王藝，馬可妮，劉靈，裴瑞景，王睿，馬萍，，姜飛，李洪春，(.徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州 004；.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇徐州 00)

自2009年首次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase, NDM)的耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌(carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE)以來，該類細(xì)菌引起的感染及全球播散已經(jīng)成為一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題。我國已有多個(gè)城市和地區(qū)報(bào)道CRE克隆流行[1-3]，一項(xiàng)縱向大規(guī)模CRE研究的數(shù)據(jù)顯示，NDM金屬酶主要存在于大腸埃希菌中[4]，據(jù)CHINET數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)網(wǎng)顯示大腸埃希菌是引起血流感染和尿路感染最主要的病原菌，產(chǎn)NDM大腸埃希菌通常同時(shí)攜帶多種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)，導(dǎo)致多重耐藥而僅對(duì)替加環(huán)素和黏菌素等極少數(shù)抗菌藥物敏感，給臨床治療該類細(xì)菌引起的感染帶來極大困難。

阿維巴坦是一種新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，體外對(duì)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生的ESBLs、KPC 酶和OXA-48酶有活性，但對(duì)以NDM為代表的金屬β-內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamases, MBLs)無抑制作用[5]。而氨曲南對(duì)MBLs保持穩(wěn)定，但被大多數(shù)ESBLs水解，兩種藥物聯(lián)合使用時(shí)，阿維巴坦能保護(hù)氨曲南免受ESBLs水解，使氨曲南維持抗菌活性[6]，但該組合在國內(nèi)的臨床病例應(yīng)用報(bào)道較少。本研究旨在評(píng)估氨曲南聯(lián)合頭孢他啶/阿維巴坦對(duì)產(chǎn)NDM金屬酶的大腸埃希菌的體外抗菌活性，為該組合治療產(chǎn)金屬酶的碳青霉烯耐藥大腸埃希菌引起的感染提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1菌株來源及鑒定 收集徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2018—2020年臨床分離的碳青霉烯耐藥[亞胺培南(IPM)最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)≥4 μg/mL]大腸埃希菌30株，分離自血液、尿液樣本各15株。所有菌株經(jīng)Vitek 2 Compact GN鑒定卡和質(zhì)譜確認(rèn)。

1.2主要儀器與試劑 Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌分析儀(法國生物梅里埃公司)，MALDI-TOF MS儀(德國布魯克公司)，哥倫比亞血瓊脂平板、M-H平板(上?？片敿喂?，頭孢他啶/阿維巴坦、氨曲南E-test紙條(溫州康泰公司)，碳青霉烯酶檢測(cè)緩沖液(珠海迪爾公司)、PCR擴(kuò)增儀、GelX1850凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，DYY-8C電泳儀(北京六一儀器廠)，1 000 bp DNA marker、PCR mix(日本TaKaRa公司)，引物合成(上海生工生物公司)，3730XL測(cè)序分析儀(美國 ABI 公司)。

1.3藥敏試驗(yàn) 用Vitek 2 Compact及配套N335和XN04藥敏卡對(duì)菌株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，并采用E-test紙條法測(cè)定菌株對(duì)氨曲南和頭孢他啶/阿維巴坦的MIC，結(jié)果判讀基于美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2021年判定標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.4聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 采用氨曲南和頭孢他啶/阿維巴坦雙E-test紙條檢測(cè)二者的體外協(xié)同作用[8]。改進(jìn)方法為：取0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝粷舛鹊拇竽c埃希菌菌懸液涂布M-H平板，然后將氨曲南和頭孢他啶/阿維巴坦E-test紙條完全重合后垂直插入平板中，37 ℃反應(yīng)18～24 h后，在頭孢他啶/阿維巴坦存在條件下讀取氨曲南的MIC值[8]。大腸埃希菌ATCC 25922為對(duì)照菌株。

1.5碳青霉烯酶表型檢測(cè) 參照碳青霉烯酶檢測(cè)緩沖液試劑說明書進(jìn)行操作。用無菌接種環(huán)刮取血平板上過夜培養(yǎng)的至少3個(gè)純菌落配制0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝粷舛鹊木鷳乙海坎糓-H平板，干燥3～5 min；貼4張IPM紙片并在其中3張紙片分別滴加10 μL乙二胺四乙酸(EDTA)、10 μL 3′-氨基苯硼酸(3-aminobenzeneboronic acid，APB)以及10 μL EDTA+10 μL APB，各紙片中心距離≥25 mm。35 ℃培養(yǎng)18～24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑大小。結(jié)果判讀：與單獨(dú)IPM紙片相比，IPM+APB抑菌圈直徑≥5 mm，提示產(chǎn)絲氨酸酶；IPM+EDTA抑菌圈直徑≥5 mm，提示產(chǎn)金屬酶；IPM+APB和IPM+EDTA抑菌圈無明顯擴(kuò)大，但I(xiàn)PM+APB+EDTA抑菌圈直徑≥5 mm，提示同時(shí)產(chǎn)絲氨酸酶+金屬酶。

1.6細(xì)菌DNA提取及耐藥基因檢測(cè) 用煮沸法提取細(xì)菌DNA。PCR方法擴(kuò)增4種碳青霉烯酶基因(NDM、KPC、IMP、VIM)、5種ESBL基因(CTX-M-1group、CTX-M-9group、SHV、TEM、CMY)，靶基因引物序列參照文獻(xiàn)[9]，引物由上海生工生物公司合成。反應(yīng)體系共50 μL，包括2×PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L上、下游引物各3 μL，DNA模板3 μL，滅菌ddH2O 16 μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，54 ℃(NDM、KPC、IMP、VIM、SHV、TEM、CMY)/52 ℃(CTX-M-1group、CTX-M-9group)45 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像分析系統(tǒng)分析，陽性條帶送上海生工生物公司在3730XL測(cè)序分析儀上進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.7多位點(diǎn)序列分型(multi-locus sequence typing, MLST) 采用PCR方法對(duì)大腸埃希菌進(jìn)行MLST。對(duì)7個(gè)管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系同1.6，引物序列及退火溫度見表1。PCR 產(chǎn)物純化后送上海生工生物公司在3730XL測(cè)序分析儀上進(jìn)行Sanger雙向測(cè)序后拼接，將測(cè)序數(shù)據(jù)提交至MLST網(wǎng)站(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_escherichia_seqdef)，確定菌株ST型。

表1 管家基因擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

2.1藥敏結(jié)果及氨曲南與頭孢他啶/阿維巴坦體外協(xié)同作用 30株大腸埃希菌對(duì)替加環(huán)素和多黏菌素耐藥率為0，對(duì)阿米卡星耐藥率為46.7%(14/30)，對(duì)氨曲南耐藥率為90%(27/30，MIC范圍：8～≥256 μg/mL，MIC50≥256 μg/mL，MIC90≥256 μg/mL)，對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦的耐藥率為100%(MIC范圍：128～≥256 μg/mL，MIC50≥256 μg/mL，MIC90≥256 μg/mL)。30株大腸埃希菌均顯示出氨曲南與頭孢他啶/阿維巴坦之間協(xié)同作用，氨曲南MIC50和MIC90分別下降至2 μg/mL和4 μg/mL，其中，27株對(duì)氨曲南耐藥的大腸埃希菌在頭孢他啶/阿維巴坦存在情況下25株對(duì)氨曲南敏感(MIC范圍<0.064～4 μg/mL)，1株對(duì)氨曲南中介(MIC=8 μg/mL)，1株仍對(duì)氨曲南耐藥(16 μg/mL)。見表2、圖1。

表2 30株大腸埃希菌對(duì)氨曲南、頭孢他啶/阿維巴坦及氨曲南聯(lián)合頭孢他啶/阿維巴坦的藥敏結(jié)果(μg/mL)

注：左，氨曲南MIC≥256 μg/mL；中，氨曲南聯(lián)合頭孢他啶/阿維巴坦MIC=1 μg/mL；右，頭孢他啶/阿維巴坦MIC≥256 μg/mL。

2.2碳青霉烯酶表型檢測(cè)結(jié)果 與單獨(dú)IPM紙片相比，30株大腸埃希菌IPM+APB抑菌圈直徑無明顯變化，IPM+EDTA以及IPM+EDTA+APB抑菌圈直徑≥5 mm，提示細(xì)菌產(chǎn)金屬酶。見圖2。

注：A，IPM；B，IPM+EDTA；C，IPM+APB；D，IPM+EDTA+APB。

2.3耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 30株大腸埃希菌中攜帶NDM-5基因26株，攜帶NDM-7基因2株，攜帶NDM-1和NDM-9基因各1株；15株攜帶TEM-1基因，22株攜帶CTX-M-1組基因(10株攜帶CTX-M-15，12株攜帶CTX-M-55)，9株攜帶CTX-M-9組基因(均為CTX-M-27)。未檢出KPC、IMP、VIM、SHV基因。

2.4MLST分型結(jié)果 30株大腸埃希菌共檢出8種ST型，其中以ST167為主(n=12，40%)，其次為ST405和ST410均6株，ST448 2株，ST744、ST746、ST361、ST2705各1株。見圖3。

注：不同顏色點(diǎn)代表不同ST型，點(diǎn)的大小代表菌株數(shù)量，線上數(shù)字代表不同ST型間管家基因差異數(shù)。

3 討論

頭孢他啶/阿維巴坦已被廣泛用于治療以產(chǎn)KPC為代表的絲氨酸酶的革蘭陰性桿菌引起的感染[10]。而對(duì)于產(chǎn)金屬酶的多重耐藥革蘭陰性桿菌，國外已有多項(xiàng)病例研究表明，氨曲南聯(lián)合頭孢他啶/阿維巴坦的組合能夠治療產(chǎn)NDM-1和OXA-48的肺炎克雷伯菌、產(chǎn)NDM-1和AmpC的銅綠假單胞菌以及產(chǎn)NDM-1和KPC-4的陰溝腸桿菌引起的感染并取得良好療效[8，11-13]，主要是利用阿維巴坦來保護(hù)氨曲南免受ESBLs水解，使氨曲南維持抗菌活性。國內(nèi)一項(xiàng)多中心體外研究顯示，94.7%的CRE因攜帶一種或多種ESBLs對(duì)氨曲南耐藥，但在聯(lián)合阿維巴坦之后，氨曲南耐藥菌株中96.9%的CRE菌株氨曲南/阿維巴坦的MIC≤1 μg/mL[14]。

本研究對(duì)30株CRE進(jìn)行碳青霉烯酶基因和ESBLs基因檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有大腸埃希菌均產(chǎn)NDM基因，86.7%的菌株(26/30)同時(shí)攜帶NDM基因和1種或1種以上ESBLs基因，其中88.5%的菌株(23/26)對(duì)氨曲南耐藥，所有菌株對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦耐藥。氨曲南聯(lián)合頭孢他啶/阿維巴坦之后，對(duì)聯(lián)產(chǎn)NDM金屬酶和ESBLs的大腸埃希菌具有顯著的協(xié)同作用，氨曲南耐藥菌株中91.3%(21/23)的菌株藥敏結(jié)果由耐藥變?yōu)槊舾?，另?株細(xì)菌氨曲南MIC分別下降至8 μg/mL(中介)和16 μg/mL(耐藥)。13.3%的菌株(4/30)只攜帶NDM基因，但仍對(duì)氨曲南耐藥(MIC≥8 μg/mL)，原因可能是攜帶本研究檢測(cè)之外的其他類型的ESBLs。在聯(lián)合頭孢他啶/阿維巴坦后，4株細(xì)菌氨曲南的MIC由8 μg/mL(耐藥)下降至2 μg/mL(敏感)。研究報(bào)道，通過體外篩選的對(duì)氨曲南聯(lián)合頭孢他啶/阿維巴坦耐藥的細(xì)菌，其耐藥機(jī)制與CMY基因突變有關(guān)(Tyr150Ser 或Asn346His)[15]。在用微量肉湯稀釋法確認(rèn)E.coli13耐藥菌株對(duì)氨曲南聯(lián)合頭孢他啶/阿維巴坦MIC為16 μg/mL后進(jìn)行CMY基因檢測(cè)，但未檢測(cè)到該基因，說明氨曲南聯(lián)合頭孢他啶/阿維巴坦耐藥還存在其他未知的機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。另外，相對(duì)于傳統(tǒng)的微量肉湯稀釋法，本研究采用氨曲南和頭孢他啶/阿維巴坦雙E-test紙條法檢測(cè)二者的體外協(xié)同作用，為實(shí)驗(yàn)室提供了一種簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)手段。

30株大腸埃希菌檢測(cè)出8種ST型，包括國內(nèi)較為常見的ST167、ST405和ST410及其他少見ST型，氨曲南聯(lián)合頭孢他啶/阿維巴坦均對(duì)其表現(xiàn)出協(xié)同作用，說明這種藥物組合可以廣泛應(yīng)用于治療不同ST型產(chǎn)NDM金屬酶的大腸埃希菌感染。

文獻(xiàn)報(bào)道，在用頭孢他啶/阿維巴坦和氨曲南治療產(chǎn)金屬酶腸桿菌科細(xì)菌感染時(shí)，需要監(jiān)測(cè)二者的血藥濃度，保證給藥間隔期間在頭孢他啶/阿維巴坦存在的情況下，氨曲南的藥物濃度大于MIC，以確保治療效果[13]。同時(shí)，Ⅱ期臨床試驗(yàn)也證明在臨床許可濃度下，氨曲南聯(lián)合頭孢他啶/阿維巴坦在治療產(chǎn)金屬酶腸桿菌科細(xì)菌引起的復(fù)雜性腹腔感染方面表現(xiàn)出的良好的安全性和有效性[16]。綜上所述，氨曲南聯(lián)合頭孢他啶/阿維巴坦對(duì)產(chǎn)NDM金屬酶大腸埃希菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗菌活性，可以作為該類耐藥菌感染的一種治療選擇。