高璟英，夏李霞，衛(wèi)園園，白汝雪

糖尿病是一種高發(fā)的慢性進(jìn)行性疾病，按照國(guó)際糖尿病聯(lián)盟報(bào)告，2021年全球成年糖尿病病人達(dá)到5.37億例，相較于2019年，糖尿病病人增加了7 400萬(wàn)例，增幅達(dá)16%，突顯出全球糖尿病患病率增長(zhǎng)迅速，糖尿病導(dǎo)致過(guò)早死亡和殘疾，給社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，防治工作需全球共同行動(dòng)[1]。苦參素是中藥苦參的主要成分，具有抗炎、抗病毒、保肝、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、調(diào)節(jié)離子通道等作用[2-6]。多項(xiàng)研究顯示，苦參素可降低血糖，促進(jìn)胰島素分泌[7-8]，具體機(jī)制尚未明確。本研究探討離體大鼠胰島中苦參素對(duì)電壓門控性鉀通道的作用，為苦參素應(yīng)用于糖尿病的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。每5只1籠，溫度(25±2)℃，濕度55%～60%，自由攝食和飲水。動(dòng)物的飼養(yǎng)和處理均得到了山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)和動(dòng)物使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 苦參素、青鏈霉素、多聚賴氨酸、histopaque-1077分離液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清、RPM1-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；膠原酶P、DispaseⅡ購(gòu)自美國(guó)Roche公司；Hanks緩沖液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；大鼠胰島素放射免疫試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所；葡萄糖4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid，HEPES]、分析純氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、氯化鎂(MgCl2)、氯化鈣(CaCl2)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、硫酸鎂(MgSO4)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、氫氧化鉀(KOH)、氫氧化鈉(NaOH)購(gòu)自上海生工生物股份有限公司；無(wú)水乙醇購(gòu)自天津市北辰方正試劑廠；清蛋白購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；體視顯微鏡購(gòu)自深圳市隆基儀器設(shè)備有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司；HEKA膜片鉗系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)HEKA公司；Narishige MODEL PP-830電極拉制儀購(gòu)自日本東京Narishige公司；MICRO-FORGE MF-200拋光儀購(gòu)自美國(guó)World Precision Instruments公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 胰島的分離和培養(yǎng) 麻醉處死大鼠，打開腹腔，找到膽總管和胰管在腸端的交匯處，使用止血鉗夾住，體視鏡下，剝離膽總管后剪小口。使用注射器將配制的膠原酶P 10 mL(1 mg/mL)從剪好的小口緩慢注入胰腺。待胰腺膨脹后剝離，放入50 mL的離心管中，38 ℃水浴，消化約11 min，之后加入適量的4 ℃含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基和Hanks緩沖液終止消化，離心(1 200 r/min)3 min后，棄去上清液，加入10 mL histopaque-1077分離液吹勻后，用注射器沿著管壁緩慢將1640培養(yǎng)基10 mL注入管中，再次離心(3 200 r/min)23 min，在培養(yǎng)基和分離液之間看到的即為胰島。將挑選的胰島置于培養(yǎng)箱中，37 ℃，5%CO2，97%濕度培養(yǎng)待用。

1.4.2 胰島細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 將挑選的胰島置于eppendorf(EP)管中，加入DispaseⅡ酶液100 μL，消化5 min后，采用4 ℃含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基終止消化，離心(1 000 r/min)2 min后，棄掉上清液，將消化得到的細(xì)胞滴于多聚賴氨酸處理過(guò)的玻片上，待細(xì)胞沉降、貼壁，在培養(yǎng)皿中加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2，97%濕度培養(yǎng)待用。

1.4.3 胰島素分泌實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分3輪，每輪4組。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將每個(gè)EP管中加入含葡萄糖2.8 mmol/L的Krebs-Ringer bicarbonate HEPES(KRBH)液1 mL，將培養(yǎng)的胰島加入EP管中，置于培養(yǎng)箱中37 ℃預(yù)孵育30 min后取出，棄上清液。KRBH液組成：NaCl 128.8 mmol/L，KCl 4.8 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，NaHCO35 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，清蛋白2%，pH值7.4。第1輪實(shí)驗(yàn)中，胰島分別置于含葡萄糖2.8 mmol/L，葡萄糖2.8 mmol/L+苦參素1 μmol/L，葡萄糖2.8 mmol/L+苦參素10 μmol/L，葡萄糖2.8 mmol/L+苦參素100 μmol/L的KRBH液中孵育。第2輪實(shí)驗(yàn)中，胰島分別置于含葡萄糖11.1 mmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L+苦參素1 μmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L+苦參素10 μmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L+苦參素100 μmol/L的KRBH液中孵育。第3輪實(shí)驗(yàn)中，胰島分別置于含葡萄糖16.7 mmol/L，葡萄糖16.7 mmol/L+苦參素1 μmol/L，葡萄糖16.7 mmol/L+苦參素10 μmol/L，葡萄糖16.7 mmol/L+苦參素100 μmol/L的KRBH液中孵育。每輪實(shí)驗(yàn)胰島被孵育30 min后，吸取各組上清液，-20 ℃保存，用于檢測(cè)胰島素含量。最后在胰島中加入酸乙醇(無(wú)水乙醇∶鹽酸∶水體積比為150∶3∶47)，利用超聲細(xì)胞粉碎儀破碎、稀釋后，-20 ℃保存，檢測(cè)胰島中儲(chǔ)存的胰島素含量。胰島素含量采用放射免疫分析法測(cè)定，即上清液胰島素含量/胰島中儲(chǔ)存的胰島素含量。

1.4.4 膜片鉗實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和苦參素(10 μmol/L)組。配制電壓門控性鉀通道(voltage-gated potassium channel，Kv)的電極內(nèi)液、電極外液，藥物溶解于相應(yīng)的電極外液中。Kv電極內(nèi)液：KCl 140 mmol/L，MgCl21 mmol/L，NaCl 10 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸[methylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid，EGTA]0.05 mmol/L，使用KOH調(diào)節(jié)pH值至7.3。Kv電極外液：NaCl 141.9 mmol/L，KCl 5.6 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，HEPES 5 mmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L，使用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4。Narishige MODEL PP-830電極拉制儀拉制電極，MICRO-FORGE MF-200拋光儀拋光電極，使電極電阻達(dá)到4～7 MΩ。采用EPC-10型膜片鉗放大器收集電信號(hào)，通過(guò)去極化刺激激發(fā)動(dòng)作電位、Kv。破膜后細(xì)胞膜電容>7 picofarad(pF)的細(xì)胞是β細(xì)胞[9]。記錄Kv設(shè)置：鉗制電壓為-70 mV，刺激從-70 mV增加到+80 mV，步階為10 mV，時(shí)程為400 ms，選取最終50 ms 穩(wěn)定以后的均值。記錄動(dòng)作電位設(shè)置：鉗制電壓為-70 mV，選擇電流鉗模式，給予150 picoampere(pA)，4 ms的電流刺激細(xì)胞，記錄從開始去極化到復(fù)極化達(dá)到距離靜息電位10 mV的時(shí)間作為動(dòng)作電位時(shí)程[10]。

2 結(jié) 果

2.1 不同劑量苦參素對(duì)胰島素分泌的影響 低糖(2.8 mmol/L)時(shí)，苦參素(1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L)對(duì)胰島素分泌無(wú)影響(P>0.05)。高糖(11.1 mmol/L、16.7 mmol/L)時(shí)，苦參素(10 μmol/L、100 μmol/L)促進(jìn)了胰島素分泌(P<0.01)。與葡萄糖11.1 mmol/L比較，葡萄糖11.1 mmol/L+苦參素(10 μmol/L)胰島素分泌增加；與葡萄糖16.7 mmol/L比較，葡萄糖16.7 mmol/L+苦參素(10 μmol/L、100 μmol/L)胰島素分泌增加。詳見表1。

表1 不同劑量苦參素對(duì)胰島素分泌的影響(±s)

2.2 苦參素抑制了β細(xì)胞的Kv 電流-膜電位曲線表明苦參素(10 μmol/L)抑制了Kv，詳見圖1。測(cè)試電壓為30 mV時(shí)，與對(duì)照組比較，苦參素(10 μmol/L)組電流被抑制(P<0.01)。詳見表2。

圖1 兩組電流-膜電位曲線圖

表2 苦參素對(duì)電壓門控性鉀通道的影響(±s) 單位：pA/pF

2.3 苦參素對(duì)β細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)程的影響 苦參素(10 μmol/L)延長(zhǎng)了大鼠胰島β細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)程。與對(duì)照組比較，苦參素組動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)(P<0.01)。詳見圖2、表3。

圖2 兩組胰島β細(xì)胞膜電位-動(dòng)作電位時(shí)程變化圖

表3 苦參素對(duì)動(dòng)作電位時(shí)程的影響(±s) 單位：ms

3 討 論

作為重大的慢性非傳染性疾病，糖尿病及血管并發(fā)癥的防控工作已成為“健康中國(guó)2030”規(guī)劃的重要內(nèi)容之一[11]。有研究顯示，口服苦參素后，2型糖尿病病人空腹血糖、三酰甘油、總膽固醇和腫瘤壞死因子-α水平降低，胰島素抵抗得到了改善[7]。糖尿病大鼠中，苦參素明顯增加了胰島數(shù)目，促進(jìn)了胰島素分泌，提高了胰島素敏感性，增加了肌肉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4的水平，降低了血脂，同時(shí)升高血清胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)水平[8]。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)展的重要起始因素和關(guān)鍵因素。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，苦參素通過(guò)抑制炎性因子和腺苷A2B受體的表達(dá)，減輕了高糖導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞毒性[12]。

胰島β細(xì)胞中，葡萄糖刺激胰島素分泌與細(xì)胞膜離子通道密切相關(guān)。Kv是胰島β細(xì)胞上主要的復(fù)極化通道。葡萄糖使細(xì)胞內(nèi)ATP水平增加，導(dǎo)致ATP敏感性鉀通道關(guān)閉，引起細(xì)胞膜去極化，活化了電壓門控性鈣通道，鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，促進(jìn)了胰島素分泌。細(xì)胞膜去極化激活了Kv，鉀離子排出細(xì)胞，促進(jìn)β細(xì)胞復(fù)極化，阻止鈣離子通過(guò)電壓門控性鈣通道進(jìn)入細(xì)胞，因此阻止了胰島素分泌[13]。

為闡明苦參素在胰島β細(xì)胞中的作用，本研究分析苦參素與Kv的關(guān)系。結(jié)果顯示，低糖時(shí)，苦參素未影響胰島素的分泌；高糖時(shí)，苦參素促進(jìn)了胰島素分泌，表明苦參素調(diào)節(jié)胰島素分泌的作用是依賴于葡萄糖濃度。膜片鉗實(shí)驗(yàn)中，苦參素抑制了Kv，延長(zhǎng)了動(dòng)作電位時(shí)程。相關(guān)研究表明，Kv被抑制后，可以通過(guò)延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程而升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度[14-16]，從而引起胰島素分泌，且這種促胰島素分泌效應(yīng)是葡萄糖依賴性的[16-18]，與本研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)Kv在苦參素促胰島素分泌中的重要作用。

總之，大鼠的胰島β細(xì)胞中，苦參素的促胰島素分泌作用與抑制Kv、延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程有關(guān)，為探討苦參素調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞功能的機(jī)制開拓了新的視野，為治療糖尿病提供了理論依據(jù)。