李 揚，楊 志，馬 英，任 靜

二尖瓣反流是左心室擴張并在Starling機制下心搏量增加，并通過左心室向低壓左心房射血促進心搏量增加[1]。盡管病人存在潛在的心肌細胞收縮障礙，這些有利于穩(wěn)定左室縮短動力學，提高左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)。因此，為了維持左室收縮功能和提高生存率，若病人LVEF<60%，建議進行二尖瓣成形手術[2-3]。然而，二尖瓣修復后左室收縮功能下降是一個危險因素，心肌細胞不可逆損傷機制尚未明確。目前，尚無有效的藥物可降低左心室重塑過程，而慢性二尖瓣反流病人特異性左心室心肌重塑機制尚未明確[4-6]。為了探討二尖瓣反流的分子特征，本研究分析左室功能異常二尖瓣反流病人MRI影像參數(shù)與肌脂蛋白(SLN)水平的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月—2019年2月在秦皇島第三醫(yī)院診治的50例二尖瓣反流病人為研究組、同期納入13名健康者為對照組，兩組均接受MRI影像檢查，嚴重單發(fā)性二尖瓣反流病人術前均行心導管插入術。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核。

1.2 病人納入與排除標準

1.2.1 納入標準 年齡25～76歲；繼發(fā)于二尖瓣退行性疾病的嚴重單發(fā)二尖瓣反流，建議二尖瓣矯成形手術的病人；經超聲心動圖/多普勒檢查證實為嚴重的單發(fā)性二尖瓣反流；均簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準 阻塞性冠狀動脈疾病(冠狀動脈狹窄>50%)；主動脈瓣疾病或伴發(fā)二尖瓣狹窄的病人。

1.3 方法

1.3.1 心臟MRI 使用1.5T的MRI掃描儀(Sigma GE Healthcare，密爾沃基，WI)并優(yōu)化調試為心臟磁共振成像。通過計算左心室每個短軸切片集合的等高線輪廓總和確定體積[7-9]。

1.3.2 免疫組織化學 二尖瓣反流樣本來源于研究組病人手術時的心肌組織材料，正常樣本由第三方實驗室提供，制成5 μm厚度的石蠟切片后，在二甲苯溶液中脫蠟并在梯度稀釋的乙醇中水化恢復。使用含有5%正常血清封閉后，切片用SLN抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc，CA，1∶100稀釋)；室溫孵育1 h后，使用Alexa熒光偶聯(lián)的二抗(分子探針，Eugene，OR，1∶200稀釋)再次室溫孵育1 h。使用含DAPI的Vectashield Mounting培養(yǎng)基進行核染色計數(shù)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)。使用預裝Simple PCI軟件的徠卡DM6000熒光顯微鏡(Compix，Inc，Cranberry Township，PA)進行圖像采集和熒光強度測量。圖像進行適當?shù)谋尘盁晒庹{整。

1.3.3 免疫印跡法 總蛋白勻漿液來源于對照組正常組織樣本和二尖瓣反流病人組織樣本。3名健康者和4例二尖瓣反流病人左心室組織樣本在8%[SERCA2a和calsequestrin(CSQ)]或14% Tricine十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或16.5%甘油三醇凝膠上電泳分離，并轉移到硝化纖維素膜上。使用一抗(兔抗SLN為1∶3 000，兔抗SERCA2a為1∶5 000，抗兔CSQ為1∶500)，之后是hrp偶聯(lián)的二抗[10]。使用Super Signal West Dura底物(Pierce)檢測信號并用密度法定量并歸一化到CSQ表達水平。樣品緩沖液中的蛋白首先通過考馬斯亮藍染色，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，分別對SERCA和SLN進行免疫印跡法，使用相同的樣本，以CSQ和GAPDH作為內參。

2 結 果

2.1 對照組與研究組臨床資料比較(見表1)

表1 對照組與研究組臨床資料比較

2.2 對照組與研究組MRI影像學參數(shù)比較(見表2)

表2 對照組與研究組MRI影像學參數(shù)比較(±s)

2.3 典型病例的左心室雙腔圖像(見圖1)

圖1 典型病例的左心室雙腔圖像

2.4 免疫印跡法定量檢測SLN表達 免疫印跡法檢測顯示，研究組SLN表達高于對照組。采用Super Signal West Dura底物(Pierce)檢測信號并用密度法定量并歸一化到CSQ表達水平發(fā)現(xiàn)，研究組SLN表達較對照組增加。詳見圖2。

圖2 兩組SLN蛋白表達比較(A為SLN蛋白免疫印記圖像；B為SLN蛋白表達柱狀圖)

2.5 SLN免疫熒光染色 SLN免疫熒光染色結果顯示，研究組SLN表達較對照組增高。對照組SLN染色信號強度為(245.87±20.51)，研究組為(2 570.32±513.36)，兩組比較差異統(tǒng)計學意義(P<0.001)。詳見圖3。

圖3 兩組SLN免疫熒光染色比較(A為SLN的免疫熒光染色；B為SLN信號強度柱狀圖)

2.6 SLN免疫熒光染色強度與MRI影像學參數(shù)的相關性分析 對SLN免疫熒光染色強度MRI影像學參數(shù)進行相關性分析，結果顯示SLN免疫熒光染色強度(2 570.32±513.36)與LVEDV、LVESV、LVSV、LVMI、LVEDD、LVESD、LVEDD(球狀化指數(shù))、LVESD(球狀化指數(shù))呈正相關。詳見表3。

表3 SLN免疫熒光染色強度與MRI影像學參數(shù)的相關性分析

3 討 論

二尖瓣反流是臨床常見的心臟瓣膜疾病，病程進展可能導致肺動脈高壓、心力衰竭、心房顫動等，嚴重者甚至死亡。SLN位于內質網膜上，是由31個氨基酸組成的蛋白質，主要在骨骼肌、心肌細胞中表達[11]。有研究顯示，SLN參與乳腺癌等疾病的發(fā)生和發(fā)展，但其在心血管疾病中作用的研究較少[8，12]。SLN通常在心房中高表達，在心室中低表達或檢測不到[8]。SLN在正常和病變心肌的人類或動物模型中作用差異尚不明確。

相關研究表明，SLN通過降低SERCA2a的Ca2+親和性，發(fā)揮調節(jié)功能[9-10]。Tako-Tsubo型心肌病病人中，SLN在功能失調的左心室出現(xiàn)急性表達升高，并在12 d恢復期后，LVEF恢復正常[13-14]。因此，二尖瓣反流病人心臟中SLN表達增加可能是腎上腺素驅動增加的早期代償性改變。SLN心室表達是否有害尚未明確，雖然處于較低表達水平，但保持著基礎水平。

本研究結果顯示，研究組與對照組LVEDV、LVESV、LVSV、LVMI、LVEDD、LVESD、LVEDD(球狀化指數(shù))、LVESD(球狀化指數(shù))比較，差異均有統(tǒng)計學意義。典型二尖瓣反流病人左心室雙腔圖像顯示明顯的左室擴張和心室壁變薄。通過MRI測定心室體積，病人左心室重塑程度是一致的。

本研究免疫印跡法定量檢測發(fā)現(xiàn)，研究組SLN表達染色信號強度高于對照組，同時免疫熒光染色結果顯示，研究組SLN蛋白表達較對照組增高，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。本研究發(fā)現(xiàn)二尖瓣反流病人SLN表達上調，通常認為是心房肌細胞特異性SERCA的調節(jié)，在調節(jié)單發(fā)二尖瓣反流病人左心室功能方面具有重要的意義。本研究對SLN免疫熒光染色強度與影像學參數(shù)進行相關性分析，結果顯示SLN免疫熒光染色強度與LVEDV、LVESV、LVSV、LVMI、LVEDD、LVESD、LVEDD(球狀化指數(shù))、LVESD(球狀化指數(shù))呈正相關。

綜上所述，SLN作為關鍵的心房調節(jié)因子在左室功能異常二尖瓣反流病人中顯著上調，且與MRI影像學參數(shù)具有相關性，可填補關于超負荷體積導致的心臟功能失調過程，尤其在腎上腺素增加的單發(fā)二尖瓣反流病人SLN表達。