李梓源，羅植允，馮晶晶，吳 偉

高血壓是以體循環(huán)動脈血壓(收縮壓和/或舒張壓)增高[收縮壓≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和/或舒張壓≥90 mmHg]為主要特征的心血管疾病，亦是心血管疾病中患病率較高的慢性疾病。長期高血壓將對人體心、腦、腎、血管等靶器官造成嚴重功能損害。我國高血壓具有患病率高及知曉率、治療率、控制率低特點[1]， 說明多數(shù)高血壓病人對身體健康狀況不甚了解或難以對病情進行控制或治療。目前臨床治療高血壓以西藥為主，西藥雖有較好的臨床療效，便于攜帶，方便服用，但長期服用降壓藥易產(chǎn)生耐藥性，且西藥有一定的副作用。中藥溫和，對肝腎毒副作用較小，亦有較好的臨床療效，因此，中藥對長期治療并維持血壓的穩(wěn)定具有較大優(yōu)勢。二至丸出自清代的《醫(yī)方集解》，方中含有女貞子和墨旱蓮，作為平補肝腎之劑，具有補養(yǎng)肝腎、滋陰補血的功效，對肝腎陰虛證型高血壓具有較好的治療作用，目前二至丸治療高血壓的作用機制尚未明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討二至丸治療高血壓的作用機制，深入研究二至丸中藥物與治療肝腎陰虛型高血壓的關(guān)系，為二至丸的臨床應(yīng)用提供準確的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 二至丸有效成分及相關(guān)靶點篩選 分別以“女貞子”“墨旱蓮”為關(guān)鍵詞檢索TCMSP中草藥藥理學(xué)平臺，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為標(biāo)準，獲取二至丸中女貞子、墨旱蓮的有效成分及相關(guān)靶點，應(yīng)用UniProt數(shù)據(jù)庫進行g(shù)ene symbol轉(zhuǎn)換，物種設(shè)置為“Homo sapiens”。

1.2 高血壓基因的獲取 基于GeneCards數(shù)據(jù)庫，分別以“hypertension”“high blood pressure”為檢索詞，獲得排名居前2 000位的基因，取并集獲得高血壓基因。

1.3 蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將二至丸的相關(guān)靶點與高血壓基因取交集，獲得二至丸治療高血壓的核心靶點，再將核心靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 京都基因與基因組百科全書(KEGG)與基因本體(GO)功能富集分析 將核心靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，分別進行KEGG通路富集分析與GO功能富集分析，GO分析涉及分子功能、生物過程、細胞組成，以P<0.05為篩選標(biāo)準，獲取KEGG通路和GO功能富集分析結(jié)果。

1.5 可視化分析 分別通過OmicShare數(shù)據(jù)平臺(www.omicshare.com/tools/)繪制Venn圖，應(yīng)用Cytoscape 3.7.2軟件繪制網(wǎng)絡(luò)圖并進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 二至丸的活性成分及相關(guān)靶點 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別檢索出女貞子119個有效成分，墨旱蓮48個有效成分。以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為標(biāo)準，最終得到女貞子活性成分13個、墨旱蓮活性成分10個，詳見表1。其中槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)為二者共有成分，可能為二至丸治療高血壓的關(guān)鍵成分。分別檢索女貞子、墨旱蓮的活性成分靶點，共獲得182個、127個相關(guān)靶點。

表1 二至丸活性成分

2.2 高血壓基因的獲取及核心靶點預(yù)測 基于GeneCards平臺，分別檢索“hypertension”“high blood pressure”，取并集后共獲得2 637個基因。將其與二至丸相關(guān)靶點取交集，共獲得143個核心基因。詳見圖1。

圖1 二至丸及高血壓基因的Venn圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖及關(guān)鍵靶點預(yù)測 將143個核心基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖，下載數(shù)據(jù)后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件。通過Network Analyzer模塊進行網(wǎng)絡(luò)分析，以Degree值為標(biāo)準進行排序，最終得到10個關(guān)鍵靶點，分別是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白細胞介素-6(IL6)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、胱天蛋白酶3(CASP3)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長因子受體(EGFR)、肉瘤病毒17癌基因(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、表皮細胞生長因子(EGF)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、MYC基因(MYC)。詳見圖2。

圖2 核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 KEGG與GO富集分析 基于DAVID數(shù)據(jù)庫富集分析，共獲得二至丸治療高血壓的20條KEGG關(guān)鍵通路，主要涉及腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、缺氧誘導(dǎo)因子1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、血管內(nèi)皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)、絲裂原活化蛋白激酶信號通路(MAPK signaling pathway)等，詳見圖3。GO分析得到15條關(guān)鍵生物途徑，主要涉及酶結(jié)合(enzyme binding)、相同蛋白結(jié)合(identical protein binding)、藥物反應(yīng)(response to drug)、凋亡過程負調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、細胞外間隙(extracellular space)等，詳見圖4。

圖3 核心通路富集圖

圖4 生物途徑GO分析(黃色代表分子功能；綠色代表生物過程；藍色代表細胞組成)

3 討 論

氧化應(yīng)激與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，體內(nèi)活性氧生成過多，血管平滑肌細胞發(fā)生氧化損傷，導(dǎo)致血管炎癥，血壓升高。目前，幾乎所有人體研究均表明槲皮素可降低高血壓病人血壓，其機制可能與降低氧化應(yīng)激[2]，干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)[3]和改善血管內(nèi)皮功能[4]等有關(guān)。

木犀草素是一種常見的黃酮類化合物，可上調(diào)超氧化物歧化酶(SOD)表達，并減少氧化損傷介質(zhì)丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)等抑制氧化應(yīng)激[5]；并激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/一氧化氮(PI3K/AKT/NO)信號通路，使內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化增加，增加內(nèi)皮型一氧化氮合成與釋放，從而發(fā)揮舒張血管的作用[6]。木犀草素通過抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移，改善高血壓相關(guān)血管重塑[7]。AKT1是蛋白激酶B(AKT)的亞型之一。有研究顯示，NO生成減少導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損是高血壓發(fā)生發(fā)展的機制之一，由于許多內(nèi)皮細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑聚集在AKT上，導(dǎo)致eNOS磷酸化和活化，因此該分子可作為增加eNOS反應(yīng)的理想靶點[8]。IL-6、TNF等炎性因子可促進心肌成纖維細胞分化和膠原生成增加，是構(gòu)成高血壓心肌纖維化的病理生理基礎(chǔ)[9]。VEGFA結(jié)合VEGFR后，通過PI3K/AKT信號通路增加eNOS磷酸化及其活性，使NO產(chǎn)生增加，血管通透性和內(nèi)皮細胞存活，并介導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管舒張[10]。Caspase-3是細胞凋亡過程中主要的終末剪切酶[11]，其介導(dǎo)的細胞凋亡參與高血壓病理生理的多個過程[12]。

TNF信號通路具有多種生物學(xué)效應(yīng)，TNF-α過表達可損傷血管內(nèi)皮，促進血管平滑肌細胞遷移和增殖，使血管內(nèi)膜增生，外周阻力增加。TNF-α可促進血管炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)IL-6表達，促進血管內(nèi)皮損傷，血管收縮，血壓升高[13]。HIF-1α和HIF-2α表達之間的平衡是維持正常組織灌注和全身動脈壓的重要因素[14]?？梢姡琀IF-1信號通路與血壓關(guān)系密切。PI3K/AKT信號通路是調(diào)節(jié)細胞增殖、血管生成和凋亡的重要途徑，參與機體抗氧化過程，與左室肥大和血管舒張功能障礙有關(guān)[15]。VEGF信號通路對血管生成及維持正常的血管內(nèi)皮功能具有重要的意義。高血壓長期壓力負荷產(chǎn)生的機械牽張刺激使MAPK信號通路過度激活，引起心肌細胞肥大、心肌肥厚，導(dǎo)致高血壓性心臟病發(fā)生[16]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活是血壓調(diào)控的重要機制，RAS系統(tǒng)中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)具有較強的縮血管作用，通過刺激腎上腺皮質(zhì)球狀帶，促進醛固酮分泌，水鈉潴留增加，血壓升高[17]；AngⅡ可增加交感神經(jīng)遞質(zhì)和特異性受體的活性，使血壓升高[18]；AngⅡ可反饋性地抑制腎素分泌并刺激腎臟分泌前列腺素，調(diào)節(jié)血壓水平[19]。心肌和平滑肌收縮取決于細胞內(nèi)有力鈣離子濃度，細胞外鈣離子內(nèi)流增加或肌漿網(wǎng)鈣釋放增加，均導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣離子濃度增加，使血管平滑肌收縮增強，血壓升高。

總之，二至丸具有多靶點、多通路治療高血壓的特點，二至丸降壓治療的藥效成分、作用靶點、分子通路可為進一步深入揭示其作用機制奠定了基礎(chǔ)。