徐倩,陳定強(. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，廣州5040；. 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗科，廣州5080)

腸球菌是醫(yī)院感染常見的條件致病菌之一，可導(dǎo)致菌血癥、腹腔內(nèi)感染，多見尿路感染[1]。由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，腸球菌耐藥率居高不下。因此，治療腸球菌依賴于萬古霉素，而腸球菌對萬古霉素的耐藥性在世界范圍內(nèi)不斷增加[2]。近年來，盡管中國耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistant Enterococcus, VRE)的流行率較歐美地區(qū)低，但仍有不少報道[3]。并且VRE還可以將萬古霉素耐藥性轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌如金黃色葡葡球菌[4]。本研究從基因組水平上分析1株耐萬古霉素屎腸球菌(vancomycin-resistantEnterococcusfaecium, VREfm)EFM277的多重耐藥表型，并闡明其耐藥機制和流行病學(xué)特點，為臨床用藥和院感防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株鑒定及藥敏試驗 VREfm菌株EFM277來自2021年廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院患者的尿液標(biāo)本。分離菌株置于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基在37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，用Vitek? MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)進行鑒定，并用Vitek Compact藥敏分析儀進行藥敏試驗，質(zhì)控菌株為糞腸球菌ATCC29212、金黃色葡萄球菌ATCC29213等。藥敏結(jié)果判斷參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)M100第31版。

1.2高通量測序以及數(shù)據(jù)拼接 用細(xì)菌DNA提取試劑盒(Qiagen公司)進行EFM277的總DNA提取，使用Nanodrop核酸定量分析儀進行濃度和純度測定。將提取的DNA隨機打斷，電泳回收所需長度的DNA片斷，并加上接頭進行cluster制備，用Illumina Hiseq平臺進行150×2的paired-end高通量測序(華大基因公司)。運用SOAPdenovo(版本：2.04)短序列組裝軟件對處理后的reads數(shù)據(jù)進行組裝。

1.3生物信息學(xué)分析 使用Resfinder網(wǎng)站分析位于contigs的耐藥基因，利用MLST 2.0進行多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)分析，利用VirulenceFinder 2.0分析EFM277的毒力基因，用RAST工具對contigs進行注釋，并用BLAST工具在線分析主要的耐藥基因。

2 結(jié)果

2.1藥敏試驗結(jié)果 EFM277藥敏結(jié)果顯示為耐萬古霉素腸球菌，只對利奈唑胺、替加環(huán)素和高水平慶大霉素敏感，其余均耐藥(表1)。

表1 屎腸球菌EFM277藥敏試驗結(jié)果

2.2高通量測序和數(shù)據(jù)分析 高通量測序得到2 752 476條reads，通過過濾和拼接后共獲得721條contigs，最長contig長為137 372 bp，N5為42 602 bp，平均contig長度為3 818 bp，GC含量為38.5%。

使用ResFinder網(wǎng)站對contigs進行耐藥基因分析，發(fā)現(xiàn)EFM277 DNA全序列中存在多種耐藥相關(guān)基因(表2)。其中，編碼氨基糖苷類耐藥基因包括aac(6′)-Ii、aph(3′)-Ⅲ、aac(6′)-aph(2′′)；四環(huán)素耐藥基因tetM；大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因包括msrC、ermB；糖肽類耐藥基因vanA、vanM。

表2 屎腸球菌EFM277相關(guān)耐藥基因分析

2.3耐藥基因遺傳環(huán)境分析 使用ResFinder工具進行分析，發(fā)現(xiàn)C6、C17、C32、C100、C105、C121、C134 等9個contigs攜帶耐藥基因(圖1)。其中C17攜帶tet(M)，其上游是一個Tn916轉(zhuǎn)座子，這與之前的報道相一致[5]。C32攜帶aac(6′)-Ii，其下游是編碼轉(zhuǎn)座酶的基因tnp，推測可以介導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)座。C105上攜帶2個耐藥基因分別是erm(B)、aph(3′)-Ⅲ，在erm(B)上游也有一個Tn916轉(zhuǎn)座子，可介導(dǎo)其轉(zhuǎn)座。C121、C134分別攜帶耐萬古霉素的vanA、vanM，其上下游均有vanX(降解D-Ala-D-Ala的水解酶)、vanH(產(chǎn)生d-Lac的脫氫酶)。vanA、vanM同時存在VRE中比較罕見[6-7]。在C154上發(fā)現(xiàn)與vanA型有關(guān)的vanR，在C123上發(fā)現(xiàn)與vanM型相關(guān)的vanR和vanS。

圖1 攜帶耐藥基因的contigs分析

2.4MLST分析 服務(wù)器提取adk、atpA、ddl、gdh、gyd、pstS、purK等管家基因所在的contigs上的序列，發(fā)現(xiàn)EFM277與ST17型在ddl基因存在3個堿基的差異，見表3。

表3 EFM277多位點序列分型(MLST)分析

2.5毒力基因分析 對基因組測序的數(shù)據(jù)進行毒力基因分析，發(fā)現(xiàn)其攜帶acm、esp、hyl3種毒力基因。見表4。

表4 EFM277攜帶的主要毒力基因

3 討論

近十年內(nèi)，VRE在中國的各大醫(yī)療機構(gòu)流行程度呈顯著性增高[8]，并且腸球菌可在環(huán)境中長期存在,尤其是醫(yī)療環(huán)境中[9]，因此VRE成為臨床環(huán)境中的一個主要問題,對VRE的耐藥基因及流行病學(xué)分析意義重大。

迄今為止，腸球菌中已鑒定出9種萬古霉素耐藥基因型(vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM和vanN)，其中vanA、vanB基因型在世界范圍內(nèi)占主導(dǎo)地位[2]。不同的耐藥基因型對萬古霉素和替考拉寧的耐藥程度不同，由于vanA型的VRE產(chǎn)生肽聚糖前體末端為D-alanyl-D-lactate，使萬古霉素不能與之結(jié)合[10]，但細(xì)菌仍然能夠合成其細(xì)胞壁。vanA型的耐藥特點是對萬古霉素和替考拉寧均具有高水平耐藥[11]，這也與本文藥敏結(jié)果吻合；vanB型對替考拉寧敏感，但對萬古霉素具有不同程度耐藥；而vanC1、vanC2/3型常見于鶉雞腸球菌、鉛黃腸球菌中，屬于對萬古霉素天然耐藥[12]。vanM與vanA同源性最高[13]，也能產(chǎn)生D-alanyl-D-lactate，表現(xiàn)出vanA型菌株相似的耐藥表型，在2010年首次發(fā)現(xiàn)[13]，并且在上海vanM型比vanA型更為普遍[14]。盡管對萬古霉素敏感的屎腸球菌也攜帶vanM基因，但有研究證明其在長時間的萬古霉素治療中，可能會轉(zhuǎn)變成VRE[15]。本文研究的VREfm菌株EFM277同時攜帶vanA和vanM，此型是廣東省首次發(fā)現(xiàn)，之前僅北京[6]和南京[7]有報道過。

通過ResFinder對vanA和vanM的遺傳環(huán)境分析，發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥機制是通過van基因簇完成的，vanR和vanS二者組成調(diào)節(jié)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)耐藥基因簇的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。vanX對萬古霉素耐藥至關(guān)重要，其主要水解D-Ala-D-Ala，使后者轉(zhuǎn)變成D-Ala，而vanH將丙酮酸還原為D-Lac，其與D-Ala在vanA/vanM的催化下形成D-alanyl-D-lactate，最終可導(dǎo)致萬古霉素耐藥。van基因簇的結(jié)構(gòu)完整性，特別是功能基因vanH、vanM和vanX的結(jié)構(gòu)完整性，可能與產(chǎn)生耐藥的能力有關(guān)[16]。

除此之外，EFM277還攜帶msrC、ermB這類編碼紅霉素甲基化酶的基因,可導(dǎo)致對大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素、鏈陽菌素B(奎奴普汀-達(dá)福普汀)耐藥。而奎奴普汀-達(dá)福普汀常被用于治療VRE[17]，盡管藥敏試驗未包括此藥，但因耐藥基因的檢出，暫不考慮其作為首選藥物。從另一方面也證明耐藥基因檢測的重要性。

tetM是編碼核糖體保護蛋白基因，核糖體保護蛋白可賦予細(xì)菌對四環(huán)素的抗性[18]。有研究證明tetM與替加環(huán)素耐藥有關(guān)[19]。

通過耐藥基因分析發(fā)現(xiàn)EFM277攜帶氨基糖苷類耐藥基因aac(6′)-aph(2″)，其編碼的酶表現(xiàn)出對慶大霉素、阿米卡星等耐藥，但對鏈霉素敏感；aph(3′)-Ⅲ編碼的轉(zhuǎn)移酶對阿米卡星、妥布霉素耐藥，但對慶大霉素敏感。因此，屎腸球菌對于氨基糖苷類(除高水平耐藥檢測外)表現(xiàn)為天然耐藥，藥敏試驗結(jié)果顯示高水平慶大霉素(協(xié)同)敏感，表明其與氨芐西林、青霉素和萬古霉素可以出現(xiàn)聯(lián)合作用，但由于EFM277對青霉素MIC≥ 64 μg/mL以及對氨芐西林MIC≥32 μg/mL，可能會出現(xiàn)聯(lián)合協(xié)同作用不敏感現(xiàn)象。對萬古霉素和替考拉寧均耐藥的屎腸球菌首選的治療方案為利奈唑胺、 奎奴普丁-達(dá)福普丁, 可聯(lián)用多西環(huán)素, 單用氯霉素對有些菌血癥有效, 呋喃妥因和磷霉素用于治療泌尿系感染[20]。

在毒力基因方面，發(fā)現(xiàn)其攜帶esp、acm、hyl3種毒力基因。其中，esp編碼腸球菌表面蛋白，有助于腸球菌黏附、定植并在尿路中的形成生物被膜[21]；hyl為透明質(zhì)酸酶基因可促進細(xì)菌在結(jié)締組織內(nèi)傳播[22]。通常esp和hyl2個毒力基因與VRE導(dǎo)致醫(yī)院感染爆發(fā)有關(guān)[23]。acm能促進細(xì)胞壁錨定式膠原黏附[24]，給治療增加了困難。

由于僅對1株屎腸球菌EFM277進行高通量測序，分析其耐藥基因存在一定的局限性，尚需要更多同類菌株的數(shù)據(jù)來證實結(jié)論。此外，耐藥基因和耐藥機制存在一定的差異性，其耐藥機制還需更深入的研究和分析。

綜上所述，屎腸球菌EFM277攜帶多種耐藥基因，在國內(nèi)較為罕見。由于耐藥機制復(fù)雜多變,毒力基因的檢出給治療帶來極大的挑戰(zhàn)，同時也為治療和院感防控提供有力依據(jù)。