劉馨蔚， 王雪峰

流行性感冒(簡(jiǎn)稱流感)是感染流感病毒引發(fā)急性呼吸道癥狀的疾病，其具有傳播快、感染性強(qiáng)的特點(diǎn)。流感患者和隱性感染者為主要傳染源，以飛沫傳染為主要途徑。目前，臨床治療流感首選神經(jīng)氨酸酶抑制劑，但隨著藥物使用的增加，其耐藥性也在逐年提升[1]。而中醫(yī)藥作為我國(guó)醫(yī)療特色，在治療疾病上有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。其調(diào)控機(jī)制具有多靶點(diǎn)，多通路，較安全等特點(diǎn)，在改善患兒癥狀，提高患兒生活質(zhì)量方面極具潛力。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，是生物信息學(xué)、醫(yī)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、現(xiàn)代科學(xué)研究方法等集中學(xué)科的綜合性課程，可以在網(wǎng)絡(luò)上從多方面來反映藥物作用于疾病的機(jī)制。這不但與中醫(yī)學(xué)辨證論治的主要思路相符合，還與中醫(yī)方劑多種成分作用于多個(gè)疾病靶點(diǎn)的特點(diǎn)相吻合。故而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)中藥相關(guān)科學(xué)內(nèi)涵、新藥研發(fā)、發(fā)展中醫(yī)藥理論等有支持作用。

因此，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法，對(duì)“金銀花-連翹”的成分及其作用靶點(diǎn)進(jìn)行研究，從整體觀分析“金銀花-連翹”[2]調(diào)治流感的分子機(jī)制，為后續(xù)研究提供些許新思路。

1 材料與方法

1.1 “金銀花-連翹”靶點(diǎn)篩選 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)[3]。從中檢索“金銀花”“連翹”，獲得主要活性成分及作用靶點(diǎn)。設(shè)定篩選條件：口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18。將篩選結(jié)果信息進(jìn)行規(guī)范(使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù))。

1.2 流感相關(guān)靶點(diǎn)篩選 關(guān)鍵詞“influenza”，通過OMIM、GKB、GeneCards等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，獲取相關(guān)基因，繪制相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖，去重后得到流感靶點(diǎn)。

1.3 “金銀花-連翹”成分-流感靶點(diǎn)圖構(gòu)建 構(gòu)建“金銀花-連翹”成分-流感靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，使用CytoScape 3.8.0，并分析有效成分、靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，判斷核心靶點(diǎn)。

1.4 “金銀花-連翹”成分-流感靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)建立 用R語言將流感靶點(diǎn)對(duì)接“金銀花-連翹”作用靶點(diǎn)，可得“金銀花-連翹”活性成分治療流感潛在作用靶點(diǎn)，繪韋恩圖。分析潛在作用靶點(diǎn)蛋白間的相互作用，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)[4]將生物種類設(shè)定“Homo sapiens”，“highest confidence”即最小互相作用閾值(0.900)，其余不變。通過CytoNA插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行集中性分析、評(píng)估，得到網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.5 “金銀花-連翹”成分-流感靶點(diǎn)功能與通路富集分析 R語言安裝Bioconductor中數(shù)據(jù)包，得到GO富集、KEGG富集和富集結(jié)果可視化繪圖。

1.6 分子對(duì)接 使用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)檢索主要活性成分，下載相應(yīng)的SDF文件。ChemBio3D Ultra 14.0軟件將下載結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)為3D。PDB數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索“金銀花-連翹”成分-流感靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)，可得蛋白晶體結(jié)構(gòu)，下載PDB格式。所得結(jié)構(gòu)使用Pymol進(jìn)行優(yōu)化。用iGemdock找出最佳受體與配體，所得結(jié)果使用R語言繪熱圖。用軟件Autodock vina 1.1.2進(jìn)行半柔性對(duì)接，對(duì)結(jié)合能最低構(gòu)象進(jìn)行分析，用Pymol繪圖。

2 結(jié)果

2.1 “金銀花-連翹”活性成分、作用靶點(diǎn)獲取 設(shè)置口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18，通過TCMSP篩選“金銀花-連翹”有效活性成分，去重得到43個(gè)成分。通過Uiprot數(shù)據(jù)庫(kù)限定物種為人后進(jìn)行檢索，“金銀花-連翹”潛在作用靶點(diǎn)278個(gè)。

2.2 流感相關(guān)靶點(diǎn)獲取 關(guān)鍵詞“influenza”在GeneCards、OMIM、TTD、GKB數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，物種設(shè)定“Homo sapiens”，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)得到771個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，檢索OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)得到2個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，檢索TTD數(shù)據(jù)庫(kù)得到25個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，檢索GKB數(shù)據(jù)庫(kù)得到10個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，檢索DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)得到6個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。將得到的結(jié)果繪制韋恩圖，見圖1。剔除重復(fù)靶點(diǎn)，獲得794個(gè)與“influenza”相關(guān)的靶點(diǎn)。

圖1 流感相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)韋恩圖

2.3 “金銀花-連翹”成分-流感靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 通過CytoScape 3.8.0繪“金銀花-連翹”成分-流感靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2(封三)。使用內(nèi)置的CytoNA插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析，得核心活性成分、作用靶點(diǎn)。上述網(wǎng)絡(luò)分析表明，“金銀花-連翹”調(diào)治流感的成分連接度前5位包括：槲皮素(quercetin)網(wǎng)絡(luò)圖中連接度34，介度6 447.039，緊密度0.516；木犀草素(luteolin)網(wǎng)絡(luò)圖中連接度19，介度2 463.766，緊密度0.476；芹黃素(apigenin)網(wǎng)絡(luò)圖中連接度19，介度2 774.947，緊密度0.476；烏索酸(ursolic acid)網(wǎng)絡(luò)圖中連接度16，介度2 165.769，緊密度0.45；漢黃芩素(wogonin)網(wǎng)絡(luò)圖中連接度13，介度1 592.857，緊密度0.460。

2.4 “金銀花-連翹”成分-流感靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)建立 將上述篩選所得活性成分靶點(diǎn)與流感靶點(diǎn)取交集，繪韋恩圖，得56個(gè)靶點(diǎn)，見圖3。靶點(diǎn)提交STRING 11.0平臺(tái)，獲取相應(yīng)PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖4。通過R語言對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)所得的數(shù)據(jù)根據(jù)連接度(Degree)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯妶D5。結(jié)果可得主要靶點(diǎn)為白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、轉(zhuǎn)錄因子P65(RELA)、絲裂原蛋白活化激酶14(mitogen-activated protein kinase14,MAPK14)、JUN。

圖3 “金銀花-連翹”成分-流感靶點(diǎn)韋恩圖

2.5 “金銀花-連翹”成分-流感靶點(diǎn)功能與通路富集分析 “金銀花-連翹”與流感共同靶點(diǎn)47個(gè)，使用R語言Bioconductor安裝包，設(shè)定程序以pvalueCutoff=0.05、qvalueCutoff=0.05作為條件分析，得到基因本體論(gene ontology,GO)功能富集、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集結(jié)果前10條內(nèi)容并將該內(nèi)容可視化繪圖。KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果中得多個(gè)靶點(diǎn)功能與流感緊密相關(guān)。藥對(duì)參與生物學(xué)過程主要為對(duì)脂多糖應(yīng)答過程、對(duì)細(xì)菌起源分子的應(yīng)答過程、細(xì)胞對(duì)生物刺激的應(yīng)答過程等。調(diào)節(jié)功能主要富集于細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性等。參與通路有晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products,AGE)-糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of AGE,RAGE)信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號(hào)通路等，同時(shí)從富集結(jié)果中可看出，相關(guān)活性成分還與乙型肝炎、甲型流感、耶爾森菌感染、恰加斯病等疾病相關(guān)，詳細(xì)結(jié)果見圖6、圖7。相關(guān)靶點(diǎn)的通路富集結(jié)果見表1。

2.6 分子對(duì)接結(jié)果 PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“金銀花-連翹”成分-流感靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖5個(gè)主要活性成分，獲得對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)。ChemBio3D Ultra 14.0軟件上述獲得結(jié)構(gòu)進(jìn)行構(gòu)建，形成3D。PDB數(shù)據(jù)庫(kù)檢索PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到的5個(gè)治療關(guān)鍵靶點(diǎn)，獲得蛋白晶體結(jié)構(gòu)并下載。Pymol對(duì)蛋白晶體優(yōu)化。iGemdock軟件對(duì)接有效成分小分子和關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)，結(jié)果繪制熱圖，見圖8(封三)。根據(jù)排序可知有效成分槲皮素(quercetin)與JUN結(jié)合最好。Autodock vina 1.1.2行半柔性對(duì)接，驗(yàn)證作用力最低結(jié)合模式，Pymol繪圖，分析表明槲皮素和JUN形成4個(gè)氫鍵，連接的氨基酸殘基為ARG-421、ARG-430、HIS-420、LYS-434，氫鍵用黃色表示長(zhǎng)度分別為1.9、2.3、2.3、2.1，見圖9(封三)。

表1 “金銀花-連翹”治療流感靶點(diǎn)通路富集結(jié)果

圖4 “金銀花-連翹”-流感靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

圖6 金銀花-連翹治療流感的基因本體論富集分析barplot圖

圖7 京都基因與基因組百科全書通路富集分析dotplot圖

3 討論

流感是一種可在全世界范圍內(nèi)爆發(fā)的呼吸道疾病，每年5%～10%成人和20%～30%兒童患病，其中大多為輕癥，也出現(xiàn)重癥400萬例和死亡病例50萬左右[5-6]。在我國(guó)關(guān)于流感的研究中，我國(guó)北方省份，遼寧省(2012～2017)12月份至次年3月份流感高發(fā)，表現(xiàn)為冬春季單一年度高峰模式[7-8]。山東省濟(jì)南市(2010～2017)除2011年出現(xiàn)1次夏季7～8月份小流行外，其他年份1月、12月多見[9]。西藏自治區(qū)(2013～2016)流感流行季節(jié)性為冬、春、夏季節(jié)[10]。我國(guó)南方省份，長(zhǎng)江流域的江蘇省(2009～2015)流感每年在1～3月和7～10月存在高峰期[11-13]?？梢娏鞲辛餍行詮?qiáng)，對(duì)人民身體健康造成危害。在年齡段中，甲型流感病例的年齡相對(duì)偏小，乙型流感病例的年齡相對(duì)大[14]。

流感屬于中醫(yī)“時(shí)行感冒”“重傷風(fēng)”“溫病”等范疇，具有較強(qiáng)的傳染性及流行性，且易于傳變。其發(fā)病機(jī)制多由于時(shí)邪疫毒流行，人體正氣不足，御邪不力，邪毒乘虛入里所致，在疾病初期以外感風(fēng)邪表證為主，風(fēng)熱毒邪由口鼻而入，侵犯肺衛(wèi)，使肺氣失宣，衛(wèi)氣不暢，出現(xiàn)發(fā)熱、咽痛等一系列全身癥狀。“金銀花-連翹”此藥對(duì)為治療溫病初起經(jīng)典方劑銀翹散之君藥，同時(shí)也是治療甲型流感的新中藥“金花清感方”的重要藥味，其中金銀花性甘、微苦，清香，辛，寒。歸肺、胃、心、大腸經(jīng)。連翹性平、味苦。入心、肝、膽經(jīng)。兩者同用，共奏疏散風(fēng)熱，清熱解毒之功，透散風(fēng)熱表邪的同時(shí)亦可辟穢化濁?！端貑枴ぶ琳嬉笳撈吩疲骸帮L(fēng)淫于內(nèi)，治以辛涼，佐以苦甘”，“金銀花-連翹”依據(jù)此而治，對(duì)流感病溫邪犯肺，熱郁肌腠，肺衛(wèi)失宣者尤宜，故而金銀花、連翹抗病毒效用較為確切。同時(shí)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金銀花總黃酮、綠原酸等具有顯著的抗炎作用[15]，體外試驗(yàn)結(jié)果證明金銀花提取物抑制一氧化氮釋放，降低IL-6、IL-1β炎癥因子的釋放[16]。同時(shí)試驗(yàn)研究表明，連翹水提取物、乙醇提取物、揮發(fā)油等有抗炎活性，其相關(guān)活性單體成分如連翹酯苷、連翹苷及槲皮素等也被證明在有較好抗炎作用[17]。

為了更明確“金銀花-連翹”治療流感的作用機(jī)制，為“金銀花-連翹”的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，本次研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法來進(jìn)行分析。通過在TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索“金銀花”“連翹”篩選分析得到5個(gè)主要成分包括槲皮素、木犀草素、芹黃素、烏索酸、漢黃芩素，以槲皮素為主要成分，研究表明其具有抗炎效果可以抑制炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌，同時(shí)能夠有效降低支氣管高反應(yīng)[18-19]，對(duì)癥治療流感有較好的作用；體外試驗(yàn)結(jié)果表明，木犀草素能使流感相關(guān)基因表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡減低，從而抑制流感病毒[20]。

通過構(gòu)建“金銀花-連翹”成分-流感靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析得到“金銀花-連翹”主要作用的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)為IL-6、JUN、IL-1β、MAPK14、RELA。IL-6可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，其基因編碼的IL-6可對(duì)宿主免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、血細(xì)胞生成和癌發(fā)生進(jìn)行調(diào)節(jié)。c-jun表達(dá)水平多數(shù)正常細(xì)胞中低，可在炎癥介質(zhì)、炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子刺激作用下激活，激活后可再去激活其他介質(zhì)、細(xì)胞因子，在流感的發(fā)病中起重要作用[21]。且目前有研究表明，流感患者氣道平滑肌細(xì)胞的原癌基因c-jun表達(dá)增強(qiáng)，證明c-jun基因表達(dá)是氣道平滑肌細(xì)胞增殖的早期表現(xiàn)之一[22]。由此可見c-jun基因與流感相關(guān)度高。IL-1β具有多種生物學(xué)效應(yīng)，是機(jī)體一種重要的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道在IL-1β基因5′區(qū)發(fā)現(xiàn)有3個(gè)高頻SNP位點(diǎn)，并且3個(gè)位點(diǎn)之間存在明顯的連鎖不平衡性[23]。研究發(fā)現(xiàn)MAPK家族對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及分化進(jìn)行調(diào)控，在應(yīng)激反應(yīng)如炎癥、細(xì)胞凋亡等反應(yīng)中有重要地位[24]。RELA基因編碼的宿主蛋白在H5/S誘發(fā)更強(qiáng)的宿主先天性免疫反應(yīng)方面起到關(guān)鍵作用，RELA基因編碼轉(zhuǎn)錄因子P65蛋白，是構(gòu)成核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)轉(zhuǎn)錄因子亞基之一，NF-κB信號(hào)通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、病毒感染免疫應(yīng)答等反應(yīng)的重要通路[25]。

KEGG富集結(jié)果顯示代謝通路包括AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等。AGE-RAGE信號(hào)通路與IL-1β、TNF-α含量相關(guān)[26]，根據(jù)最新發(fā)現(xiàn)高遷移率組蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)是重要晚期炎癥因子，主要存在于真核生物細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)炎癥細(xì)胞受到刺激或是內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，可通過AGE-RAGE信號(hào)通路釋放至胞外[27]。IL-17信號(hào)通路是重要的炎性反應(yīng)通路，誘導(dǎo)分泌IL-17，同時(shí)還與IL-17F、IL-21、IL-22的分泌有關(guān)[28]。TNF信號(hào)通路也與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、炎性和免疫反應(yīng)密切相關(guān)，其作用有調(diào)節(jié)炎癥、免疫和支氣管平滑肌[29-30]。

除此之外，根據(jù)富集結(jié)果顯示“金銀花-連翹”適用于甲型流感的治療，同時(shí)還可以應(yīng)用于乙型肝炎、耶爾森菌感染、恰加斯病等疾病的治療中，這表明“金銀花-連翹”可治療的疾病種類還有待繼續(xù)挖掘，為未來研究“金銀花-連翹”的臨床應(yīng)用提供新思路。

本次研究結(jié)果表明“金銀花-連翹”在治療流感過程中，相同化合物可對(duì)多個(gè)不相同靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，而相同的靶點(diǎn)又可以對(duì)不相同的信號(hào)通路、物學(xué)過程進(jìn)行干預(yù)。這與中藥的“異病同治”“辨證施治”有異曲同工之處，可以為臨床用藥提供思路。而本研究未考慮煎煮中藥時(shí)及煎煮后藥物發(fā)生的反應(yīng)，藥物進(jìn)入人體后產(chǎn)生的反應(yīng)也未進(jìn)行研究，日后有待進(jìn)行補(bǔ)充研究。