王婷，杜鴻，程肖霞，鄧春敏，趙晨(.蘇州科技城醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州553；.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州 5004)

肺炎克雷伯菌是引起臨床感染的重要病原菌之一，可引發(fā)呼吸道、血流、尿路等一系列腸外感染，嚴(yán)重者可危及生命[1-2]。碳青霉烯類抗菌藥物是對抗肺炎克雷伯菌感染的有效利刃[3]。隨著抗菌藥物的廣泛甚至不合理使用，近年來耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)檢出率逐年增高[4]。CRKP檢出情況在我國不同地區(qū)不同醫(yī)療機構(gòu)也存在很大差異[5]。日益嚴(yán)峻的耐藥形勢給臨床抗感染治療帶來了新的挑戰(zhàn)。

蘇州科技城醫(yī)院是一家地處蘇州西部地區(qū)的公立三級綜合性醫(yī)院，2016年5月正式投入使用，至2017年初，臨床各病區(qū)陸續(xù)全部開放。以往有關(guān)新建醫(yī)院的肺炎克雷伯菌相關(guān)研究較少，本研究通過一系列實驗，分析該院肺炎克雷伯菌的臨床分布、耐藥變遷，以及CRKP的分子生物學(xué)特征等，為該院防治肺炎克雷伯菌感染提供實驗室依據(jù)，為進一步探討新建醫(yī)院環(huán)境下如何有效預(yù)防和控制醫(yī)院感染提供參考。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2017—2020年蘇州科技城醫(yī)院微生物室分離的763株肺炎克雷伯菌，包括44株CRKP，剔除同一患者相同菌株。

1.2儀器與試劑 Phoenix-100 System全自動微生物鑒定/藥敏儀(BD公司)，PCR 儀(Applied Biosystems公司)，脈沖場凝膠電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)分析儀(Bio-Rad公司)；PCR檢測試劑(賽默飛公司)，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ(NEW ENGLAND BioLabs公司)，GelRed核酸染料(Biotium公司)，蛋白酶K(索萊寶公司)，瓊脂糖凝膠粉(瑞士Lonza 公司)。

1.3菌株鑒定和藥敏試驗 采用Phoenix-100 System全自動微生物鑒定/藥敏儀進行菌株鑒定和8類共17種抗菌藥物的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)分析。藥敏結(jié)果判讀參照2017—2020年當(dāng)年版美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[6]。質(zhì)控菌株選擇大腸埃希菌ATCC 25922，購于國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心。采用東華病案系統(tǒng)查詢患者臨床資料，WHONET5.4軟件及東華LIS系統(tǒng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.4脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分析 用PFGE技術(shù)對44株CRKP進行同源性分析。取200 μL新鮮菌懸液加入10 μL蛋白酶K(20 mg/mL)，與10 g/L的瓊脂糖1∶1混勻后加入模具制備膠塊；經(jīng)蛋白酶K消化2 h，洗滌后用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切。配制1.0%凝膠進行PFGE，設(shè)置電泳參數(shù)：電壓6 V/cm，電泳溫度14 ℃，電泳方向角度變換：120°，泵速70 r/min。電泳時間18～19 h，脈沖時間為5～40 s。Marker選用蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院蘇州市臨床微生物學(xué)重點實驗室保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812。電泳結(jié)束后，用GelRed染色液染色，凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像，并用Gel J軟件對結(jié)果進行分析。

1.5CRKP的耐藥性研究

1.5.1耐藥基因的篩選 對CRKP菌株用PCR法篩選碳青霉烯酶編碼基因blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48。陽性對照物為蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院蘇州市臨床微生物學(xué)重點實驗室經(jīng)測序確定并保存的菌株，特異性引物由該實驗室根據(jù)GenBank中發(fā)表的基因序列設(shè)計[7]，委托上海生工生物公司合成，引物序列見表1。用吸附柱法提取細菌基因組DNA，反應(yīng)體系共15 μL，包括：2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL，ddH2O 4.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.75 μL，模板1.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳(5 V/cm)20 min，凝膠成像系統(tǒng)分析PCR產(chǎn)物。各類型的陽性擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測序，采用ABI 3730XL基因測序儀，測序方法為sanger法測序，結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫原序列進行比對。

表1 耐藥基因PCR引物序列

1.5.2質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實驗 以PCR擴增陽性的產(chǎn)碳青霉烯酶菌株為供體菌，以E.coliE600(利福平抗性)為質(zhì)粒受體菌進行接合轉(zhuǎn)移實驗。挑取供體菌、受體菌單個菌落分別接種于含0.5 μg/mL美羅培南的1 mL LB培養(yǎng)液中，35 ℃、250 r/min震蕩培養(yǎng)16～18 h。取供、受體菌液100 μL共同加入2 mL新鮮LB培養(yǎng)液中，在35 ℃、100 r/min輕微震蕩下接合5～6 h，最后吸取100 μL接合菌液涂布美羅培南和利福平雙抗性的LB平板，35 ℃溫育過夜。以平板上長出的單個菌落為模板，進行菌株鑒定、常用抗菌藥物藥敏試驗，以及PCR擴增碳青霉烯酶基因，篩選出疑似陽性接合子，對擴增產(chǎn)物測序比對，鑒定質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移子。

1.5.3全基因組測序分析 選取PCR擴增結(jié)果呈KPC陽性的肺炎克雷伯菌1株，使用Omega Bio-Tek細菌DNA試劑盒分離基因組DNA，在NovaSeq 6000測序儀上進行測序，使用SPAdes3.11組裝校正的數(shù)據(jù)，進行二代全基因組序列測定分析。

2 結(jié)果

2.1肺炎克雷伯菌臨床分布特征 該院2017、2018、2019、2020年分離出的肺炎克雷伯菌分別為143株、214株、220株、186株。763株菌中，50.98%分離自痰液，其次是尿液30.80%，血液12.06%，分泌物7.73%；23.07%分離自神經(jīng)外科，其次是呼吸內(nèi)科17.96%，重癥監(jiān)護病區(qū)(intensive care unit, ICU)13.37%，腫瘤內(nèi)科10.22%和康復(fù)科8.65%等。

2.2肺炎克雷伯菌耐藥情況分析 各年度肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的耐藥情況見表2。從耐藥趨勢看，對氨基糖苷類、復(fù)方磺胺類耐藥率相對穩(wěn)定；對碳青霉烯類、氨曲南、頭孢菌素類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物的耐藥率呈逐年上升趨勢。

表2 2017—2020年肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的耐藥率(%)

2.3CRKP臨床分布特征及耐藥情況分析 2017—2020年，各年CRKP在肺炎克雷伯菌中的占比分別為2.80%(4/143)、4.67%(10/214)、5.91%(13/220)、9.14%(17/186)。從標(biāo)本類型來看，86.36%(38/44)分離自痰液，9.09%(4/44)分離自尿液，4.55%(2/44)分離自其他標(biāo)本。從臨床分布來看，40.91%(18/44)分離自神經(jīng)外科，29.55%(13/44)分離自ICU，11.36%(5/44)分離自腫瘤內(nèi)科，9.09%(4/44)分離自康復(fù)科，9.09%(4/44)分離自其他科室。耐藥結(jié)果顯示，CRKP菌株對阿米卡星、頭孢他啶耐藥率稍低，分別為51.3%、72.8%，對其他抗菌藥物的耐藥率均在90%以上。

2.4CRKP的PFGE結(jié)果 經(jīng)Gel J軟件分析，以相似度≥80%為同一克隆型作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，PFGE結(jié)果顯示，44株CRKP有32個克隆型，無主要克隆型，其中A22型、A26型占比分別為11.4%(5/44)、9.1%(4/44)，為相對優(yōu)勢克隆型；其次為A27、A29，均占6.8%(3/44)。部分電泳圖見圖1。

注：M，標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812；1～6，實驗菌株。

2.5CRKP菌株耐藥機制研究結(jié)果

2.5.1耐藥基因篩選結(jié)果 PCR擴增結(jié)果顯示有32株菌株碳青霉烯酶基因陽性，分別是2017年blaKPC陽性2株，2018年blaKPC陽性7株，2019年blaKPC陽性6株、blaNDM陽性3株，2020年blaKPC陽性7株、blaNDM陽性3株、blaIMP陽性2株、blaKPC+blaNDM均陽性2株，未檢測到blaVIM、blaOXA-48陽性菌株。另有12株菌株未檢測到碳青霉烯酶基因。擴增產(chǎn)物送上海生工測序比對，均證實為目的基因片段，其中攜帶blaKPC基因的菌株均為KPC-2型。部分PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2、3、4。

注：M，DNA marker；1～11，實驗菌株；12，blaKPC陽性對照；13，陰性對照。

注：M，DNA marker；1～5，實驗菌株；6，blaNDM陽性對照；7，陰性對照。

注：M，DNA marker；1～2，實驗菌株；3，blaIMP陽性對照；4，陰性對照。

2.5.2接合轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果 接合轉(zhuǎn)移子經(jīng)鑒定為大腸埃希菌，MIC藥敏試驗結(jié)果為亞胺培南、美羅培南耐藥，其他類抗菌藥物敏感，受體菌為全敏感大腸埃希菌，PCR擴增及測序結(jié)果均證實7株blaKPC、2株blaNDM陽性菌株接合轉(zhuǎn)移成功。臨床資料顯示其中5株blaKPC陽性菌株均來自神經(jīng)外科。部分接合轉(zhuǎn)移子PCR擴增產(chǎn)物電泳圖見圖5。

注：M，DNA marker；1，blaNDM陽性對照；2，陰性對照；3～8，雙抗板上部分接合轉(zhuǎn)移子blaNDM擴增陽性產(chǎn)物。

2.5.3全基因組測序結(jié)果 從篩選出的碳青霉烯酶基因陽性率最高的blaKPC菌株中選取1株CRKP，進行二代全基因組序列測定分析，根據(jù)ResFinder網(wǎng)站注釋的耐藥基因分布圖，其中有磷霉素耐藥基因1種(14%)，氨基糖苷類耐藥基因2種(29%)，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因占57%，其中A類碳青霉烯類耐藥基因KPC-2占14%，其余43%均為其他β-內(nèi)酰胺類耐藥基因。由此可見該菌株為KPC-2型。

VFDB網(wǎng)站注釋的毒力基因分類較多，根據(jù)注釋結(jié)果，該株菌內(nèi)沒有肺炎克雷伯菌常見的rmpA、rmpA2等毒力基因，有少見的iutA、iroN等毒力基因，且提示有與編碼Ⅳ型菌毛相關(guān)的pilW基因。

根據(jù)測序結(jié)果，分析克雷伯菌屬7個管家基因(pgi,rpoB,tonB,gapA,mdh,infB,phoE)的序列，得出該株菌為ST11型。

3 討論

相比同地區(qū)其他傳統(tǒng)三級醫(yī)院[8-10]，該院肺炎克雷伯菌對各類抗菌藥物的耐藥率普遍偏低。但隨著住院病人的增加，抗菌藥物在各臨床科室廣泛使用，總體耐藥率呈逐年升高趨勢。與胡付品等研究報道的2020年全國CRKP的檢出率高達22.4%[9]相比，該院的CRKP檢出率較低，但建院不到一年即出現(xiàn)CRKP菌株，檢出率由2017年的2.80%上升至2020年的9.14%，增幅明顯。這一研究結(jié)果應(yīng)引起院感等相關(guān)部門重視，醫(yī)院投入使用之初即應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范抗菌藥物的合理使用，防止致病菌耐藥率的過度增長。

本研究中CRKP菌株對常用抗菌藥物的耐藥率均較高，給臨床抗感染治療帶來一定困難。研究表明，聯(lián)合應(yīng)用替加環(huán)素、多黏菌素、磷霉素等藥物治療CRKP感染的效果明顯優(yōu)于單藥治療[11]。近年來，新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑合劑，如頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶/阿維巴坦，在CRKP感染的治療中也發(fā)揮重要作用[12]。本研究中無相關(guān)抗菌藥物的耐藥數(shù)據(jù)，建議該院微生物室立即開展多黏菌素、替加環(huán)素、磷霉素、新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑合劑等抗菌藥物的藥敏試驗，并積極開展相關(guān)耐藥基因檢測，為臨床醫(yī)師合理選擇抗菌藥物治療CRKP感染提供有效的實驗室依據(jù)。

PFGE聚類分析結(jié)果顯示，該院CRKP菌株型別較多，呈散在分布，與何紅等[13]報道的CRKP在長沙市第一醫(yī)院等醫(yī)院呈現(xiàn)主要克隆型傳播不同，這可能與新建醫(yī)院運行時間短，感染防控措施有效有關(guān)。臨床資料顯示，A22、A26型菌株均來自2019年10月至2020年4月神經(jīng)外科、ICU住院患者，部分患者有神經(jīng)外科、ICU轉(zhuǎn)換住院經(jīng)歷；A27、A29型部分菌株來自2020年下半年康復(fù)科患者，且患者前期有神經(jīng)外科、ICU住院史，表明該院CRKP仍在神經(jīng)外科、ICU存在小范圍克隆傳播。這些病區(qū)多為重癥患者，創(chuàng)傷性操作多，免疫力低下，可能增加CRKP感染機會。另外，CRKP易在環(huán)境中定存，如空氣粉塵顆粒、物體表面等，該院需高度重視克隆株的出現(xiàn)，嚴(yán)格采取有效隔離措施及環(huán)境消毒，規(guī)范醫(yī)護人員無菌操作[14]，同時加強耐藥菌株的監(jiān)測，防止耐藥菌株進一步傳播。

相關(guān)報道顯示，產(chǎn)KPC-2酶是國內(nèi)肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類耐藥的主要機制[15]，其次是產(chǎn)NDM酶，產(chǎn)OXA-48的CRKP菌株也偶被報道[16]，blaIMP、blaVIM的檢出率較低[17]。本研究32株CRKP中，blaKPC-2型24株，為主要型別，其次是blaNDM型8株，與國內(nèi)流行趨勢大體一致。有研究提示多種耐藥基因共存可能是導(dǎo)致醫(yī)院CRKP廣泛耐藥的重要原因[18]。相比較陳金云等[19]研究報道的浙江地區(qū)4家公立三級醫(yī)院近年來分離出的104株CRKP中，blaKPC陽性102株，blaIMP陽性2株，本研究中CRKP的耐藥基因型由2017年、2018年僅出現(xiàn)blaKPC型，2019年增加了blaNDM型，到2020年又增加了blaIMP型，blaKPC、blaNDM共存型，逐年多樣性，耐藥形勢相當(dāng)嚴(yán)峻，應(yīng)引起臨床抗感染治療的高度重視。

目前已有研究表明，blaKPC主要存在細菌的質(zhì)粒上，不需要依賴膜孔蛋白的丟失，可單獨引起碳青霉烯類耐藥，并且可以在不同菌種間水平傳播，易導(dǎo)致院內(nèi)爆發(fā)流行[20]。在本研究的接合轉(zhuǎn)移實驗中，接合轉(zhuǎn)移成功的blaKPC陽性菌株中有4株為A22型、2株為A26型，臨床資料顯示，這6株菌有5株來自神經(jīng)外科，1株來自ICU，且PFGE結(jié)果分型中A22、A26型的9株菌均表達KPC-2基因，表明該型菌株已經(jīng)引起小范圍傳播流行，后期感控部門及相關(guān)科室應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)控該型CRKP菌株的檢出情況，可以對CRKP患者采取隔離措施，同時醒目標(biāo)識，如佩戴多重耐藥菌腕帶，還需進一步加強醫(yī)療設(shè)施的消毒，減少人員探視，加強手衛(wèi)生等，防止耐藥質(zhì)粒水平傳播，造成更大范圍更多菌種的多重耐藥情況發(fā)生。

rmpA和rmpA2基因主要編碼一種黏液因子，在肺炎克雷伯菌中存在rmpA和rmpA2基因，則表現(xiàn)為高黏液性[21]。相關(guān)報道表明，CRKP菌株中，高黏液型菌株有高致病性[22]。IutA是鐵載體相關(guān)受體蛋白，在大腸埃希菌中較多見，在臨床環(huán)境中，含鐵載體受體的菌株可對腸道產(chǎn)生致病性[23]。編碼Ⅳ型菌毛相關(guān)的pilW基因及其直系同源物是Ⅳ型菌毛特定的脂蛋白[24]，pilW是一種多功能蛋白質(zhì)，常見于奈瑟菌中，在肺炎克雷伯菌中比較少見[25]。測序結(jié)果中該代表菌株無rmpA、rmpA2毒力基因，表明該菌非高黏液型，致病性相對較弱，但攜帶有以往肺炎克雷伯菌中比較少見的iutA、iroN、pilW等基因，不排除有新的致病因素出現(xiàn)，需后期進一步研究探索。

肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗菌藥物的主要機制是產(chǎn)碳青霉烯酶，此外還存在其他機制可導(dǎo)致碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，常見的是突變孔蛋白、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、AmpC機制，另外藥物外排泵、青霉素結(jié)合蛋白的修飾等也會導(dǎo)致其對碳青霉烯類耐藥[26]。本研究中有12株菌未檢測出碳青霉烯酶編碼基因，推測這12株CRKP的耐藥表型可能與上述機制相關(guān)。

由于新建醫(yī)院尚處于運行初始階段，標(biāo)本量有限，本研究的部分結(jié)論有待進一步探討。綜上所述，該新建醫(yī)院CRKP的檢出率呈逐年上升趨勢，耐藥基因型逐漸多樣性，應(yīng)予以高度關(guān)注，嚴(yán)格規(guī)范抗菌藥物的使用，控制耐藥菌株傳播。