程娟，嚴琨，韓守華，潘兆寶，李萬生，王海志，劉光福(濰坊市第二人民醫(yī)院 .檢驗科，.感染性疾病科，山東濰坊 261000)

分枝桿菌屬包括結核分枝桿菌復合群、麻風分枝桿菌復合群和非結核分枝桿菌(non-tuberculosis mycobacteria，NTM)，截至2021年底報道的有效公布和正確名稱的分枝桿菌子分類群數(shù)達194種(http://www.bacterio.net/mycobacterium.html)。NTM的細菌學特點與結核分枝桿菌類似[1]，故NTM感染易誤診為結核病。由于不同NTM菌種生物學特性、致病力、藥物敏感性等方面均不盡相同，因此具有臨床意義的NTM應該鑒定到種水平，以選擇恰當?shù)闹委煼桨竅2]。

目前常用的分枝桿菌鑒定方法包括分子生物學檢測、分枝菌酸分析、蛋白質譜圖分析等[3]。分子生物學檢測主要是以16S rRNA、RNA聚合酶β亞基(rpoB)、熱休克蛋白65(hsp65)、16S-23S rRNA間區(qū)為主的直接測序技術和以探針雜交為基礎的間接測序技術[4]。分枝菌酸分析則通過標準菌株的分枝菌酸指紋譜庫比對進行菌種鑒定[3]。蛋白質譜圖分析通過獲取待測菌種特異的蛋白質譜圖，與數(shù)據(jù)庫比對進行菌種鑒定[3]。本研究利用多靶位測序技術評估基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技術鑒定分枝桿菌的準確度，同時將其應用于臨床，得到分枝桿菌菌種分布情況，為分枝桿菌病防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 濰坊市第二人民醫(yī)院接受治療的患者，從痰、支氣管肺泡灌洗液、胸水等各種臨床標本中分離到的分枝桿菌，培養(yǎng)方法包括羅氏固體培養(yǎng)和BACTECTMMGITTM960液體培養(yǎng)，所有的菌株均經(jīng)過萋-尼抗酸染色確認。2016年7月到2017年10月期間經(jīng)MALDI-TOF MS(法國生物梅里埃公司，IVD V3.0)鑒定的751例菌株(鑒定置信度99.9%)同時進行rpoB、hsp65、16S rRNA的部分序列測序。2017年7月1日至2021年11月30日期間分離的6 350例分枝桿菌利用MALDI-TOF MS進行鑒定，分析分枝桿菌的菌種分布情況。

1.2主要儀器與試劑 PCR擴增儀(美國ABI公司)、Vitek MS V3.0及配套靶板、基質液(α-氰基-4-羥基肉桂酸，CHCA)(法國生物梅里埃公司)、3730XL測序儀(ABI公司)；羅氏固體培養(yǎng)基(珠海貝索公司)，BACTECTMMGITTM960液體培養(yǎng)基(美國BD公司)，PCR引物由上海生工生物公司合成。

1.3分枝桿菌MALDI-TOF MS鑒定

1.3.1菌株滅活 固體培養(yǎng)菌株：用1 μL接種環(huán)在羅氏培養(yǎng)基上取2滿環(huán)菌，加入到含0.5 mm玻璃珠和500 μL 70%乙醇的2 mL圓底微量離心管中。液體培養(yǎng)菌株：先渦旋震蕩BACTECTMMGITTM960液體培養(yǎng)基5～10 s，取3 mL加入離心管3 000×g離心10 min。用500 μL 70%乙醇重懸沉淀物，將懸液轉入含0.5 mm玻璃珠的2 mL圓底微量離心管中。渦旋震蕩15 min，室溫垂直放10 min滅活。

1.3.2樣本前處理及上機鑒定 將全部液體轉移至2 mL離心管中12 000×g離心2 min。棄上清液，加20 μL 70%甲酸，充分混勻沉淀。加20 μL乙腈，充分混勻。離心2 min后取1 μL上清液涂靶板。完全干燥后加1 μL CHCA基質液。干燥后行MALDI-TOF MS鑒定，鑒定置信度99.9%為鑒定成功，記錄鑒定結果。

1.4分枝桿菌測序鑒定

1.4.1基因組DNA提取 將菌株收集在1.5 mL離心管中，加入500 μL TE緩沖液，渦旋震蕩，13 000 r/min離心2 min，棄上清液，對菌株進行清洗。加入200 μL TE緩沖液，金屬浴95 ℃加熱30 min，13 000 r/min離心2 min，上清液即可作為PCR擴增模板。

1.4.2PCR擴增 選擇分枝桿菌鑒定常用的16S rRNA、rpoB、hsp65分子標記，根據(jù)文獻[5-7]合成PCR引物，見表1。PCR體系30 μL，包括2×Master Mix 15 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 11 μL。反應參數(shù)：95 ℃ 3 min;95 ℃ 1 min,退火1 min,72 ℃ 1 min,35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表1 16S rRNA、rpoB、hsp65 PCR擴增引物

1.4.3PCR擴增產物測序 將PCR擴增產物送至北京擎科新業(yè)生物技術公司，在ABI 3730XL測序儀上進行Sanger法測序，測序結果用BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比對，根據(jù)序列與GenBank中已知靶序列的同源性(≥99%)得到菌種鑒定結果。當16S rRNA、rpoB、hsp653種基因序列比對結果不一致時，以相似度最高的菌種作為標本所屬菌種。

2 結果

2.1MALDI-TOF MS鑒定與測序結果符合率 751例菌株進行16S rRNA、hsp65、rpoB擴增測序，3個基因測序結果基本一致，除了有2株16S rRNA測序將龜分枝桿菌鑒定為膿腫分枝桿菌，1株結核分枝桿菌復合群16S rRNA擴增失敗、無鑒定結果。以rpoB、hsp65、16S rRNA測序結果為參考結果，MALDI-TOF MS鑒定與測序結果一致的有745例，符合率為99.20%(745/751)；不一致的有6例，其中NTM被MALDI-TOF MS鑒定為MTC 4例， MTC被MALDI-TOF MS鑒定為NTM 2例。MALDI-TOF MS對結核分枝桿菌復合群(MTC)鑒定的準確率為99.66%(595/597)，對NTM鑒定的準確率為97.40%(150/154)。見表2。

表2 MALDI-TOF MS與rpoB、hsp65、16S rRNA測序結果比較

2.2分枝桿菌的菌種分布情況 MALDI-TOF MS鑒定本院分枝桿菌6 350株，共涉及13個分枝桿菌種類，見表3。近5年間分離的分枝桿菌中NTM 985株(占15.51%)，NTM種類主要為緩慢生長型(90.46%)，其中胞內分枝桿菌占比最高(73.20%)，其次為堪薩斯分枝桿菌(12.08%)；快生長型分枝桿菌以膿腫分枝桿菌為主(6.19%)。見圖1。

表3 近5年本院MALDI-TOF MS鑒定分枝桿菌情況

圖1 近5年本院各類非結核分枝桿菌占比

3 討論

MALDI-TOF MS作為臨床微生物實驗室日漸廣泛應用的一項新技術，許多研究者一直致力于擴大其微生物鑒定范圍的研究。結核分枝桿菌的培養(yǎng)及質譜鑒定具有較高的生物安全要求，必須在加強型生物安全二級實驗室開展，同時需要通過強化防護意識、提高個人防護措施、規(guī)范防護行為等方式減少生物安全風險[8]。結核分枝桿菌培養(yǎng)大多在結核病定點醫(yī)院或部分研究機構開展，這些機構MALDI-TOF MS的普及率較低。

近年來隨著研究的不斷深入，MALDI-TOF MS對于分枝桿菌的鑒定逐漸從研究層面轉變到臨床應用。本研究選擇分枝桿菌鑒定常用的靶基因rpoB、hsp65、16S rRNA測序對MALDI-TOF MS鑒定的分枝桿菌進行驗證，旨在評估MALDI-TOF MS對分枝桿菌鑒定的準確度，為質譜鑒定分枝桿菌的臨床應用提供理論依據(jù)。

16S rRNA測序是微生物鑒定領域常用的手段。然而，單獨使用16S rRNA無法區(qū)分近緣的快生長型分枝桿菌，如龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌，產黏液分枝桿菌和富西亞分枝桿菌，需要rpoB、hsp65的輔助方可區(qū)分[9]。本研究使用的MALDI-TOF MS儀(生物梅里埃公司)可鑒定分枝桿菌的2個群水平，包括結核分枝桿菌復合群(結核分枝桿菌、非洲分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、卡氏分枝桿菌)、偶發(fā)分枝桿菌群(河床分枝桿菌、鼻疽分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌偶發(fā)亞種、休斯頓分枝桿菌、外來分枝桿菌、豬分枝桿菌、塞內加爾分枝桿菌)以及37個種水平。對于近緣物種，如鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌、龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌等均可區(qū)分。

結果顯示，MALDI-TOF MS(生物梅里埃公司)對結核分枝桿菌復合群鑒定的準確率為99.66%，對NTM鑒定的準確率為97.40%。本研究質譜與測序結果不一致的有6例，其原因可能是：(1)培養(yǎng)的菌株不純，得到混合細菌質譜圖，出現(xiàn)錯誤結果；(2)蛋白質抽提質量影響質譜圖質量，譜圖質量較差會得到錯誤鑒定結果[10]；(3)被鑒定的菌株若為數(shù)據(jù)庫未覆蓋的物種，則無法得到準確的鑒定結果[10]，如測序結果為馬賽分枝桿菌和血液分枝桿菌的菌株，二者的圖譜未在MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(生物梅里埃公司，IVD V3.0)中，質譜鑒定結果為結核分枝桿菌復合群。

濰坊市第二人民醫(yī)院為濰坊地區(qū)的結核病定點醫(yī)院，自2016年質譜儀引進之后，逐漸探索質譜法鑒定分枝桿菌菌種的流程，2017年開始常規(guī)使用，因此本院的數(shù)據(jù)在一定程度上可以反映濰坊地區(qū)分枝桿菌的感染情況。自2017年至2019年，本院NTM的分離率呈逐年上升趨勢，而2020年出現(xiàn)明顯的下降，分析可能受新冠肺炎疫情的影響，該年度結核分枝桿菌、NTM分離率均下降，2021年隨著疫情防控常態(tài)化而逐漸出現(xiàn)升高趨勢。

研究發(fā)現(xiàn)，NTM 感染率和菌種分布均存在著明顯的地域差異，且與氣候環(huán)境相關[11]。通常情況下NTM感染南方多于北方、沿海高于內陸、氣候溫和地區(qū)高于寒冷地區(qū)[1]。本研究發(fā)現(xiàn)濰坊地區(qū)NTM分布以胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌為主，與山東省NTM分布情況基本一致[12]。

總之，MALDI-TOF MS在臨床分枝桿菌鑒定方面具有極大的優(yōu)勢：準確率高，與測序的符合率為99.20%；與測序相比，鑒定速度快，1 h即可完成，而測序需要3 d左右；可以鑒別近緣物種等。同時MALDI-TOF MS也具有一定的局限性：不能鑒定未培養(yǎng)的細菌；對于數(shù)據(jù)庫之外的細菌無法鑒定，數(shù)據(jù)庫需要不斷完善補充；對細菌的純度要求較高，否則會出現(xiàn)錯誤結果。