張?zhí)炷?，夏澤遠(yuǎn)，趙林鋼，，高文銘，羅 燕

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210023；3.南京市六合區(qū)中醫(yī)院，江蘇南京 211599；4.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇 南京 210001)

膀胱癌(bladder cancer，BC)是全球第九大最常見的癌癥類型，2015 年BC 新增病例43 萬，感染人數(shù)近340 萬人[1]. 發(fā)病率和死亡率最高的是北美和歐洲，但是BC 發(fā)病率在一些東歐和發(fā)展中國家也在逐步增加.BC 以淺表(非侵襲性)尿路上皮癌為主，5 年生存率為96%，但肌肉浸潤性BC 的患者預(yù)后較差，5年生存率僅為35 % ～70 %[2].目前確診患者中許多患有慢性基礎(chǔ)性疾病，致使依靠單一現(xiàn)代醫(yī)學(xué)救治困難頗多[3]，而中醫(yī)著重整體、辨證論治，充分體現(xiàn)其獨到優(yōu)勢，為治療BC 做出了重要貢獻(xiàn).

古籍中對尿血、血淋等癥狀的描述，如朱丹溪在《丹溪心法》中指出“大抵小便出血…痛者謂之淋，不痛者謂之溺血”，同現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所講的BC 的典型臨床表現(xiàn)一致，故BC 可歸屬于“尿血”“癃閉”“血淋”的范疇.BC 病機(jī)雖并不完全明確，但從臨床征候體征、發(fā)病歷程與古籍的描述，現(xiàn)代中醫(yī)普遍認(rèn)同將膀胱腫瘤的病因為濕熱之邪入于少陰，而機(jī)體本身又正氣不足，內(nèi)外因相結(jié)導(dǎo)致疾病[4]. 知柏地黃湯(ZhibaiDihuang decoction，ZBDHD)出自《醫(yī)宗金鑒》.此方是在六味地黃丸的基礎(chǔ)上附加知母、黃柏組成，有滋陰補(bǔ)腎、清熱降火的功效，主要用于肝腎陰虛、陰虛火旺之證.ZBDHD 組方中的黃柏有清熱解毒，瀉火除蒸的功效；山藥的主要功效為益腎填精；茯苓的主要功效為淡滲利濕、健脾寧心，以上諸藥共用，能夠起到滋陰降火、生津除煩的作用[5-6].

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于受體理論和生物網(wǎng)絡(luò)，闡述藥物作用及其作用機(jī)制的新技術(shù)，其開創(chuàng)了一種多組分與多靶點間復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系的新型模式，為中藥方劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在藥理機(jī)制研究開拓了新思路[7].分子對接技術(shù)基于配體的三維結(jié)構(gòu)與受體的空間構(gòu)象，預(yù)測其親和力、結(jié)合模式并打分，挑選出與靶點親和力最好的化合物[8].本文擬借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探尋ZBDHD 治療BC 的關(guān)鍵藥效組分，并將關(guān)鍵組分與疾病靶點進(jìn)行分子對接，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).

1 資料收集與分析方法

1.1 ZBDHD 化學(xué)組分收集

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺[9]TCMSP(http:/ /tcmspw.com/)、HERB 本草組鑒數(shù)據(jù)庫(http:/ /herb.ac. cn/)、TCMIP(http:/ /www. tcmip. cn/) 檢索 ZBDHD 中所含化學(xué)成分，并根據(jù)文獻(xiàn)報道對數(shù)據(jù)庫中的中藥組分進(jìn)行增減，具體參考以下條件:(1)該中藥在《中華人民共和國藥典》(2015 年版) 中規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)志物；(2)通過CNKI 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫與Web of Science 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫搜索得到的該味藥中目前已被研究發(fā)現(xiàn)具有明確藥理活性或在藥物中含量較高的有效成分.

1.2 活性組分篩選及靶點收集

本研究基于ADME(藥物吸收、分布、代謝、排泄)模型，參考同類研究[10]，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性指數(shù)(drug like index，DL)≥0.18 作為篩選條件，同時導(dǎo)出活性組分的作用靶點.通過UniProt 數(shù)據(jù)庫[10]( https:/ /www. uniprot. org)檢索蛋白靶點ID 及靶點名，整理ZBDHD 靶點信息.

1.3 ZBDHD 湯治療BC 關(guān)鍵靶點的確定

為進(jìn)一步探究ZBDHD 湯治療BC 的分子機(jī)制，以“bladder cancer”為關(guān)鍵詞，通過 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(https:/ /www.genecards. org/)收集BC 疾病相關(guān)靶點，并將ZBDHD 湯的作用靶點與BC 致病靶點進(jìn)行映射，獲取ZBDHD 湯治療的關(guān)鍵靶點.

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)和 Hub 靶點分析

將關(guān)鍵靶點上傳String 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置研究物種為智人，設(shè)置條件為score ＞0.4，使用Cytoscape 軟件(3.7.2 版)繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)展示圖，并使用CytoHub 插件依據(jù)各蛋白之間互作次數(shù)顯示PPI 網(wǎng)絡(luò)中最重要的模塊，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)的Hub 靶點(核心靶點).

1.5 Hub 靶點的 GO 和 KEGG 富集分析

為了揭示ZBDHD 治療 BC 的 Hub 靶點在 BC 發(fā)病中的GO 和 KEGG 過程，借助 DAVID 6.8(http:/ /david. abcc. ncifcrf. gov/) 對 Hub 靶點進(jìn)行 GO 和KEGG 富集分析. DAVID 是一個生物信息數(shù)據(jù)庫，整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，可對大規(guī)?；騃D 或蛋白ID 列表進(jìn)行基因的差異分析或是通路的富集，幫助用戶從中提取生物學(xué)信息(GO 分析和KEGG 通路分析).

1.6 組分-Hub 靶點分子對接

將從Pubchem 獲取關(guān)鍵藥效組分的3D 結(jié)構(gòu)式以*sdf 格式保存，借助 Discovery Studio 4.5 將*sdf 格式文件轉(zhuǎn)化為*mol2 格式. 從 PDB 數(shù)據(jù)庫(https:/ /www.rcsb. org/)下載 Hub 靶點的 3D 結(jié)構(gòu)*PDB 格式，運用Schr?dinger(2018)軟件進(jìn)行分子對接驗證.首先，將每個Hub 靶點導(dǎo)入平臺，進(jìn)行加氫原子，去除水分子，處理重原子，調(diào)整鍵序等前處理，選用OPLS＿2005 力場進(jìn)行能量最小化優(yōu)化處理，直到非氫原子的均平方根偏差(root-mean- square deviation，RMSD)減小為3 nm. 接著，利用Glide 對接模塊分析蛋白活性點結(jié)合口袋，以各蛋白原配體為中心生成活性格點盒子；其中蛋白和配體間范圍設(shè)置為1.0/0.8；進(jìn)行10 次模擬對接，取得分平均值，獲取ZBDHD 治療BC的證據(jù)支持.

2 結(jié)果

2.1 活性組分的篩選

通過 TCMSP、HERB、TCMIP 數(shù)據(jù)庫檢索到 ZBDHD 中所含化學(xué)組分共673 個，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18 為閾值，對673 個組分進(jìn)行篩選，并結(jié)合藥典及文獻(xiàn)報道對組分進(jìn)行增刪，最終確定ZBDHD 活性組分72 個，其中熟地黃8 個，山茱萸6 個，山藥12 個，澤瀉 5 個，茯苓 8 個，丹皮 9 個，知母 5 個，黃柏 19 個.

2.2 關(guān)鍵靶點的獲取

借助TCMSP 獲得ZBDHD 作用靶點221 個，通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得9296 個BC 疾病相關(guān)靶點，以relevancescore≥10 為閾值，確定 BC 相關(guān)靶點1416個.如圖1 所示，將1416 個疾病靶點與221 個ZBDHD作用靶點進(jìn)行映射，最終確定了ZBDHD 治療BC 關(guān)鍵靶點 45 個，包括 INS，IL6，EGFR，MYC，VEGFA 等.

圖1 ZBDHD 與BC 交集靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of intersection targets of ZBDHD and BC

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將45 個關(guān)鍵靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，將研究物種為選擇為“homo sapiens”，將 minimum required interaction score 設(shè)置為大于0.4，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖.再將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制45 個關(guān)鍵靶點蛋白間作用關(guān)系.如圖2A 所示，節(jié)點大小與蛋白在PPI 網(wǎng)絡(luò)中的重要程度成正比，節(jié)點顏色由黃至紫代表節(jié)點Degree 值逐漸增大. 此后，使用Cyto-Hub 插件確定PPI 網(wǎng)絡(luò)中最重要的模塊，可最終得到子網(wǎng)絡(luò)的 6 個 Hub 靶點(VEGFA，F(xiàn)OS，MYC，CASP3，CCND1，HIF1A)，如圖 2B 所示.

圖2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作圖注:A.45 個關(guān)鍵蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)；B.6 個Hub 靶點的互作網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Protein-protein interaction network diagram

2.4 GO 及 KEGG 富集分析

為了進(jìn)一步驗證潛在作用的靶點，在PPI 網(wǎng)絡(luò)中，將6 個Hub 靶點信息導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO 富集分析. 結(jié)果顯示，6 個 Hub 靶點富集得出759 條GO 富集結(jié)果，其中生物功能(BP)702 條，細(xì)胞的組成(CC)15 條和分子的功能(MF)42 條，發(fā)現(xiàn)Hub 靶點主要富集在生物功能(BP)途徑.GO 富集中的Hub 靶點通過激活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控葡萄糖代謝，血管生成，MAP 激酶活性，脂多糖介導(dǎo)的信號通路等路徑，在細(xì)胞外泌體，細(xì)胞間隙，細(xì)胞核中發(fā)揮作用(如圖3). 對Hub 靶點進(jìn)行KEGG 通路分析. 如圖4 所示，Hub 靶點主要集中在晚期糖基化終末產(chǎn)物與其受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK 信號通路(MAPK signaling pathway)、甲狀腺激素信號通路(Thyroid hormone signaling pathway)、p53 信號通路(p53 signaling pathway)等. 這些通路主要通過炎癥、生物代謝途徑作用于BC，與PPI 結(jié)果一致.

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前6 個 Hub 靶點和GO 富集分析Fig.3 Top 6 Hub genes in the PPI network and GO enrichment analysis

圖4 Hub 靶點的KEGG 代謝通路富集分析Fig.4 Enrichment analysis of KEGG metabolic pathway of Hub genes

2.5 分子對接驗證

為驗證Hub 靶點具體與ZBDHD 哪些成分參與抗BC，將6 個Hub 靶點與ZBDHD 成分依次對接.一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時發(fā)生作用的可能性與結(jié)合能大小呈負(fù)相關(guān)，本研究選擇結(jié)合能≤-6 kJ·mol-1作為判定對接有效的閾值[11-12]. 如圖5所示，ZBDHD 集中作用于 CASP3，HIF1A，CCDN1 三個靶點，而對VEGFA，MYC，F(xiàn)OS 的結(jié)合效應(yīng)較弱.篩選獲得候選活性化合物9 個，分別為梓醇、密力特苷、毛蕊花糖苷、知母皂苷BII、牡丹皮苷C、芍藥苷、兒茶素、苯甲?；趸炙庈铡⒌攸S苷D，結(jié)構(gòu)信息見圖6，可為抗BC 先導(dǎo)化合物開發(fā)提供參考.毛蕊花糖苷與HIF1A 和CCND1 的結(jié)合得分最高，與CASP3 的結(jié)合得分排名第二，借助Schr?dinger 構(gòu)建毛蕊花糖苷與三個靶點的結(jié)合模式圖，見圖7 ～9.如圖7B，毛蕊花糖苷與 HIF1A 的氨基酸殘基 ILE233、LYS532、GLU530、GLU261、GLU257 形成氫鍵相互作用；如圖 8B，毛蕊花糖苷與CCND1 的氨基酸殘基GLU75、GLN183 形成氫鍵相互作用；如圖9B，毛蕊花糖苷與CASP3 的氨基酸殘基 PHE250、GLU248、GLU246、ASP211、ASN208、ARG207 形成氫鍵相互作用，與殘基PHE250 形成Pi-Pi 堆積作用.

圖5 分子對接的聚類分析熱圖Fig.5 The heat map of cluster analysis for molecular docking results

圖6 9 個候選活性化合物的分子結(jié)構(gòu)信息Fig.6 The molecular structures of nine candidate active compounds

圖7 HIF1A 與毛蕊花糖苷的結(jié)合模式圖注:A.三維結(jié)合模式圖；B.平面結(jié)合模式圖Fig.7 Binding pattern diagram of HIF1A and Verbascoside

圖8 CCND1 與毛蕊花糖苷的結(jié)合模式圖注:A.三維結(jié)合模式圖；B.平面結(jié)合模式圖Fig.8 Binding pattern diagram of CCND1 and Verbascoside

圖9 CASP3 與毛蕊花糖苷的結(jié)合模式圖注:A.三維結(jié)合模式圖；B.平面結(jié)合模式圖Fig.9 Binding pattern diagram of CASP3 and Verbascoside

3 討論

BC 仍然是影響泌尿生殖道的主要惡性腫瘤之一，其主要治療方法是經(jīng)尿道電切加BCG 膀胱灌注，但此法對于預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展效果并不理想. ZBDHD 出自《醫(yī)宗金鑒》，姜家康教授臨床將其用于BC治療，取得良好療效[13].如果能從中藥方劑中識別治療BC 的有效組分，將顯著提高患者生存率.

GO 富集中的Hub 靶點通過激活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控葡萄糖代謝，血管生成，MAP 激酶活性等路徑，在細(xì)胞外泌體，細(xì)胞間隙，細(xì)胞核中發(fā)揮作用. 在 KEGG 富集結(jié)果表明，通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路可減少膀胱癌細(xì)胞的入侵和遷移，并調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞凋亡和自噬[14]. 激活MAPK 信號通路，可以增加BC 細(xì)胞和線粒體ROS 的生產(chǎn)[15].激活體外和體內(nèi)的p38/p53/p21 通路，可以抑制BC 細(xì)胞生長，并在G1 誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻塞[16].

分子對接的結(jié)果表明，毛蕊花糖苷、梓醇、知母皂苷BII、兒茶素等9 個化合物與關(guān)鍵靶點的結(jié)合效應(yīng)較好.特別是毛蕊花糖苷與HIF1A 和CCND1 的結(jié)合打分排名第一，與CASP3 的結(jié)合得分在所有中藥組分中排名第二，有望成為治療BC 的候選活性化合物.毛蕊花糖苷來自于地黃，地黃主要含有環(huán)烯醚萜苷類、糖苷類、氨基酸類等化學(xué)成分，其中入血成分有毛蕊花糖苷、梓醇、地黃苷D、密力特苷、5-羥甲基糠醛、益母草苷等[17]. 現(xiàn)有的多項研究均表明，毛蕊花糖苷在結(jié)直腸癌[18]、前列腺癌[19]及口腔鱗狀細(xì)胞癌[20]等多種癌癥類型中都顯示出了顯著的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，是一種有效的抗腫瘤活性成分. 高娟等的研究顯示，膀胱癌患者尿液外泌體HIF1A 反義RNA2(HIF1A-AS2)表達(dá)水平明顯升高，有望成為膀胱癌診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[21]，而在結(jié)腸癌細(xì)胞中，毛蕊花糖苷可顯著抑制HIFA 等EMT 標(biāo)志物的表達(dá)，抑制其侵襲和遷移[18].此外，梓醇、知母皂苷BII、兒茶素、地黃苷D 等中藥組分也被報道具有不同程度的抗腫瘤[22]或協(xié)同增效[23-24]作用，驗證了篩選模型的有效性.

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法預(yù)測ZBDHD 治療BC 的核心靶點及涉及的生物學(xué)通路，推測該方劑通過干預(yù)抗炎、調(diào)節(jié)糖脂代謝及氧化應(yīng)激等過程發(fā)揮治療作用，為闡明ZBDHD 對BC的作用機(jī)制提供了計算機(jī)大數(shù)據(jù)背景下的理論依據(jù).值得注意的是，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)未能考慮劑量、劑型對藥效的影響，闡釋ZBDHD 抗BC 作用機(jī)制仍需更為深入體內(nèi)外實驗的進(jìn)行研究.