潘志文，來茜，田珊，徐笑紅(中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院.檢驗(yàn)科，.病理科，杭州310022)

近年來，肺癌精準(zhǔn)治療得到廣泛應(yīng)用。小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)能靶向抑制突變的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因活性，EGFR突變的晚期非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)患者接受TKI治療后，可明顯獲益[1-2]。EGFR突變檢測已成為肺癌靶向治療的必需基因檢測項(xiàng)目。對EGFR突變情況進(jìn)行檢測，可較好地預(yù)測EGFR-TKI的療效，監(jiān)測疾病的進(jìn)展，并可發(fā)現(xiàn)EGFR-TKI是否耐藥，從而及時(shí)調(diào)整治療方案[3-5]。EGFR突變的檢測方法仍以組織標(biāo)本檢測為金標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)，細(xì)胞學(xué)及外周血EGFR突變檢測亦得到良好發(fā)展。由于組織標(biāo)本獲得途徑和次數(shù)有限以及腫瘤組織的異質(zhì)性，血漿檢測越來越受關(guān)注，已成為腫瘤伴隨診斷的主要發(fā)展方向。開展基因突變檢測必須有規(guī)范的質(zhì)量控制，室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評價(jià)都需有適宜的質(zhì)控品。為滿足分子實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的要求，本研究自制模擬臨床樣本的EGFR基因突變檢測質(zhì)控品并進(jìn)行性能評估。

1 材料與方法

1.1儀器及試劑 LightCycler 480擴(kuò)增儀(美國羅氏公司)，NanoDrop分光光度計(jì)(美國ThermoFisher公司)；EGFR基因突變檢測試劑盒(廈門艾德公司)，石蠟組織DNA提取試劑和血漿DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)。

1.2血漿EGFR質(zhì)控品準(zhǔn)備 (1)收集中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理確診為肺癌的多份手術(shù)標(biāo)本，由分子病理檢測確認(rèn)有EGFR 19del、L858R突變、T790M突變陽性的福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed and parrffin-embeded,FFPE)蠟卷，每份組織取15張蠟卷，其第1、2張切片和最后2張切片均由病理醫(yī)生確認(rèn)腫瘤細(xì)胞>500個(gè)以上，用石蠟組織DNA提取試劑提取DNA，用分光光度計(jì)檢測其濃度；(2)準(zhǔn)備無溶血、無黃疸、無脂濁，HBsAg、HCV、人類免疫缺陷病毒(HIV)及梅毒陰性的正常人血漿，將血漿于65 ℃滅活10 h，1 500 r/min離心10 min，去除沉淀物；(3)將標(biāo)本DNA與血漿混合，提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線，配制成檢測下限2～4倍的EGFR突變DNA濃度的血漿溶液；(4)分裝到1 mL的EP管中，每支0.5 mL，-80 ℃凍存；(5)標(biāo)本獲取均由醫(yī)院倫理委員會討論通過(倫理批件號IRB-2022-66)。

1.3血漿質(zhì)控品DNA提取及突變檢測 用血漿DNA提取試劑盒提取自制血漿質(zhì)控品DNA，按試劑說明書進(jìn)行操作。用分光光度計(jì)測定濃度和純度后，用LightCycler 480擴(kuò)增儀和血液EGFR突變檢測試劑盒檢測突變狀況。PCR擴(kuò)增后，對質(zhì)控品循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 16.0軟件進(jìn)行。用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行均一性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1均一性評價(jià) 參照CNAS-GL03《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價(jià)指南》中關(guān)于均一性的評價(jià)要求，分別抽取19del、L858R突變、T790M突變的自制質(zhì)控品各10支，每支重復(fù)測定2次。第1輪按1→10的順序檢測，第2輪按10→1的順序重復(fù)測定，記錄兩輪檢測的Ct值結(jié)果并計(jì)算平均值，兩輪檢測結(jié)果間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值>0.05)，表明樣品均一性較好。見表1。

表1 自制血漿EGFR突變質(zhì)控品均勻性評價(jià)結(jié)果(Ct值)

2.2穩(wěn)定性評估 按照CNAS-GL03中穩(wěn)定性檢驗(yàn)“5.2.2 兩個(gè)平均值之間的一致性”方法進(jìn)行評價(jià)。隨機(jī)取19del、L858R突變、T790M突變的自制質(zhì)控品各1瓶，每瓶重復(fù)檢測2次，將得到的Ct均值作為初始均值，再分別于第2、4、6、8、10、12個(gè)月隨機(jī)各抽取1瓶-80 ℃保存的自制質(zhì)控品，按同樣方法進(jìn)行檢測，分別取其平均Ct值，觀察Ct值變化情況。自制質(zhì)控品保存第2、4、6、8、10、12個(gè)月檢測結(jié)果的Ct值見圖1，結(jié)果顯示19del、L858R和T790M突變的Ct值變異系數(shù)分別為1.3%、1.8%和1.3%，均小于5%，檢測結(jié)果的穩(wěn)定性較好，見表2。

圖1 19del、L858R和T790M突變質(zhì)控品檢測Ct值變化曲線

表2 自制EGFR 突變質(zhì)控品穩(wěn)定性檢測結(jié)果(Ct值)

2.3準(zhǔn)確性評估 選取自制質(zhì)控品共測定10次，檢出10次，陽性符合率均為100%，準(zhǔn)確性較好。

3 討論

目前，臨床的分子診斷相關(guān)檢測越來越多，項(xiàng)目繁多，方法多樣，人員水平參差不齊，檢測主體層次不一，質(zhì)量意識強(qiáng)弱不一，缺乏統(tǒng)一規(guī)范的質(zhì)量監(jiān)控體系，質(zhì)量令人擔(dān)憂。為此，建立實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系，采取規(guī)范的質(zhì)量管理措施刻不容緩。分子診斷質(zhì)控品有其特殊性：沒有國家級標(biāo)準(zhǔn)品；不能自動化和標(biāo)準(zhǔn)化，隨機(jī)差異大；診斷方法多樣，如Sanger測序、ARMS-PCR法，dd-PCR法、二代測序法(NGS)等，檢測結(jié)果五花八門[6-8]。Liu等[9]研究中，自制5個(gè)EGFR血漿和石蠟組織的檢測質(zhì)控品，并發(fā)給8家單位NGS盲測，其中，19del Plasma-Q0有3家未檢出，Plasma-Q1有1家未檢出，Plasma-Q2有2家未檢出，F(xiàn)FPE-Q1有1家未檢出。由于分子檢測診斷方法更新?lián)Q代快，決定了檢測質(zhì)量控制的復(fù)雜性和持續(xù)更新的必要性。

然而，無論使用何種檢測方法，運(yùn)用質(zhì)控品進(jìn)行全流程的質(zhì)量監(jiān)管，是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確的必不可少的措施。目前，EGFR突變臨床檢測中，缺少用于質(zhì)量控制的全程實(shí)驗(yàn)用的質(zhì)控品。因此，為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，本研究利用病理剩余組織提取EGFR突變的DNA，混合正常人血漿，稀釋成低濃度后配制成EGFR常見突變位點(diǎn)的質(zhì)控品，與常規(guī)檢測標(biāo)本性狀相同、DNA提取操作同步，可完整監(jiān)控DNA提取過程，真實(shí)反映提取操作過程是否合格；同時(shí)，在擴(kuò)增反應(yīng)上，通過質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線、陰性和陽性對照擴(kuò)增曲線，可監(jiān)測每日檢測的穩(wěn)定性，克服了組織標(biāo)本的異質(zhì)性，均一性好；在對自制質(zhì)控品進(jìn)行每月1次檢測中顯示，在1年內(nèi)3種陽性突變質(zhì)控品檢測Ct值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可良好地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室自建檢測(LDTs)的性能確認(rèn)，符合室內(nèi)質(zhì)量控制的管理要求。更長時(shí)間的保存是否會影響質(zhì)控品的穩(wěn)定性，還有待繼續(xù)研究。自制質(zhì)控品定性結(jié)果準(zhǔn)確性達(dá)100%。

分子病理中突變組織的DNA含量較高，在制備過程中，稀釋倍數(shù)較高，可一次制備的質(zhì)控品量大，減少了不同制作批間的差異，可保證半年到一年的用量。本研究中EGFR陽性質(zhì)控品制備方法簡單，成本低廉，均一性好，結(jié)果穩(wěn)定，使用方便，利于LDTs項(xiàng)目的質(zhì)量控制，也適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室的推廣和應(yīng)用。