(zhì)，配成400 mL的明膠溶液(ρgelatin=20 mg·mL-1)。在 37 ℃下向上述明膠溶液中加入 20 mL 20 mmol·L-1的 K2C2O4溶液，并加入10 mL 0.5 mol·L-1的NaCl溶液維持離子強度。攪拌10 min，然后在快速攪拌(900 r·min-1)下加入 20 mL 20 mmol·L-1的 CaCl2溶液，繼續(xù)攪拌反應(yīng) 10 min，取出溶液于室溫中靜置過夜，離心分離得到下層晶體，用蒸餾水和無水乙醇各洗滌3次，于55℃的烘箱中干燥，得到晶體。

COM-1∶3：取2 g明膠，在55 ℃反應(yīng)5 min，攪拌速度600 r·min-1，其他同COM-1∶2合成。

COM-1∶4：取0.2 g明膠，在70 ℃反應(yīng)5 min，攪拌速度600 r·min-1，其他同COM-1∶2合成。

COM-1∶5：取0.2 g明膠，在75 ℃反應(yīng)5 min，攪拌速度300 r·min-1，其他同COM-1∶2合成。

1.3 合成晶體的SEM、XRD和FT-IR表征

SEM表征：將各尺寸的COM晶體分別分散在無水乙醇中，配成0.10 mg·mL-1的懸浮液，超聲5 min后，點樣在10 mm×10 mm的玻片上，真空干燥后噴金，在SEM下觀察。工作條件：電壓為5.00 kV，工作距離為5～10 nm，放大倍數(shù)為10 000。

XRD表征:取20 mg晶體放入測量XRD的專用凹槽中，用潔凈載玻片壓實后上機測試。測試條件：CuKα射線，石墨單色器，30 kV，25 mA，掃描范圍5°～60°，掃描速度8(°)·min-1。

FT-IR表征：稱取5 mg晶體和200 mg的KBr，在瑪瑙缽中研磨混勻，壓片后在紅外光譜儀上檢測。掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為0.5 cm-1。

1.4 晶體的N2吸附-脫附等溫線測定

先將各晶體在80℃進行脫氣預(yù)處理，然后在溫度77 K(-196℃)下進行吸附-脫附實驗，以高純N2為吸附質(zhì)。對脫氣前后晶體的XRD檢測表明，測試過程中COM晶體未發(fā)生晶相轉(zhuǎn)化或分解。樣品比表面積(SBET)采用BET(Brunauer-Emmet-Teller)方程計算。

1.5 培養(yǎng)液中各晶體ζ電位檢測

稱取各COM晶體分別分散在pH=7.3的培養(yǎng)液中，配成 0.10 mg·mL-1的溶液，超聲 5 min，在恒溫(25℃)下采用納米粒度和ζ電位分析儀檢測晶體的ζ電位。

1.6 細胞培養(yǎng)和晶體損傷前后的細胞活力檢測

HK-2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、CO2體積分數(shù)5%和飽和濕度下培養(yǎng)。細胞傳代采用胰蛋白酶消化法。當細胞達80%～90%融合后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入0.25%胰酶-EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中3～5 min，在倒置顯微鏡下觀察消化程度。消化適度后，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，充分吹打分散細胞，形成單細胞懸液。

將上述單細胞懸液按濃度為1.0×105mL-1、每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板孵育24 h后，改用無血清的DMEM培養(yǎng)液孵育12 h，使細胞同步化，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞2次。將實驗?zāi)Ｐ头譃?組：(A)對照組，只加入無血清培養(yǎng)液；(B)COM晶體處理組，分別加入長寬比為 1∶2、1∶3、1∶4和1∶5的COM晶體(200 μg·mL-1，用無血清培養(yǎng)液配制)。每個實驗重復(fù)3孔。孵育6 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，孵育4 h，用酶標儀在450 nm處測量吸光度(A)，求得3個復(fù)孔A值的平均值。細胞活力(cell viability)用以下公式計算：Rcell=At/Ac×100%，其中Rcell表示活細胞率，即細胞活力；At為晶體處理組的吸光度；Ac為對照組的吸光度。

1.7 透明質(zhì)酸(HA)表達檢測及HA熒光強度的定量分析

細胞按濃度1.0×105mL-1、每孔1 mL接種于12孔培養(yǎng)板。待細胞同步化后，將細胞按1.6節(jié)所述分組。孵育6 h后吸除上清液，用PBS洗滌細胞2次，加入固定液(由5%冰醋酸、10%福爾馬林和70%酒精組成)固定細胞20 min，用PBS洗滌細胞3次。再加入100 μL 5 μg·mL-1的bHABP溶液(用3%牛血清白蛋白溶液配制，現(xiàn)用現(xiàn)配)，4℃條件下孵育過夜。用PBS洗滌細胞3次，每次5 min。再加入100 μL FITC-avidin(異硫氰酸熒光素-親和素)孵育細胞1 h，用PBS洗滌細胞3次。加入DAPI染色液復(fù)染4 min，PBS洗滌細胞后用抗淬滅劑封片，于共聚焦顯微鏡下觀察。

HA定量分析：HA的熒光強度根據(jù)儀器附帶的Axiovision軟件(ZEISS，德國)確定，每個樣品對100個細胞的HA進行定量檢測，取平均值。

1.8 熒光顯微鏡觀察晶體損傷前后細胞中ROS水平

細胞分組同上。到達作用時間后，吸除上清液，用 2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)在37℃染色30 min，用PBS清洗3次以去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，在熒光顯微鏡下觀察。

1.9 流式細胞儀檢測細胞凋亡和壞死

細胞分組同上。用0.25%胰酶消化后加入10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液使細胞懸浮，然后離心(1 000 r·min-1，5 min)，吸除上清液后用PBS洗滌2遍，重新離心得到細胞沉淀。加入200 μL PBS重懸，1 000 r·min-1離心5 min后棄去上清液。加入200 μL binding緩沖溶液混勻，加 5 μL Annexin VFITC在室溫避光條件下孵育10 min，離心(1 000 r·min-1)5 min后棄去上清液；加入200 μL binding緩沖溶液混勻，再加5 μL PI后采用流式細胞儀進行檢測。

1.10 細胞表面黏附晶體的SEM觀察

細胞分組同上。達到黏附時間后，吸除上清液，用PBS洗滌3次，加入2.5%的戊二醛，于4℃固定細胞24 h后再用1% OsO4溶液固定，接著用PBS洗滌3次，梯度乙醇(30%、50%、70%、90%和100%)脫水，最后用乙酸異戊酯固定后馬上采用CO2臨界干燥，噴金包被。在SEM下觀察晶體的黏附情況。

2 結(jié) 果

2.1 不同長寬比拉長六邊形COM晶體的合成

通過改變反應(yīng)溫度、攪拌速度和控制添加劑的比例(表1)，得到了長寬比分別為1∶2、1∶3、1∶4和1∶5的COM晶體(圖1)，依次命名為COM-1∶2、COM-1∶3、COM-1∶4和 COM-1∶5。晶體的長度分別為(3±0.3)μm、(5.2±0.3)μm、(7.0±0.7)μm和(8.8±1.2)μm，但晶體寬度相近。隨著晶體尺寸增大，晶體(101)面被拉長，長寬比也由1∶2增大到約1∶3、1∶4和1∶5(圖2)。

表1 不同長寬比COM晶體的合成條件及其部分理化性質(zhì)Table 1 Synthesis conditions and some physical and chemical properties of COM crystals with different aspect ratiosa

圖1 不同長寬比六邊形COM晶體SEM照片F(xiàn)ig.1 SEM images of hexagonal COM crystals with different aspect ratios

圖2 不同長寬比COM晶體的示意圖Fig.2 Schematic diagram of COM with different aspect ratios

影響COM晶體尺寸和長寬比的因素包括：

(1)反應(yīng)溫度。反應(yīng)溫度越高，生成的晶體越長。合成COM-1∶2、COM-1∶3、COM-1∶4和COM-1∶5的反應(yīng)溫度依次為37、55、70和75℃，當溫度升高時，晶體的成核速率下降，生長速率增加[11]，從而導(dǎo)致晶體數(shù)量減少，晶體的尺寸增加。

(2)攪拌速度。攪拌速度越大，生成的晶體尺寸越小。合成上述4個晶體的攪拌速度分別為900、600、600和300 r·min-1，攪拌速度增加后，成核速率增大[12]，形成的晶核數(shù)量增加，晶體尺寸減小。

(3)添加劑明膠的影響[9]。隨著明膠質(zhì)量濃度減小，COM被拉長，晶體的長寬比由1∶2增大至1∶5。線狀大分子明膠是膠原蛋白的降解產(chǎn)物，其主鏈由不同氨基酸通過肽鍵鏈接而成，側(cè)鏈含有大量—OH、—NH2和—COOH等極性基團，明膠分子形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以有效構(gòu)建仿生環(huán)境下生物晶體的合成[8]。在COM合成過程中，明膠先通過其—COOH與Ca2+配位，再與晶體表面暴露的草酸根形成“鈣橋”(圖3B)，完成在初始晶核表面的吸附過程。COM不同晶面的C2O42-密度大小為(101)(5.42 nm-2)＞(120)(4.29 nm-2)＞(010)(3.30 nm-2)[15]，因此，明膠主要結(jié)合在C2O42-密度高的(101)和(120)晶面，從而抑制其(101)晶面沿著[100]方向生長和(120)晶面沿著[120]方向生長[16]。當明膠質(zhì)量濃度較高(20 mg·mL-1)時，抑制作用較為明顯，導(dǎo)致COM晶體變薄，長寬比較小，形貌為薄的平板狀六邊形(圖3C)。當明膠質(zhì)量濃度降低至0.5 mg·mL-1時，對COM晶體沿著這2個方向的抑制作用減小，(120)晶面沿著[120]方向生長，(101)面沿著[001]方向逐漸被拉長，棱角變得尖銳，形貌演變?yōu)槔L的六邊形(圖3D)。

圖3 不同長寬比COM晶體生長示意圖:(A)COM晶核;(B)吸附在COM特定晶面的明膠分子;(C)六邊形COM;(D)拉長六邊形COMFig.3 Schematic diagram of crystal growth of COM with different aspect ratios:(A)COM crystal nuclei;(B)gelatin molecules adsorbed on specific crystal planes of COM;(C)hexagonal COM;(D)elongated hexagonal COM

2.2 COM晶體的XRD和FT-IR表征

圖4A為制備的不同長寬比COM晶體的XRD圖。主要檢測到的衍射峰的晶面間距d=0.593、0.365、0.296、0.235和0.197 nm，分別歸屬于COM的(101)、(020)、(202)、(130)和(303)晶面(PDFNo.20-231)[17]。這些XRD圖均沒有除COM晶體以外的雜峰。

圖4 四種不同長寬比COM晶體的(A)XRD圖和(B)FT-IR譜圖:(a)COM-1∶2;(b)COM-1∶3;(c)COM-1∶4;(d)COM-1∶5Fig.4 (A)XRD patterns and(B)FT-IR spectra of four COM crystals with different aspect ratios:(a)COM-1∶2;(b)COM-1∶3;(c)COM-1∶4;(d)COM-1∶5

隨著晶體長寬比增加，COM的(101)和(010)晶面強度比值(I101/I010)逐漸減小(表1)。其原因可能是隨著晶體尺寸的增大，晶體的厚度逐漸增加，(010)晶面增大。從圖2亦可以看出，COM-1∶2晶體較薄，(010)晶面所占的面積比例也較??；而COM-1∶4和COM-1∶5晶體變厚，(010)晶面所占的面積比例增加。根據(jù)晶體生長的擇優(yōu)取向性[18]，晶體沿著[100]方向生長趨勢增強，(010)晶面變大(圖2d)，即I101/I010也逐漸減小。

圖4B為不同長寬比COM的FT-IR譜圖，4種COM均呈現(xiàn)典型的COM特征吸收峰[5]。各晶體在3 047～3 485 cm-1區(qū)間有5個小峰，歸屬于COM結(jié)晶水中O—H振動。COM中的羧基(COO-)不對稱伸縮振動(νas)和對稱伸縮振動(νs)分別在 1 620 和 1 319 cm-1附近。在指紋區(qū)，COM晶體的吸收帶出現(xiàn)在780、661和514 cm-1左右。

XRD和FT-IR分析結(jié)果表明，所合成的草酸鈣均為單一的COM晶體。

2.3 不同長寬比COM的比表面積

圖5為各COM晶體對N2的吸附-脫附等溫線。這些曲線在高壓部分(p/p0＞0.85)僅有1.5～6.0 cm3·g-1的略微突跳，說明這些COM晶體是無孔材料。因為這種突跳通常是顆粒間堆積產(chǎn)生的間隙所致，而非材料中存在的介孔(2～50 nm)結(jié)構(gòu)所貢獻。SEM圖像(圖1)也表明各COM不存在大的介孔。經(jīng)計算，各COM晶體的比表面積為2～5 m2·g-1，如此低的比表面積亦說明COM晶體是一種無孔材料，即比表面積主要是由晶體外表面所貢獻。晶體尺寸越大，晶體的比表面積越小(表1)。例如，COM-1∶2的比表面積是5 m2·g-1，而COM-1∶5減小至2 m2·g-1。

2.4 不同長寬比COM在培養(yǎng)基中的ζ電位

分散在培養(yǎng)液中的各晶體的ζ電位值均是負值(-9.93～-16.2 mV，表1)，且隨著晶體長寬比的增加，ζ電位的絕對值不斷增大，這有利于抑制晶體在溶液中的聚集。其原因是：晶體長寬比增加后，其帶正電荷的(101)晶面所占晶體表面積的百分比相對變小(表1中I101/I010值)，晶體表面吸附的培養(yǎng)液中帶負電荷的物質(zhì)(如氨基酸和蛋白質(zhì)等)減少，因此ζ電位絕對值變小。

2.5 不同長寬比COM對HK-2活力和HA表達量的影響

采用CCK-8法檢測了各COM晶體對HK-2的氧化性損傷。如圖6A所示，相比于對照組，COM-1∶2對細胞的損傷最為明顯，造成了HK-2約80.1%的損傷。各COM晶體對HK-2損傷大小依次為COM-1∶2＞COM-1∶3＞COM-1∶4＞COM-1∶5。

圖6 不同長寬比COM引起的HK-2活力變化和細胞表面HA表達量變化:(A)細胞活力;(B)對HA的熒光顯微鏡觀察;(C)HA表達量柱狀圖Fig.6 Changes of cell viability and HA expression on HK-2 surface caused by COM with different aspect ratios:(A)cell viability;(B)fluorescence microscope observation;(C)histogram of HA expression

HA是腎上皮細胞膜表面的主要黏附分子之一，在細胞受到損傷時將上調(diào)HA的量。相比于對照組，各COM均導(dǎo)致了HA表達量的增加(圖6B中綠色)，且COM-1∶2引起的HA表達最強，COM-1∶5最弱(圖6C)。

2.6 不同長寬比COM對ROS水平的影響

ROS能夠迅速與細胞內(nèi)大分子反應(yīng)，導(dǎo)致正常細胞功能損害，最終導(dǎo)致細胞死亡。這種氧化損傷的細胞能夠促進草酸鈣晶體在腎臟部位的沉積[19]。圖7A為采用DCFH-DA熒光探針測量的不同長寬比COM晶體誘導(dǎo)HK-2細胞產(chǎn)生的ROS情況?？梢钥闯?，各組細胞的ROS熒光強度為COM-1∶2＞COM-1∶3＞COM-1∶4＞COM-1∶5＞對照組，即COM-1∶2表現(xiàn)出更高的細胞損傷，引起了更多的ROS產(chǎn)生。

圖7 不同長寬比COM引起的HK-2的ROS水平、細胞凋亡和壞死變化:(A)ROS水平;(B)Annexin V/PI雙染法定量檢測細胞凋亡和壞死的散點圖;(C)總的死細胞(Q1+Q2+Q4)比例(rt)Fig.7 Changes in ROS expression,apoptosis and necrosis induced by COM crystals with different aspect ratios:(A)ROS on HK-2 surface;(B)dot plots of cellular apoptosis and necrosis detected quantitatively by annexin V/PI double staining;(C)ratio of total dead cells(Q1+Q2+Q4)(rt)

2.7 流式細胞儀檢測細胞的凋亡和壞死

采用Annexin V/PI雙染法并通過流式細胞術(shù)對凋亡和壞死細胞進行了定量檢測(圖7B)。對照組總的死細胞(Q1+Q2+Q4)比例為1.7%。而COM-1∶2、COM-1∶3、COM-1∶4和COM-1∶5與細胞作用6 h后，分別導(dǎo)致了19.4%、18.4%、15.9%和11.1%的細胞死亡(圖7C)。

2.8 不同長寬比COM與HK-2黏附的SEM觀察

圖8為不同長寬比COM與正常HK-2孵育6 h后的SEM觀察結(jié)果。在細胞表面特別是細胞的邊側(cè)黏附有COM晶體。由于細胞與晶體之間存在相互作用，細胞表面晶體的形狀與初始晶體(圖1)存在一定的差異，但晶體的長度變化不大。

圖8 HK-2與不同長寬比COM晶體黏附后的SEM圖像Fig.8 SEM images of HK-2 adhered to COM crystals with different aspect ratios

從圖8可以看出，受到COM晶體損傷的細胞明顯收縮，表面變得粗糙，有顆粒狀物質(zhì)出現(xiàn)，歸因于細胞中的蛋白質(zhì)、脂類和糖等物質(zhì)附著。相比之下，沒有黏附晶體的對照組細胞表面光滑平整。部分COM晶體與細胞黏附后存在聚集現(xiàn)象，這是由于被晶體損傷后的細胞表達的帶負電荷的黏附分子不但能夠促進晶體黏附，而且還促進晶體的聚集。

3 討 論

3.1 不同尺寸COM晶體對HK-2的損傷模型

不同長寬比COM對HK-2產(chǎn)生損傷作用的機理：當處在培養(yǎng)液中的COM晶體與HK-2作用時，會引起細胞皺縮、細胞核變小(圖8)、細胞膜和溶酶體破裂；COM晶體引起NADPH氧化酶的激活，進而誘發(fā)·O2-產(chǎn)生，·O2-的過量產(chǎn)生可以造成線粒體的功能紊亂甚至衰竭、線粒體膜電位下降，引起ROS的生成(圖7A)；而ROS可以介導(dǎo)一系列炎癥的發(fā)生，激活許多信號分子如p38細胞分裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)、蛋白N-末端激酶(JNK)和轉(zhuǎn)錄因子NF-кB等[20]。一系列的級聯(lián)反應(yīng)最終使得細胞功能受損，引起細胞的壞死性死亡以及部分凋亡性死亡(圖7B)。在細胞凋亡和壞死的過程中，會引起細胞表面黏附分子如HA(圖6B)和骨橋蛋白(OPN)的表達升高，磷脂酰絲氨酸(PS)外翻，以及細胞表面脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA產(chǎn)生。HA、OPN表達量升高后，又進一步增加了細胞對晶體的黏附，加重細胞的損傷。ROS水平和HA表達量均與細胞的損傷程度呈正相關(guān)。我們以前的研究[21]表明，微/納米COM可以導(dǎo)致不同亞細胞結(jié)構(gòu)的損傷，且發(fā)生明顯損傷變化的時間順序為細胞膜損傷(1 h)＜線粒體膜電位下降(3～6 h)≈細胞周期滯留(3～6 h)＜細胞凋亡(12 h)，其中尺寸小的晶體導(dǎo)致細胞器的損傷更快，這歸因于尺寸越小的晶體越容易通過內(nèi)化作用進入細胞內(nèi)。

黏附于細胞表面的晶體會與細胞相互作用，導(dǎo)致晶體形貌發(fā)生改變。首先，細胞表面表達的帶負電荷的黏附分子如OPN、HA(圖6B)和PS等可以與COM晶體富含Ca2+離子的(101)晶面作用，尤其是與COM晶體的棱和尖端暴露的Ca2+離子產(chǎn)生螯合作用；其次，細胞自身也可以通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的途徑或巨胞飲作用內(nèi)吞晶體[22]；最后，細胞損傷后會引起細胞膜的破裂，導(dǎo)致溶酶體中的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-7)、羧肽酶M、亮氨酸氨肽酶和堿性磷酸酶等釋放到細胞外，從而增加了對晶體的溶解，引起晶體的形態(tài)變化。Narula等[23]也觀察到在腎結(jié)石基質(zhì)蛋白存在下，COM晶體邊緣和表面的溶解很明顯，這種形態(tài)變化促進了晶體-細胞間的相互作用，增加了細胞對晶體的吸附、溶解及內(nèi)吞。

3.2 不同長寬比COM晶體對HK-2損傷存在差異的原因

從細胞活力(圖6A)、HA 表達量(圖6B)、ROS 數(shù)據(jù)(圖7A)和細胞死亡率(圖7B)可以看出，不同長寬比COM對HK-2的細胞毒性呈現(xiàn)的變化規(guī)律為COM-1∶2＞COM-1∶3＞COM-1∶4＞COM-1∶5＞對照組。造成這種差異是以下各因素的綜合影響：

(2)晶體尺寸。從圖1可以看出，各晶體尺寸大小為COM-1∶2＜COM-1∶3＜COM-1∶4＜COM-1∶5，尺寸越小的晶體，其比表面積越大(表1)，裸露在晶體表面的活性位點越多，與細胞間的相互作用越強，對細胞的損傷也越嚴重。

(3)晶體的比表面積。當晶體的質(zhì)量濃度相同時，小尺寸的晶體數(shù)量更多，擁有更大的表面積，即小尺寸COM晶體的表面裸露出更多的反應(yīng)活性位點，這些活性位點可以捕獲氧分子并制造超氧自由基以及通過歧化反應(yīng)或芬頓反應(yīng)產(chǎn)生ROS[25]，因此小尺寸的晶體產(chǎn)生更大的細胞毒性。

(4)晶體的顆粒數(shù)。由于晶體的細胞毒性實驗是用固定的晶體質(zhì)量濃度(200 μg·mL-1)進行，因此，大尺寸晶體的數(shù)量較少，即作用于細胞表面的晶體個數(shù)減少，對細胞的損傷機會降低，故COM-1∶5對HK-2的損傷作用最弱。

(5)細胞與晶體剪切應(yīng)力的影響。隨著COM晶體長度增加，晶體與細胞間的界面接觸并不能完全地貼合。大尺寸的COM-1∶5與細胞的臨界剪切應(yīng)力較小，導(dǎo)致其損傷細胞的能力減弱[26]。因此，其損傷細胞的能力也減弱。

4 結(jié) 論

合成了4種長寬比分別為1∶2、1∶3、1∶4和1∶5的COM晶體并對其進行了表征。升高反應(yīng)溫度、降低攪拌速度和減小添加劑明膠的濃度，均可以增大COM的長寬比。不同長寬比COM對人腎近端上皮細胞的毒性大小為COM-1∶2＞COM-1∶3＞COM-1∶4＞COM-1∶5＞對照組。COM晶體的(01)晶面比例增加、晶體的比表面積增大、細胞與晶體剪切應(yīng)力增大，均會增加COM晶體的細胞毒性。由于尿液中存在不同尺寸、不同形貌的尿微晶，因此，本研究有助于進一步闡明COM結(jié)石的形成機理，并對預(yù)防腎結(jié)石形成提供啟示。