楊宏偉，樊一筍(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇州九龍醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州 215021)

D-二聚體是纖維蛋白在纖溶酶作用下水解后的產(chǎn)物，人體內(nèi)存在纖維蛋白高凝狀態(tài)或者繼發(fā)性纖維蛋白溶解亢進(jìn)都會(huì)引起D-二聚體升高，因此，D-二聚體指標(biāo)對(duì)于診斷和治療血栓疾病具有很好的臨床價(jià)值[1-2]。目前檢測(cè)D-二聚體方法大多為免疫法，具有檢測(cè)方便、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[3]。但在臨床應(yīng)用中，會(huì)出現(xiàn)D-二聚體檢測(cè)結(jié)果與臨床不相符，影響因素主要有自身免疫干擾和外界的干擾。目前針對(duì)免疫法報(bào)道較多的干擾物質(zhì)有異嗜性抗體(heterophile antibody, HA)、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor, RF)等[4]，但之前極少文獻(xiàn)對(duì)于人群中出現(xiàn)的D-二聚體干擾情況進(jìn)行一個(gè)長(zhǎng)時(shí)段及大樣本量的檢測(cè)及分析，并由于主流試劑廠家大都通過(guò)阻斷方案對(duì)標(biāo)本進(jìn)行了處理，無(wú)法系統(tǒng)評(píng)估當(dāng)前人群的樣本干擾分布狀況[5]?；诖?，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇州九龍醫(yī)院檢驗(yàn)科和蘇州?？?SysCan)公司合作，通過(guò)定制無(wú)抗干擾能力的試劑進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)段的足量樣本篩選。在篩選收集出現(xiàn)干擾的人群及對(duì)應(yīng)的信息后，探討臨床檢驗(yàn)中此類現(xiàn)象的出現(xiàn)頻率以及可能的原因。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇州九龍醫(yī)院檢驗(yàn)科2020年4月至2020年8月間住院患者凝血測(cè)試樣本，排除近期進(jìn)行免疫抗體治療者。用0.109 mol/L枸櫞酸鈉1∶9抗凝新鮮靜脈血，3 000 r/min離心15 min。

1.2試劑和儀器 測(cè)試試劑：為不含阻斷劑的D-二聚體檢測(cè)試劑，為蘇州希肯公司按照我科要求定制，參考區(qū)間0～0.5 mg/L(FEU)；正常試劑：含有阻斷劑的D-二聚體檢測(cè)市售試劑，參考區(qū)間0～0.5 mg/L(FEU)，購(gòu)自蘇州希肯公司；復(fù)測(cè)試劑：INNOVANCE-D-Dimer試劑盒(西門子公司)；N Latex RF Kit(免疫比濁法，西門子公司)。Ci-300血凝儀(蘇州希肯公司)，CS5100血凝儀(日本Sysmex公司)，BN ProSpec特定蛋白分析儀(西門子公司)。

1.3方法

1.3.1D-二聚體檢測(cè)及假陽(yáng)性篩選 將凝血檢測(cè)樣本先用D-二聚體測(cè)試試劑和正常試劑在Ci-300血凝儀上用乳膠增強(qiáng)透射比濁法同時(shí)進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)2種D-二聚體試劑定性結(jié)果不一致時(shí)，使用復(fù)核試劑在CS5100血凝儀上用乳膠增強(qiáng)透射比濁法對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行第三方復(fù)測(cè)，參考區(qū)間為0～0.55 mg/L(FEU)。對(duì)于測(cè)試試劑陽(yáng)性，正常試劑和復(fù)測(cè)試劑均陰性的結(jié)果，認(rèn)為是疑似假陽(yáng)性。

由于干擾物質(zhì)在稀釋時(shí)對(duì)結(jié)果的影響通常不呈線性變化，因此，在驗(yàn)證疑似假陽(yáng)性結(jié)果時(shí)將血漿4倍、8倍、16倍、32倍、64倍稀釋后分別再次測(cè)試D-二聚體，在排除hook效應(yīng)的情況下，如標(biāo)本稀釋前D-二聚體測(cè)試值和稀釋后測(cè)試值基本保持一致，說(shuō)明該標(biāo)本不存在干擾現(xiàn)象，不含有對(duì)測(cè)試產(chǎn)生干擾的物質(zhì)；如稀釋后D-二聚體測(cè)試值相對(duì)稀釋前測(cè)試值，隨著稀釋比例的增加呈明顯的下降趨勢(shì)，說(shuō)明此樣本為假陽(yáng)性樣本。

1.3.2RF測(cè)定 用免疫比濁法在BN ProSpec特定蛋白分析儀上檢測(cè)，參考區(qū)間為<15.9 IU/mL。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用MedCal 15.8統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同試劑檢測(cè)D-二聚體結(jié)果 共測(cè)試患者樣本6 436例，其中剔除135例重復(fù)樣本后，共6 301例納入研究。測(cè)試試劑檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性的樣本為1 043例，陽(yáng)性率為16.55%；正常試劑檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性的樣本為99例，陽(yáng)性率為1.57%，陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.618，P<0.001)。

測(cè)試試劑與正常試劑檢測(cè)均陽(yáng)性的為41例，測(cè)試試劑陽(yáng)性、正常試劑陰性的為1 002例，測(cè)試試劑陰性、正常試劑陽(yáng)性的為58例。1 002例測(cè)試試劑陽(yáng)性、正常試劑陰性樣本經(jīng)過(guò)復(fù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中有921例為陰性，作為疑似假陽(yáng)性樣本，對(duì)于疑似假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行梯度稀釋進(jìn)一步復(fù)測(cè)，最終確定假陽(yáng)性樣本共59例(占0.94%)。

2.2假陽(yáng)性樣本不同試劑檢測(cè)D-二聚體結(jié)果比較 59例患者樣本中，復(fù)測(cè)試劑檢測(cè)值范圍為0.05～0.54 mg/L；測(cè)試試劑檢測(cè)值范圍為0.04～0.53 mg/L。測(cè)試試劑檢測(cè)結(jié)果隨稀釋度增大而降低，說(shuō)明樣本明顯存在干擾，為假陽(yáng)性樣本。見(jiàn)表1。

表1 ?？虾臀鏖T子公司試劑D-二聚體檢測(cè)不同稀釋度檢測(cè)結(jié)果[中位數(shù)(第25百分位數(shù)，第75百分位數(shù))，mg/L]

2.3假陽(yáng)性樣本基線資料 59例假陽(yáng)性樣本中，男性25例，女性34例；40歲以下7例，40～60歲14例，38例為60歲以上；常見(jiàn)疾病類型：炎癥30例(慢性腎炎8例，胃炎15例，過(guò)敏2例，急性胰腺炎3例，其他2例)，高血壓24例。見(jiàn)表2。

表2 假陽(yáng)性樣本的基線資料(n=59)

3 討論

目前市面上主要使用乳膠免疫增強(qiáng)比濁法在凝血分析儀上進(jìn)行D-二聚體的測(cè)試[6-7]。作為均相免疫法的檢測(cè)方案，較易出現(xiàn)由樣本所造成的檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性，這種假陽(yáng)性是臨床工作中所出現(xiàn)的一種重要的不可控因素[8]。出現(xiàn)假陽(yáng)性樣本可能原因是內(nèi)源性干擾因素如自身抗體、HA、人抗動(dòng)物抗體以及一些結(jié)合蛋白等[9]。在接觸某些動(dòng)物或使用了動(dòng)物源性制劑后，動(dòng)物源性蛋白進(jìn)入人體，機(jī)體對(duì)動(dòng)物蛋白引起免疫應(yīng)答，形成人抗動(dòng)物免疫球蛋白，有IgG、IgA、IgM和IgE幾種類型[10]。不同制劑使用的動(dòng)物源性不同，目前報(bào)道存在循環(huán)抗性的抗體，涉及到的動(dòng)物廣泛，比如小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、牛等，不同動(dòng)物免疫球蛋白分子間蛋白質(zhì)序列有大量同源性，因此抗動(dòng)物抗體可與多種動(dòng)物免疫球蛋白交叉反應(yīng)。當(dāng)使用的制劑存在同源蛋白抗性時(shí)，存在的干擾效果很明顯[11]。HA通常包含天然抗體和因接觸未知?jiǎng)游锒a(chǎn)生的自身抗體，同人抗動(dòng)物抗體一樣屬于內(nèi)源性抗體，兩者具有同源性，不同在于HA無(wú)明確的免疫原性，能夠與多個(gè)物種免疫球蛋白結(jié)合，即使在健康人群中約有3%～15%體內(nèi)含有HA[12]。

本研究數(shù)據(jù)顯示，發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性的出現(xiàn)在男性與女性間并無(wú)顯著差別。隨著年齡的增長(zhǎng)，干擾情況的發(fā)生率顯著增高，確認(rèn)的干擾樣本中有64.4%的干擾病例出現(xiàn)在60歲以上的人群。可見(jiàn)近年來(lái)，臨床檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性的標(biāo)本情況逐年增多，和人口的老齡化這一因素密不可分。

對(duì)出現(xiàn)干擾的病人進(jìn)行病癥統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)炎癥的占比最高，達(dá)到50.8%，說(shuō)明持續(xù)性的慢性炎癥尤其是消化道炎癥，可能是造成一些HA或者自身抗體出現(xiàn)的主要誘因之一。在臨床檢驗(yàn)工作中，需要對(duì)無(wú)血栓指征的炎癥病人標(biāo)本所出現(xiàn)的高值D-二聚體結(jié)果或是其他的異常免疫學(xué)反應(yīng)結(jié)果保持足夠的警惕，充分考慮出現(xiàn)干擾的可能性。

文獻(xiàn)報(bào)道，免疫測(cè)試過(guò)程中出現(xiàn)假陽(yáng)性的主要影響因素為獨(dú)特性抗體和自然產(chǎn)生或自身免疫源性的RF[13]，但本研究篩查結(jié)果顯示，干擾樣本中RF因子升高樣本的占比反而不高，僅僅只有16.9%，同時(shí)假陽(yáng)性樣本中診斷疾病為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的占比也相對(duì)較低。相比之下，占比較高的以炎癥為指征的患者則可能說(shuō)明臨床檢驗(yàn)中標(biāo)本現(xiàn)階段的干擾來(lái)源或許更多地來(lái)自HA、人抗動(dòng)物抗體或者一些特定的結(jié)合蛋白。

為了盡可能排除內(nèi)源性干擾的問(wèn)題，各試劑生產(chǎn)廠商在試劑中會(huì)加入阻斷劑。研究表明，西門子INNOVANCE D-Dimer試劑和D-Dimer PLUS試劑比較，不確定是否存在HA等的內(nèi)源性因素影響時(shí)，隨著RF水平越高，前者的干擾更明顯[14]。其他干擾因素如脂血和交叉反應(yīng)、基質(zhì)效應(yīng)以及設(shè)備的性能等都會(huì)引起結(jié)果的升高或者降低[15]。本次測(cè)試所使用的西門子和?？仙锏腄-二聚體試劑也針對(duì)此類因素有對(duì)應(yīng)的解決方案，提升設(shè)備性能及提高測(cè)試值的準(zhǔn)確性。西門子試劑在RF值較高時(shí)，干擾排除不完全，但在樣本進(jìn)行4倍稀釋后能完全阻斷；?？显噭?duì)RF阻斷較好，當(dāng)存在其他干擾因素時(shí)，也存在不能完全阻斷的情形，但樣本進(jìn)行4倍稀釋后也能完全阻斷。雖然2種試劑都出現(xiàn)了未能完全阻斷的情形，但是從現(xiàn)有的阻斷后結(jié)果來(lái)看，基本不影響臨床的診斷。但若試劑無(wú)阻斷效果或者阻斷能力較弱，那么其檢測(cè)結(jié)果則會(huì)給臨床的診斷帶來(lái)較大的困擾。

干擾因素所造成的假陽(yáng)性結(jié)果會(huì)引起臨床對(duì)疾病的誤診誤判甚至錯(cuò)誤的治療，因此臨床和實(shí)驗(yàn)室都必須對(duì)免疫中的干擾因素給予足夠的重視。通過(guò)仔細(xì)閱讀試劑廠家的說(shuō)明書及和試劑廠家的積極溝通，明確試劑的抗干擾能力，同時(shí)在出現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果與臨床征象不符時(shí)，臨床醫(yī)師與檢驗(yàn)醫(yī)師應(yīng)該及時(shí)、充分、有效和持續(xù)的溝通；通過(guò)進(jìn)行樣本的多倍稀釋方案以及病人的多種資料信息去積極分析干擾的可能因素，并采取適當(dāng)方案重新檢測(cè)，得出正確的結(jié)果。