宋 瑞，陰懷清，趙小靜，武師潤

高膽紅素血癥是新生兒科常見的疾病，也是新生兒住院的主要原因之一[1]，該病主要是由于膽紅素生成過多，肝對膽紅素攝取和結(jié)合能力降低，腸肝循環(huán)增加等多種原因?qū)е卵逦唇Y(jié)合膽紅素升高，患兒出現(xiàn)皮膚黏膜及鞏膜黃染。未結(jié)合膽紅素透過血腦屏障，在腦組織特定的神經(jīng)核團中沉積，若不及時有效地干預，隨著病情進展，可能導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生不可逆損傷，甚至導致死亡[2-4]。本研究通過建立7 d齡SD大鼠膽紅素腦損傷模型，給予外源性單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)干預，通過檢測血清S100鈣結(jié)合蛋白B(S100B)蛋白水平，觀察GM1對高膽紅素血癥腦損傷的保護機制，為臨床診療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 7 d齡SD大鼠120只，清潔級，生產(chǎn)許可證號SCXK(晉)2019-0004，購自山西醫(yī)科大學動物實驗中心，體質(zhì)量12～18 g，雌雄不限。隨機分為3組：對照組(腹腔注射生理鹽水)、高膽紅素血癥組(A組，腹腔注射膽紅素150 mg/kg)和GM1干預組(B組，腹腔注射膽紅素150 mg/kg+GM1 10 mg/kg)。將每組分為5個亞組，每組8只，分別于6 h、12 h、24 h、48 h、72 h處死。

1.2 實驗試劑 膽紅素購自美國Sigma公司；大鼠S100B酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒-POD(50T)購自博士德生物技術(shù)公司；單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液[2 mL(20 mg)]，批準文號：國藥準字H20046213，齊魯制藥公司生產(chǎn)；5%水合氯醛由山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院兒科提供；甲醛、雙蒸水、3%H2O2溶液、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、二甲苯、二氨基聯(lián)苯胺法(DAB)顯色試劑、蘇木素等試劑由山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院病理科提供。

1.3 膽紅素配制 黑暗環(huán)境下精確稱取膽紅素50 mg，溶于1 mL 0.5 mol/L NaOH溶液中，加入雙蒸水9 mL，使用濃度0.5 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值為8.5，濃度為85.5 μmol/L，避光保存，并于1 h內(nèi)使用。

1.4 動物模型制作 A組、B組大鼠腹腔注射膽紅素150 mg/kg，對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水；造模后，B組腹腔注射GM1 10 mg/kg，連續(xù)3 d，每日1次，對照組和A組注射等量的生理鹽水。給藥后，各組大鼠均返回原生長環(huán)境下母乳喂養(yǎng)。

1.5 觀察指標

1.5.1 行為學變化 觀察各組大鼠皮膚黃染情況、對外界刺激的反應、活動力有無減弱等。

1.5.2 血清S100B蛋白水平測定 于相應時間點抓取大鼠，以5%水合氯醛麻醉，劑量為0.03 mL/10 g，待大鼠進入深昏迷狀態(tài)后，使用膠帶固定，打開大鼠胸腔、腹腔，充分暴露心臟，在心室舒張末期，迅速用1 mL注射器刺入左心室，抽取0.5 mL血液置于干燥EP管中，靜置30 min，高速離心機離心，吸取上層血清，采用ELISA法測定血清S100B蛋白水平。

1.5.3 病理學改變 使用生理鹽水充分灌洗，當觀察到血性液體變清亮時停止，再使用20 mL甲醛進行灌流，結(jié)束后立即取腦組織，浸泡于甲醛中固定24 h，將固定好的腦組織于視交叉后約5 mm處進行冠狀切割，海馬區(qū)包含在所取組織中，梯度乙醇脫水后包埋。將包埋好的石蠟塊進行連續(xù)切片。①行蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察海馬區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；②TUNEL法測定細胞凋亡，光鏡下觀察到細胞核呈棕黃色，即為凋亡細胞。

1.5.4 圖像處理 應用Scanscope CS數(shù)字病理掃描系統(tǒng)(美國Aperio公司)進行圖像采集。掃描所取腦組織病理切片，每張切片中截取海馬區(qū)5個非重疊視野(×400)。記錄各視野凋亡細胞數(shù)目和細胞總數(shù)，凋亡率=凋亡細胞數(shù)目/細胞總數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠行為學變化 整個實驗過程中，無大鼠發(fā)生死亡，實驗開始前，所有大鼠活動均無異常。對照組大鼠全程皮膚、黏膜紅潤，行為活動無異常；A組、B組大鼠造模后約6 h開始出現(xiàn)煩躁、尖叫、抽搐等異常變化，且隨著時間推移，皮膚黃染程度逐漸加重，對外界刺激反應越來越差，活動力減弱；A組較B組表現(xiàn)更明顯。

2.2 3組大鼠不同時間血清S100B蛋白水平比較 A組血清S100B蛋白水平較對照組、B組升高，且與時間呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；B組較A組降低，仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1、圖1。

表1 3組大鼠不同時間血清S100B蛋白水平比較(±s) 單位：pg/mL

圖1 3組不同時間血清S100B蛋白水平折線圖

2.3 病理學變化

2.3.1 海馬區(qū)HE染色改變 對照組大鼠海馬區(qū)細胞胞清晰可見，各細胞形態(tài)正常且排列規(guī)整；A組、B組海馬區(qū)細胞水腫變性，排列紊亂，大量空泡形成，胞核固縮、溶解、碎裂消失，部分膠質(zhì)細胞增生；同一時間點相比，鏡下可見B組受損程度較A組減輕。詳見圖2。

圖2 3組大鼠腦組織海馬區(qū)HE染色圖(×400)

2.3.2 海馬區(qū)細胞凋亡情況 對照組各時間點均無或僅有極少數(shù)細胞發(fā)生凋亡，A組、B組大鼠于造模后約6 h開始出現(xiàn)凋亡細胞，24～48 h凋亡細胞數(shù)目進一步增加，72 h達到峰值，同一時間比較，B組凋亡細胞數(shù)目較A組減少，且高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2、圖3。

表2 各組大鼠不同時間點腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率(±s) 單位：%

圖3 3組大鼠不同時間腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況(×400)

3 討 論

國內(nèi)外有多種模擬高膽紅素血癥腦損傷的方法，如經(jīng)靜脈[5]或經(jīng)小腦延髓池注入[6]膽紅素、皮下或腹腔注射鹽酸苯肼[7]、使用基因缺陷Gunn大鼠[8]等。本研究采用陳舜年等[9]腹腔注射膽紅素的方法，注射劑量為150 mg/kg，分析原因：選用腹腔注射膽紅素，重復性好、簡單經(jīng)濟、容易操作，成功率高。一項關(guān)于建立膽紅素腦損傷模型的研究顯示，觀察造模后各組大鼠行為學及病理學變化，發(fā)現(xiàn)腹腔注射膽紅素劑量50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg、200 mg/kg均可成功復制新生兒高膽紅素血癥模型，通過測定腦組織及血清S100B蛋白含量發(fā)現(xiàn)，若進行膠質(zhì)細胞損傷方面的研究，注射膽紅素劑量為150 mg/kg更合適[10]。

GM1在臨床上廣泛用于治療各種腦出血、缺血再灌注損傷等，該藥較安全，半數(shù)致死量(LD50)是872 mg/kg(靜脈注射大鼠)至>8 g/kg(s.c.小鼠)，各種動物(大鼠、小鼠、Beagle犬及兔)進行亞急性和慢性毒性試驗、致畸試驗、生殖毒性試驗、圍生期毒性試驗及誘變性試驗均未顯示其任何毒性作用。相關(guān)研究顯示，動物實驗選用低劑量GM1即可發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護作用[11-14]。本研究選擇GM1劑量為10 mg/kg，與新生兒常用劑量每日20 mg(8 mg/kg)相近。

膽紅素腦病是新生兒高膽紅素血癥嚴重的并發(fā)癥，若不及時發(fā)現(xiàn)并進行早期干預，可能遺留錐體外系運動障礙、聽覺異常、眼球向上運動受限、牙釉質(zhì)發(fā)育不良等后遺癥，給社會及家庭帶來沉重負擔[15]。臨床診斷膽紅素腦病主要依靠新生兒行為神經(jīng)測評(Neonatal Behavioral Neurological Assessment，NBNA)、頭顱磁共振(MRI)、腦干聽覺誘發(fā)電位檢查等，這些檢查反映腦損傷情況滯后，臨床早期診斷具有一定的局限性。新生兒膽紅素腦病進展快，早期臨床表現(xiàn)有精神萎靡、反應低下、嗜睡、拒乳等癥狀不典型，易被忽視，單純依靠影像學檢查易延誤治療，具有較高的致殘率和致死率。有研究表明，S100B蛋白作為早期預測中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的生化指標[16]，是一種鈣離子結(jié)合蛋白，主要分布在星形膠質(zhì)細胞中，在神經(jīng)系統(tǒng)表達含量最多。多項研究顯示，正常生理狀態(tài)下，S100B蛋白存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，血清含量較少，當中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時，激活星形膠質(zhì)細胞分泌大量的S100B蛋白，使其在腦脊液中含量增加；同時S100B蛋白可透過損傷的血腦屏障進入血液循環(huán)，使其在血清水平升高[17-18]。有研究表明，膽紅素腦損傷與血清S100B變化存在相關(guān)性，且隨著膽紅素腦損傷程度加重，血清S100B蛋白水平逐漸增高[19]。一項前瞻性研究顯示，發(fā)生腦損傷時，短時間內(nèi)血清S100B蛋白水平升高，達到峰值，并持續(xù)2 d[20]。本研究結(jié)果顯示，A組和B組大鼠血清S100B蛋白水平6 h開始升高，24～48 h增長迅速，72 h達到峰值。有研究顯示，S100B可預測新生兒腦損傷嚴重程度，靈敏度和特異度分別為100.0%、93.9%[21]。S100B蛋白在診斷和預測腦損傷嚴重程度方面有較高的靈敏度和特異度，臨床應用廣泛，在動靜脈血液、腦脊液、尿液、唾液中均能檢測到，且具有易取樣、性質(zhì)穩(wěn)定、不受溶血等優(yōu)點[22]。因此，S100B蛋白可作為早期診斷膽紅素腦損傷的生化標志物。

膽紅素是一種內(nèi)源性的抗氧化劑，在生理狀態(tài)下，可有效清除脂質(zhì)過氧化物、氧自由基，具有一定的保護作用[23]。過量的膽紅素，尤其是親脂性的未結(jié)合膽紅素可透過血腦屏障，沉積于腦組織中，引起能量代謝異常，誘發(fā)興奮性氨基酸持續(xù)升高，鈣離子超載，導致神經(jīng)細胞水腫變性[24]。過量的游離膽紅素通過刺激神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生，減少髓鞘對腦組織造成毒性破壞，導致機體出現(xiàn)一系列異常行為表現(xiàn)[25]。神經(jīng)節(jié)苷脂廣泛存在于脊椎動物組織中，患泰薩氏幼年型黑白癡病(Tay-sachs病)的小兒腦中發(fā)現(xiàn)，腦白質(zhì)含量很多，GM1通過選擇性阻止興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)異常釋放和重攝取，扭轉(zhuǎn)酪氨酸羥化酶抑制脂質(zhì)過氧化物作用及抑制腦細胞自噬等多種方式保護受損的腦組織[26-28]。GM1是可通過血腦屏障的神經(jīng)節(jié)苷脂，通過血腦屏障嵌入細胞膜，保護神經(jīng)細胞膜Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶等相關(guān)生物酶活性，從而降低細胞膜轉(zhuǎn)運機制，調(diào)節(jié)Ca2+、K+水平，減輕腦組織水腫[29-30]，對損傷神經(jīng)元的修復、再生發(fā)揮重要的保護作用。有研究顯示，GM1通過促進星形膠質(zhì)細胞糖酵解發(fā)揮作用，從而導致這些細胞攝取葡萄糖和釋放乳酸，存在星形膠質(zhì)細胞時培養(yǎng)神經(jīng)元，GM1可增強線粒體活性并觸發(fā)神經(jīng)保護基因表達[31]。本研究結(jié)果顯示，造模后A組、B組細胞排列紊亂，出現(xiàn)凋亡細胞，且與時間呈正相關(guān)，同一時間比較，B組細胞凋亡數(shù)目較A組減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明隨著膽紅素進入腦組織時間延長，細胞凋亡數(shù)目和凋亡程度逐漸增加；同時觀察到GM1可減輕神經(jīng)細胞水腫變性，減少神經(jīng)元細胞凋亡，對受損腦組織起到一定的保護作用，具體機制尚需進一步研究。

綜上所述，S100B蛋白作為早期診斷新生兒高膽紅素血癥腦損傷的生化標志物之一，GM1可減輕膽紅素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用，以期為臨床提供實驗依據(jù)。