潘 菲，韓曉萍

(1. 青海大學醫(yī)學院，青海西寧 810016；2. 青海省藥品檢驗檢測院， 青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點實驗室，青海 西寧 810016；3. 國家藥品監(jiān)督管理局(藏藥)質(zhì)量控制重點實驗室，青海西寧 810016)

黑果枸杞為(LyciumruthenicumMurr. )為茄科(So- lanceae)枸杞屬(LyciumL. )植物[1]的干燥成熟果實，主要分布于我國新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、青海、寧夏、山西、陜西、西藏境內(nèi)[2]，有著獨特的抗旱抗鹽堿特性，可用于防治土壤沙漠化、緩解土壤鹽堿化[3]，屬于典型的荒漠植物. 黑果枸杞不僅是營養(yǎng)豐富的傳統(tǒng)食品，以其為原料生產(chǎn)的深加工滋補產(chǎn)品種類繁多[4-5]；而且在藏藥、維吾爾醫(yī)藥中應用歷史久遠，有治療月經(jīng)不調(diào)、心臟病等的功效，和補腦、健身、強腎、滋肝、明目的作用[6-9].

甜菜堿(Betaine)是一種季銨型生物堿，廣泛存在于各種動植物體內(nèi)，是自然界中的一種天然營養(yǎng)物質(zhì).植物的主要非生物脅迫其中之一為土壤鹽分，限制了其正常生長和發(fā)育[10-11]，黑果枸杞作為一種寶貴的鹽生植物，常生于鹽堿土荒地、鹽湖岸邊或鹽化沙地等鹽漬化土壤中，其中的主要化學成分甜菜堿起到了重要作用[12].甜菜堿還具有促進生物發(fā)酵、調(diào)節(jié)滲透壓、抗應激等功效[13-14]，并且在動物養(yǎng)殖業(yè)中作為新型飼料而廣泛應用[15].

本文采用高效液相色譜法(HPLC)對黑果枸杞中甜菜堿含量進行測定，并比較青海、甘肅、新疆、寧夏、內(nèi)蒙不同產(chǎn)區(qū)的黑果枸杞甜菜堿的含量，以期對青海產(chǎn)黑果枸杞質(zhì)量控制和品質(zhì)評價提供一定的科學依據(jù).

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀，美國WATERS公司；BSA224S 電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；TB-Z 型真空恒溫干燥箱，天津藥典標準儀器廠；GenPurexCAD 型純水機.

1.2 試藥

1.2.1 對照品

甜菜堿(批號110894-200503)，純度99.2%，約50 mg/瓶，購自于中國食品藥品檢定研究院.

1.2.2 試劑

乙醇，AR，昆山金城試劑有限公司；甲醇，AR，四川西隴科學有限公司；中性氧化鋁，F(xiàn)CP，國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉，GR，西隴化工股份有限公司；五氧化二磷，AR，佛山西隴化工有限公司；水為超純水.

1.2.3 藥材

黑果枸杞為茄科枸杞屬植物黑果枸杞的干燥成熟果實，白刺果為蒺藜科白刺屬植物白刺的干燥成熟果實(共采集47 批次黑果枸杞，其中青海20 批次，甘肅7 批次，新疆8 批次，內(nèi)蒙古6 批次，寧夏6 批次；白刺果3 批次，采自青海)，樣品的詳細信息來源見表1.

表1 樣品信息來源匯總Table 1 Summary of sample information

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為 Luna HILIC 柱(100 ×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水(85∶15)；體積流量 1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長195 nm；進樣量5 μL.在該色譜條件下，理論塔板數(shù)不低于3 000.本方法測定的系統(tǒng)適用性測定圖譜見下圖1.

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液

精密稱取甜菜堿對照品適量，用蒸餾水溶解，即得濃度約為2.0 mg/mL 的甜菜堿對照品溶液.

2.2.2 供試品溶液

取具有代表性試樣50 g，粉碎至均勻，裝于袋中干燥保存，防止吸潮. 精密稱取樣品粉末1 g(精確到0.000 1 g)，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過.精密量取續(xù)濾液2 mL，置堿性氧化鋁固相萃取柱(2 g)上，用乙醇30 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水溶解，轉移至2 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得.

2.3 黑果枸杞甜菜堿含量測定

2.3.1 標準曲線的制備

精密吸取甜菜堿對照品儲備液0.3、0.6、1.2、1.5、1.8 mL 置10 mL 棕色容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度.以甜菜堿對照品濃度為橫坐標，以響應峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，通過線性回歸得到方程:Y=833 068X ＋5 040.5 (r=0.999 4)，結果表明甜菜堿在0.06 ～0.36 mg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好.

2.3.2 精密度實驗

精密稱取同一批樣品，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄響應峰面積.結果表明，各響應峰面積RSD=1.83%，表明所用方法精密度良好.

2.3.3 重現(xiàn)性實驗

精密稱取同一批樣品平行6 份，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下的色譜條件進樣，記錄響應峰面積.結果表明，各響應峰面積RSD=2.73 %.

2.3.4 穩(wěn)定性實驗

取同一份供試品溶液，置于陰暗處，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄響應峰面積.結果表明，各響應峰面積RSD=2.08%，表明供試品溶液在制備后24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.3.5 加樣回收實驗

采用加標回收率實驗，精密稱取同一批樣品，分別精密加入80%、100%、120%的甜菜堿標準品溶液，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下的色譜條件進樣，記錄響應峰面積，依法測定黑果枸杞甜菜堿含量，計算回收率. 平均回收率為93.04%，RSD=2.49%，結果見表2.

表2 加樣回收實驗結果Table 2 Experimental results of sample recovery

2.3.6 甜菜堿含量測定

取50 批次的樣品平行3 份，分別按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄響應峰面積，利用標準曲線，計算黑果枸杞甜菜堿含量.結果見表3.

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0 對樣品的甜菜堿含量測定結果進行統(tǒng)計分析和圖表繪制(表3，圖1).

表3 50 批次樣品甜菜堿含量測定結果Table 3 Determination of betaine in 50 batches of samples

圖1 對照品HPLC 色譜圖(a)和樣品的HPLC 色譜圖(b)Fig.1 HPLC of reference substance and sample

3 結果

3.1 黑果枸杞甜菜堿含量

黑果枸杞樣品中甜菜堿平均含量為(0.66 ±0.20) g/100 g，含量范圍是0.23 ～1.31 g/100 g，且按照α=0.05，經(jīng)過正態(tài)檢驗，這47 批次黑果枸杞的甜菜堿含量符合正態(tài)分布，見下圖2.

圖2 黑果枸杞甜菜堿含量測定結果分布Fig.2 Distribution of betaine content in Lyciumbarbarum L.

五大產(chǎn)區(qū)中，青海產(chǎn)區(qū)黑果枸杞甜菜堿平均含量為(0.73 ±0.23) g/100 g，含量范圍是 0.47 ～1.31 g/100 g；甘肅產(chǎn)區(qū)黑果枸杞甜菜堿平均含量為(0.53 ±0.22) g/100 g，含量范圍是0.23 ～0.87 g/100 g；新疆產(chǎn)區(qū)黑果枸杞甜菜堿平均含量為(0.64 ±0.11) g/100 g，含量范圍是 0.48 ～0.86 g/100 g；內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)黑果枸杞甜菜堿平均含量為0.60 g/100 ±0.16 g，含量范圍是0.55 ～0.85 g/100 g；寧夏產(chǎn)區(qū)黑果枸杞甜菜堿平均含量為(0.69 ±0.11) g/100 g，含量范圍是0.23 ～1.31 g/100 g.結果見下表4.

表4 黑果枸杞甜菜堿含量Table 4 Content of betaine inLyciumbarbarum L.

3.2 不同產(chǎn)地黑果枸杞甜菜堿含量比較

研究表明，不同的環(huán)境(溫度、濕度、日照等)導致黑果枸杞有效成分積累不同，不同的產(chǎn)區(qū)黑果枸杞甜菜堿含量也不同. 按照α =0.05，經(jīng)過均值差異性檢驗(F 檢驗、t 檢驗、秩和檢驗)，表明在統(tǒng)計學意義上，五大產(chǎn)區(qū)之間黑果枸杞甜菜堿含量無差異，結果見下圖3. 五大產(chǎn)區(qū)中，青海產(chǎn)區(qū)黑果枸杞甜菜堿含量最高，為0.73 g/100 g；寧夏、新疆產(chǎn)區(qū)黑果枸杞甜菜堿含量次之，分別為 0.69 g/100 g，0.64 g/100 g；內(nèi)蒙古、甘肅產(chǎn)區(qū)黑果枸杞甜菜堿含量最低，分別為0.60 g/100 g，0.53 g/100 g.

圖3 不同產(chǎn)區(qū)黑果枸杞甜菜堿含量比較(P ＜0.05)Fig.3 Comparison of betaine content of Lyciumbarbarum in different producing areas(P ＜0.05)

3.3 黑果枸杞與混偽品白刺果的甜菜堿含量比較

研究表明，甜菜堿為黑果枸杞的主要成分. 按照α=0.05，經(jīng)過均值差異性檢驗(F 檢驗、t 檢驗、秩和檢驗)，表明在統(tǒng)計學意義上，黑果枸杞與混偽品白刺果甜菜堿含量有顯著差異，結果見下圖4. 其中黑果枸杞甜菜堿含量較高，為0.66 g/100 g；白刺果甜菜堿含量較低，為0.14 g/100 g.

圖4 黑果枸杞與白刺果甜菜堿含量比較注:不同小寫字母表示不同藥材間差異顯著(P ＜0.05)Fig.4 Comparison of betaine content between Lyciumbarbarum and Nitrariaprzewalskiinote:different lowercase letters indicate significant differences among different medicinal materials (P ＜0.05)

我們還對黑果枸杞近科屬變異植物白枸杞的甜菜堿含量進行了測定，為 0.52 g/100 g；按照 α =0.05，經(jīng)過均值差異性檢驗(F 檢驗、t 檢驗、秩和檢驗)，表明在統(tǒng)計學意義上，白果枸杞與混偽品白刺果甜菜堿含量有顯著差異，白枸杞與黑果枸杞甜菜堿含量沒有差異，且黑果枸杞中甜菜堿含量最高.

4 討論

甜菜堿成分含量測定大部分采用離子色譜法、紫外分光光度法、酸堿滴定法等等[16]，常用色譜柱為氨基色譜柱、離子交換色譜柱和反向色譜柱. 本實驗采用HPLC 進行甜菜堿的含量測定，簡便、準確、成本低；且色譜柱采用親水相互作用色譜柱(Hilic 柱)，選擇乙腈-水(85∶15)作為流動相，等度洗脫，結果分離良好，保留時間在2.5 min 左右，與文獻報道的一致[12]，因此該方法適合測定黑果枸杞中甜菜堿的含量.

耿丹丹等[17]利用離子色譜法測定，黑果枸杞中的甜菜堿含量范圍為9.44 ～19.58 mg/g，且黑果枸杞中甜菜堿含量最高的產(chǎn)地在甘肅民勤縣；婁濤濤等[18]和艾則孜江等[19]利用氨基柱作為色譜柱測定出黑果枸杞甜菜堿含量范圍為0.825 ～1.279 mg/g 和0.619 ～1.185 mg/g，甜菜堿含量最高的產(chǎn)地分別為青海省和新疆蜻河縣.本實驗測得黑果枸杞甜菜堿含量范圍為2.3 ～13.1 mg/g，略高于婁濤濤等人測定的含量，說明親水相互作用色譜柱保留效果略優(yōu)于氨基色譜柱，但略低于耿丹丹等人測定的含量，說明離子色譜保留效果略優(yōu)于液相色譜. 本實驗成功建立HPLC 法測定黑果枸杞甜菜堿含量，且利用該法在五大產(chǎn)區(qū)中進行黑果枸杞甜菜堿測定.

不同的環(huán)境(溫度、濕度、日照等)導致黑果枸杞有效成分積累不同，不同的產(chǎn)區(qū)黑果枸杞甜菜堿含量也不同.本實驗測得黑果枸杞甜菜堿含量由高到低依次為:青海＞寧夏＞新疆＞內(nèi)蒙＞甘肅；其中青海產(chǎn)區(qū)黑果枸杞甜菜堿含量較其他四大產(chǎn)區(qū)略高，可能是由于青海省產(chǎn)區(qū)平均海拔高、日照時間長、晝夜溫差大等得天獨厚的地理環(huán)境，適宜黑果枸杞甜菜堿成分的積累；其中青海海西格爾木市的黑果枸杞甜菜堿含量最高，為1.31 g/100 g，略高于婁濤濤等[18]和李欽俊等人[20]測定的黑果枸杞甜菜堿的最高含量，為1.28 g/100 g 和1.11 g/100 g，且甜菜堿含量最高的黑果枸杞產(chǎn)地都在青海省.

黑果枸杞與黑果枸杞混偽品白刺果以及近科屬變異植物白枸杞甜菜堿含量比較中，確定甜菜堿為黑果枸杞植物的特征成分，含量高于二者；并且與婁濤濤等人[21]運用指紋圖譜技術相比，甜菜堿可以作為特征指標，將黑果枸杞與混偽品白刺果進行有效區(qū)分，方法更簡便、高效.

5 結論

本實驗采用HPLC 法測定黑果枸杞中甜菜堿含量，并將青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙以及寧夏五大產(chǎn)區(qū)的黑果枸杞中甜菜堿含量進行比較，通過甜菜堿成分的積累來初步推斷藥材品質(zhì)，有助于黑果枸杞藥材標準的制定；并且實驗測得五大產(chǎn)區(qū)中青海省黑果枸杞中甜菜堿含量較高，更為青海省特色藥材資源的開發(fā)與利用奠定了基礎.