唐俊妮

(西南民族大學食品科學與技術(shù)學院，四川成都 610041)

1 乳酸菌的概述

乳酸菌(LAB)是一類異源的非產(chǎn)孢、革蘭氏陽性、微需氧、非移動和過氧化氫酶陰性的微生物，包括乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、酒酒球菌屬(Oenococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)、漫游球菌屬(Vagococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)、芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus)和魏斯氏菌屬(Weissella)的各種類別[1].這些LAB 廣泛用于食品發(fā)酵，自古以來就為人類提供了很多益處. 其中的大多數(shù)被認為是安全的，并獲得美國食品和藥物管理局(FDA)的GRAS(Generally Recognized as Safe)認證.LAB 作為食品工業(yè)的發(fā)酵劑，益生菌和食品補充劑，被認為對人體健康有益[2]，其主要特征是能夠發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸，這些細菌根據(jù)其發(fā)酵的最終產(chǎn)物差異分為同型發(fā)酵或異型發(fā)酵，同型發(fā)酵中葡萄糖轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn)物是乳酸，而異型發(fā)酵中除乳酸外，還產(chǎn)生了其他物質(zhì)，如二氧化碳、乙酸和乙醇[3].LAB 對低pH 值具有很高的耐受性，作為一種天然的防御機制，乳酸菌自身能夠產(chǎn)生多種具有抗菌活性的物質(zhì)，包括有機酸、過氧化氫和細菌素等. 在食品工業(yè)中具有廣泛的用途[4].

2 乳酸菌的分子鑒別技術(shù)

由于LAB 的異質(zhì)性，傳統(tǒng)的識別與分類主要是基于表型、生化和生理檢測，例如，乳桿菌屬最早是由Beijerinck 于1901 年提出，其定義為革蘭氏陽性、發(fā)酵性、兼性厭氧和不形成芽孢的微生物，這種定義很模糊[5].由于傳統(tǒng)分類的程序復雜，乳酸菌的營養(yǎng)和生長需求不同，鑒別力較低，有些菌株很難識別，僅限于表型特征對一些新型菌株進行分類會造成模糊不清，因此，需要分子工具進行確認[6-7]. 目前已經(jīng)應(yīng)用的分子工具，包括核糖體基因分型(Ribotyping)，擴增核糖體DNA 限制性分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA)，隨機擴增多態(tài)性 DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)，擴增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)，脈沖場凝膠電泳(Pulse field gel electrophoresis，PFGE)，重復序列 PCR(Repetitive extragenic palindromic PCR，Rep-PCR)，變性/溫度梯度凝膠電泳(Denaturing(D)/temperature(T) gradient gel electrophoresis，DGGE/TGGE)，末端限制性片段長度多態(tài)性(Terminal (T)-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)，細菌多位點序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)，實時-PCR(Real-time PCR)，微陣列(Microarrays)，質(zhì)譜(Mass spectrometry，MS)，全基因組測序(Whole-genome sequencing，WGS)等[1].這些分子方法的具體特點見表1.

表1 乳酸菌的分子鑒別方法及其特性[1]Table 1 Molecular typing tools of LAB and their characteristics

新的分子工具對于乳酸菌的鑒定起到了非常重要的作用，如最近Zheng 等[5]基于全基因組序列重新評估了乳桿菌的分類學.他們建議將乳桿菌屬重新分為25 個類別，包括德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、副乳桿菌(Paralactobacillus)、霍爾扎普菲兒氏菌(Holzapfelia)，淀粉乳桿菌(Amylolactobacillus)，蜂乳桿菌(Bombilactobacillus)，伴生乳桿菌(Compa-nilactobacillus)，石墻乳桿菌(Lapidilactobacillus)，農(nóng)田乳桿菌(Agrilactobacillus)，施萊弗乳桿菌(Schleiferilactobacillus)，腐敗乳桿菌(Loigolactobacilus)，乳酪桿菌(Lacticaseibacillus)，廣泛乳桿菌(Latilactobacillus)，德拉格里奧氏菌(Dellaglioa)，液體乳桿菌(Liquorilactobacillus)，聯(lián)合乳桿菌(Ligilactobacillus)，乳植物桿菌(Lactiplantibacillus)，糠乳桿菌(Furfurilactobacil-lus)，寡食乳桿菌(Paucilactobacillus)，粘液乳桿菌(Limosilactobacillus)，果實乳桿菌(Fructilactobacillus)，醋乳桿菌(Acetilactobacillus)，蜜蜂乳桿菌(Apilactobacillus)，促生乳桿菌(Levilactobacillus)，次乳桿菌(Secundilactobacillus)，遲緩乳桿菌(Lentilactobacillus). 通過重新分類可以反映不同乳酸桿菌在系統(tǒng)發(fā)育中的位置.

另外，有學者采用riboprinter(一種自動化工具)在屬水平上表征和區(qū)分了91 種嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，riboprinter 工具具有快速、精確且可重復的特征[8].ARDRA 技術(shù)也被用于鑒定源自人類胃腸道的14 種參考乳桿菌屬(Lactobacillus spp. )[9]. Stenico 等[10]通過RFLP 在種和亞種水平上通過分析熱休克蛋白(hsp60)的部分保守基因序列，鑒定了13 種雙歧桿菌，這種技術(shù)具有快速、簡單且具有成本效益的優(yōu)點，但條帶輪廓的復雜性是這種方法的主要限制，需要單獨或組合使用多種限制性內(nèi)切酶來獲得所需的分辨率.Weiss 等[11]使用RAPD 技術(shù)鑒定了羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri). 目前，RAPD 技術(shù)已被廣泛用于表征不同的乳酸桿菌菌株，包括植物乳桿菌(L.plantarum)[12]，短乳桿菌(L.brevis)[13]，嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)和發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)[14].Sharma 等[1]發(fā)現(xiàn)RAPD 也可用作識別酸奶接種和商業(yè)益生菌粉中的腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)， 短 乳 桿 菌 (L.brevis) 和 植 物 乳 桿 菌(L.plantarum). Plessas 等[15]使用基于 RAPD 分析的多重PCR 技術(shù)從奶酪中鑒定出L.paracaseiK5.

隨著NGS 和第三代測序技術(shù)(包括WGS 和高通量測序)的引入使得基于測序的數(shù)據(jù)量空前增加. 目前，通過對不同LAB 菌株的完整基因組序列進行測序，可以準確表征菌株，并在基因組水平解釋LAB 的功能，此外，WGS 還可以提供有LAB 菌株的耐藥性等信息[16].第一個LAB 基因組測序是Bolotin 等[17]對Lactococcuslactis ssp.lactisIL1403 菌株的基因組進行測序，該基因組包含2，365，589 bp，編碼2 310 個蛋白質(zhì).隨后，其他許多LAB 的全基因組序列已經(jīng)很容易獲得.目前，使用廣泛的分子技術(shù)促進了LAB 菌株的鑒定與分型，可以預見，在不久的將來，這些技術(shù)將逐漸取代傳統(tǒng)方法. 但也存在一些制約性，由于基于測序的技術(shù)只能在設(shè)備齊全的實驗室中完成，并且需要高素質(zhì)的人員.對于有限數(shù)量的菌株的分析，仍需使用傳統(tǒng)方法，未來還需開發(fā)具有高判別力、簡單、快速且具有成本效益的新技術(shù)[1].

3 乳酸菌細菌素的概述與分類

細菌素是細菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)性質(zhì)的物質(zhì)，是一組由20 ～60 個氨基酸組成的不同抗菌陽離子疏水肽，細菌素的編碼基因一般位于染色體、質(zhì)?；蚱渌梢苿舆z傳元件中的操縱子上[18]. 這些操縱子是可誘導的，細菌素在細胞外釋放，具有較窄的抑菌譜，可對與生產(chǎn)菌株密切相關(guān)的物種產(chǎn)生殺菌或抑菌作用，但也可影響其他屬、門甚至域[19].細菌素作為細菌的次級代謝產(chǎn)物，在細菌生長周期的穩(wěn)定期產(chǎn)生，環(huán)境因素的影響，包括細菌細胞密度、營養(yǎng)的可用性、乙酸的存在和信號肽等會促進細菌素的分泌[20].據(jù)報道，細菌素的抑菌活性是其他各種抗菌劑(包括傳統(tǒng)抗生素)的103～106倍.因此，產(chǎn)生細菌素的細菌能夠合成自身免疫蛋白，通過清除細菌素或受體細菌素的拮抗劑競爭來保護它們自己免受細菌素的侵害[21]. 盡管已知革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都會產(chǎn)生這些抗菌肽，但LAB 是細菌素的主要生產(chǎn)者，從LAB 分離出的細菌素在食品工業(yè)中作為生物防腐劑和對抗人類食品病原菌占有有用的地位，LAB 產(chǎn)生的細菌素的應(yīng)用也越來越廣泛[22].

隨著細菌素的多樣性和復雜性，細菌素的分類也在不斷發(fā)展變化[23]. 細菌素的分類主要是基于其本身的物理化學性質(zhì)、分子量大小、結(jié)構(gòu)中包含的特定氨基酸、熱穩(wěn)定性、涉及的環(huán)狀分子遺傳學特征，以及含有其他化合物如脂質(zhì)或碳水化合物等[4].革蘭氏陰性菌的細菌素主要來自腸桿菌科家族(Enterobacteriaceae)，根據(jù)其分子量分為兩類:包括較高分子量的大腸菌素(Colicins)和較低分子量的小菌素(Microcins).而由革蘭氏陽性菌產(chǎn)生的細菌素可進一步分為四個不同的類別[22]，這四類細菌的特征詳見圖1.

圖1 乳酸菌細菌素的分類與特征[22]Fig.1 Classification and characteristics of LAB bacteriocins

I 類細菌素被稱為羊毛硫細菌素(Lantibiotics)，是由不尋常的肽、羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸組成，如圖2 所示. 最常見的I 類細菌素是乳酸鏈球菌素(Nisin)、腸球菌素(Enterocin)和枯草菌素(Subtilin)，它們含有多環(huán)硫醚氨基酸、脫氫丙氨酸和氨基丁酸等不飽和氨基酸[24]. 雖然這類細菌素的分子量小于5 kDa，但它們熱穩(wěn)定性好，根據(jù)形狀和電荷可進一步分為3 個亞型:Ia、Ib 和Ic.II 類細菌素稱為非羊毛硫細菌素，是由常見氨基酸組成的未經(jīng)修飾的肽類，該類細菌素由4 個亞類組成，也是一種熱穩(wěn)定肽，Ⅱ類細菌素相比于Ⅰ類、Ⅲ類和Ⅳ類細菌素具有更強的穩(wěn)定性和抑菌活性以及更廣的抑菌譜[25]，它們的分子量小于10 kDa，片球菌素(Pediocin)和乳桿菌素(Lactacin)是該類中研究廣泛的細菌素.III 類細菌素的分子量大于10 kDa，它們對熱不穩(wěn)定，包括細菌溶解肽和非溶解肽，其中，溶葡萄球菌素(Lysostaphin)是一種研究較為充分的溶菌素，另外，腸溶素A(Enterolysin A)也得到了一定的研究. 第IV 類細菌素是由復雜的環(huán)肽組成，其中包括脂質(zhì)和碳水化合物，目前對這一類細菌素仍知之甚少[22].

圖2 Nisin 的一級結(jié)構(gòu)[24]Fig.2 Primary structure of nisin

4 乳酸菌細菌素的生物合成

乳酸菌細菌素是由核糖體合成的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)類復合物，在生物學上最初是無活性的，經(jīng)過修飾成為具有生物活性的物質(zhì).新合成的細菌素含有一個N 末端前導，在它們被輸出到細胞外之前，會被細菌素基因簇編碼的蛋白質(zhì)或氨基酸修飾，如通過絲氨酸和蘇氨酸殘基脫水形成的硫醚交聯(lián)，隨后將半胱氨酸立體選擇性地添加到不飽和氨基酸上[26]. 具有生物學意義的細菌素必須從細胞中分泌出來[27]. 針對I 類細菌素的合成，以Nisin 為例進行說明，如圖3，Nisin 由包含nisA、nisB、nisC、nisP 和nisT 等基因簇編碼，nisA 基因轉(zhuǎn)化為 NisA 前體肽，然后通過nisB 和nisC 基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為 NisA，NisA 通過nisT 和nisP 的幫助下輸出到細胞外，這個過程進一步伴隨著前導肽的切割，最終產(chǎn)生成熟的Nisin[28].

圖3 Nisin 生物合成示意圖[28]Fig.3 Schematic representation of nisin biosynthesis

Ⅱ類細菌素的分泌機制一般采用雙甘氨酸引導序列轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，也有一些是信號依賴性，由分泌途徑轉(zhuǎn)移膜蛋白系統(tǒng)進行加工和轉(zhuǎn)運. 此外，大多數(shù)I 型和II 型細菌素通過特定的ABC 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到細胞外[29].II 類細菌素還可產(chǎn)生激活調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的誘導因子，這種誘導因子構(gòu)成負責II 類細菌素生物合成信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的一部分[30].對于環(huán)狀細菌素，盡管目前也觀察到前導肽的切割、環(huán)化和轉(zhuǎn)運到細胞外空間等步驟的獨立發(fā)生，但還很難理解其生物合成的具體過程，大多數(shù)乳酸菌細菌素的生物合成仍是個謎[22].

對于細菌素的表達，受外部誘導因子的調(diào)節(jié)，如溫度和pH 等培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基的性質(zhì)和組成會影響細菌素的產(chǎn)量[31]. Goh 和Philip[32]使用MRS 培養(yǎng)基從融合魏斯氏菌(Weisellaconfusa)產(chǎn)生一種稱為Weisellicin 的細菌素，細菌素在培養(yǎng)8 h 后開始形成，并在18 h 內(nèi)達到最佳產(chǎn)量. 細菌素的抗菌活性在生長18 至24 h 之間持續(xù)，但在28 h 后開始下降. Elayaraja 等[33]發(fā)現(xiàn) 35 °C 和 pH 6.0 是從海洋沉積物中分離的鼠乳桿菌AU06(Lactobacillus murinusAU06)生產(chǎn)細菌素的理想條件. Malheiros 等[34]從發(fā)酵肉中分離一株Lactobacillus sakeisubsp.Sakei2a，通過使用響應(yīng)面法，發(fā)現(xiàn)在MRS 肉湯中添加5.5 g/L 葡萄糖和1.05% Tween 20，在 pH 6.28 和 25 °C 孵育是該菌產(chǎn)細菌素的最佳優(yōu)化條件. 肖珊等[35]研究了乳酸菌產(chǎn)細菌素的生物學特性并優(yōu)化其培養(yǎng)條件，認為最佳培養(yǎng)條件為初始pH 為6.5、接種量4%，發(fā)酵溫度35 ℃時，細菌素抑菌活性比優(yōu)化前提高了1.36 倍. 可見，細菌素的產(chǎn)生須針對培養(yǎng)基、溫度和pH 等條件進行優(yōu)化.

5 細菌素的作用機制

細菌素的作用機制取決于它們的一級結(jié)構(gòu)，大多數(shù)細菌素直接作用于細胞膜或靶細胞上的特定受體，通過在細菌細胞膜上形成孔，導致細胞死亡. 有些細菌素也可進入細胞質(zhì)，并影響基因表達和蛋白質(zhì)合成[36].I 類細菌素(羊毛硫細菌素)作用機制主要通過靜電相互作用(楔狀孔)或通過與脂質(zhì)II 結(jié)合在靶膜中形成孔，如圖4 所示，脂質(zhì)II 的形成分為兩個步驟:(1)UDP-N-乙酰胞壁酰五肽通過酶MraY 與磷酸十一碳二烯酯連接獲得脂質(zhì)I；(2)脂質(zhì)I 通過MurG 酶將一個N-乙酰氨基葡糖與N-乙酰胞壁?；B接，得到脂質(zhì)II，脂質(zhì)II 跨膜轉(zhuǎn)移到外側(cè)并寡聚化形成細胞壁[37].I 類細菌素(羊毛硫細菌素)通過與脂質(zhì)II(肽聚糖單體的疏水載體)結(jié)合抑制細菌細胞壁的生物合成，從而損害細胞活力.I 類細菌素通常是具有陽離子性質(zhì)的肽，這些陽離子肽與細胞質(zhì)膜的陰離子表面相互作用，含有大部分帶正電殘基的C 末端區(qū)域通過靜電相互作用與細胞質(zhì)膜中陰離子磷脂的頭部基團結(jié)合.羊毛硫細菌素插入細胞質(zhì)膜通常是由其N 末端區(qū)域的疏水殘基介導.

學者們提出了兩種不同的羊毛硫細菌素孔形成模型:“桶形”和“楔形”模型[38]. 在桶形模型中，羊毛硫細菌素單體通過靜電相互作用，隨著膜的疏水脂質(zhì)核心與細菌素的非極性側(cè)鏈相互作用，形成類似充滿水的孔(圖4)，桶形孔的大小和穩(wěn)定性取決于肽的數(shù)量多少.在楔形模型中，由于陽離子細菌素與陰離子磷脂的頭部基團之間的相互作用，觀察到膜的局部變形，從而允許細菌素的疏水殘基插入內(nèi)部膜. 細胞質(zhì)膜孔的形成會伴隨著自由能的增加，細菌細胞在代謝階段產(chǎn)生跨膜電勢(Δψ)被認為是主要的驅(qū)動力. 孔的形成也會受pH 值影響，在高pH 條件下，Nisin 單體在膜外聚集，顯著降低其活性. 羊毛硫細菌素與聚異戊二烯連接的細胞壁前體脂質(zhì)II 的結(jié)合可以促進孔的形成[39].體外實驗表明，脂質(zhì)II 的存在能夠顯著增加Nisin 的活性，對Nisin 和脂質(zhì)II 相互作用的核磁共振分析表明，Nisin 骨架和焦磷酸結(jié)構(gòu)域之間存在五個分子間氫鍵網(wǎng)絡(luò)，其他研究也揭示了在N 末端區(qū)域存在一個保守的 Motif，該Motif 參與脂質(zhì)II 結(jié)合，并且該Motif 也存在于其他Ia 型羊毛硫細菌素中，如Subtilin、Epidermin、Gallidermin 和 Mutacin 等. 除了形成高度特異性的孔外，Nisin 還可以通過與脂質(zhì)II 的結(jié)合來抑制細胞壁合成.Ib 型羊毛硫細菌素的結(jié)構(gòu)與Nisin 完全不同，它們通過與脂質(zhì)II 形成復合物來阻礙肽聚糖生物合成過程中的轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng).這兩種羊毛硫細菌素中高度保守的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可能與抗菌活性有關(guān)[37].

圖4 I 類細菌素(羊毛硫細菌素)作用機制示意圖[37]Fig.4 The schematic diagram of class I bacteriocins (lantibiotics) action mechanism

II 類細菌素(非羊毛硫細菌素)，如類片球菌素和單肽類非片球菌素(IIa 類和IId 類)，可與甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶-通透酶(Man-PTS)的 MptC 和 MptD 亞基結(jié)合.這些細菌素插入靶細胞膜，會導致膜通道的不可逆打開，離子通過膜擴散，從而導致靶細胞死亡. IIb類，是未經(jīng)修飾的二肽類細菌素，可滲透敏感細菌的膜形成孔，這些孔對單價陽離子(Na ＋ 、K ＋、Li ＋、Cs＋和Rb ＋)具有特異性.多組分細菌素(IIc 類)具有正凈電荷，這些肽直接與帶負電荷的細菌膜相互作用，不需要任何受體分子，在細胞膜中形成孔，使得離子流出和膜電位消散，導致細胞死亡.

III 類細菌素是作用于細菌細胞壁的內(nèi)肽酶，如細菌溶解肽(IIIa 類細菌素)可催化細胞壁水解，導致細胞裂解.非溶菌性細菌素(IIIb 類)是通過擾亂細胞對葡萄糖的攝取，使它們挨餓和擾亂膜電位發(fā)揮作用[21].有些細菌素還可以通過跨膜作用進入細胞，干擾細胞的正常生命活動，抑制目標細菌的DNA 和蛋白質(zhì)的生物合成[40].

6 不同乳酸菌產(chǎn)生的細菌素

乳酸菌可作為發(fā)酵劑、生物防腐劑甚至益生菌，在許多不同類型食物生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用. 應(yīng)用LAB 被認為是食品保存的最古老方法之一.乳酸菌細菌素通常根據(jù)生產(chǎn)菌株的屬或種進行命名，例如，Lacticin 和Nisin 由乳球菌屬產(chǎn)生，Enterocin 由腸球菌屬產(chǎn)生，Pediocin 由片球菌屬產(chǎn)生，Leucocin 由明串珠菌屬產(chǎn)生，等. 如Todorov 等[41]描述了不同種類的細菌素 Nisin(I 類)、Pediocins(IIa 類)、Plantaricins(IIb類)、部分Enterocins(一些屬于IIc 類)和Durancin(IV類)對梭菌屬具有拮抗活性.隨著科學的發(fā)展，學者對細菌素的鑒定有了很大的進步，BAGEL 等數(shù)據(jù)庫為鑒定細菌素編碼基因提供了平臺，通過BAGEL 數(shù)據(jù)庫分析乳酸菌的基因組，目前一共產(chǎn)生了785 個細菌素基因簇[42].在這里，只討論幾個主要的乳酸菌屬及其合成的細菌素.

(1)乳球菌及其產(chǎn)生的細菌素

乳球菌是一類中溫乳酸菌，是乳制品行業(yè)使用最廣泛的發(fā)酵劑，用于生產(chǎn)各種發(fā)酵食品，如奶酪、酸奶和奶油酪乳等.它們可以在牛奶和發(fā)酵蔬菜中很好地生長，并且不需要額外的化合物或其他促進細菌，此外，它們可以利用多種底物，在微需氧或厭氧條件下存活，產(chǎn)生酸(乳酸、乙酸、丙酸等)，并降低pH 值和氧化還原電位.

乳球菌產(chǎn)生的細菌素和抗真菌化合物對許多食品腐敗和產(chǎn)毒微生物具有活性，并能夠賦予發(fā)酵食品多種特性[43].乳球菌屬的成員主要分為五種:乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、加氏乳球菌(Lactococcusgarviea)、魚乳球菌(Lactococcuspiscium)、植物乳球菌(Lactococcusplantarum)和乳球菌棉籽糖亞種(Lactococcusraffinolactis).在這五種乳球菌屬中，以乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)特征最為明確，在奶酪生產(chǎn)中具有重要經(jīng)濟價值，易于生長和操作，是工程研究的模式生物.乳酸乳球菌在遺傳上又被細分為四個亞種:L.lactis subsp.lactis，L.lactis subsp.hordniae，L.lactissubsp.cremoris， 和L.lactis subsp.tructae.L.lactis subsp.lactis通常與乳制品和蔬菜發(fā)酵有關(guān)，其主要風味形成酶是轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸脫氫酶，轉(zhuǎn)氨酶在發(fā)酵乳制品時催化氨基酸向?qū)?yīng)的α-酮酸(α-酮戊二酸)轉(zhuǎn)化，谷氨酸脫氫酶在發(fā)酵非乳制品時將谷氨酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸.該菌株的一個重要特征是無法在人體胃腸道(GIT)中定殖，但可抵抗胃酸和膽汁，能夠通過GIT.乳酸乳球菌是第一個完成基因組測序的LAB，通過測序能夠更好地了解其遺傳和生理機制[3].

乳球菌通常產(chǎn)生1 類細菌素，I 類羊毛硫細菌素也是迄今為止探索最多的細菌素，如Nisin 是最具特色的細菌素.迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了8 種Nisin 變體(稱為 A、Z、F、Q、U、U2、P 和 H)，分別由Lactococcus spp.(A、 Z、 F、 Q)，Streptococcus uberis( U、 U2 ))，S.hyointestinalis( H)，S.suis和S.gallolyticus subsp.pasteurianus(P)產(chǎn)生.在實驗室條件下以及在商業(yè)食品中，Nisin 對一系列病原菌具有活性.Nisin 在許多國家被許可作為食品添加劑，并已成功應(yīng)用于控制不同的食源性病原菌，包括金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等.如Leriche 等[44]通過競爭和排除實驗確定了乳酸乳球菌L.lactisCNRZ 150(NisinZ 的生產(chǎn)者)對單增李斯特菌生物膜形成的影響. Nisin A 和NisinZ 具有34 個氨基酸，僅在第27 位處有一個氨基酸不同，它們的活性非常相似，但溶解度存在差異.眾所周知，與Nisin Z 相比，Nisin A 更易溶于酸性pH 溶液[45].Rodrigues 等[46]的研究發(fā)現(xiàn)乳球菌屬也可能成為臨床乳腺炎的新興病原體，乳球菌屬作為致病菌出現(xiàn)可能與促進它們生長和進入乳房的環(huán)境變化有關(guān)，或者與改進的生化和先進的分子技術(shù)有關(guān)，盡管鏈球菌屬經(jīng)常被認為是臨床乳腺炎樣本中最常見的分離病原體之一，但新的技術(shù)(如MALDI-TOF)能夠準確鑒定乳球菌屬，而不再是錯誤分類為鏈球菌屬[47]. 因此，未來在乳球菌應(yīng)用上，一定要對具體的菌株進行安全性評價.

(2)乳桿菌及其產(chǎn)生的細菌素

乳桿菌屬是傳統(tǒng)發(fā)酵乳飲料和傳統(tǒng)發(fā)酵食品中常見的發(fā)酵劑，有著廣泛的健康益處，如抗菌活性；膽固醇代謝；免疫調(diào)節(jié)；抗氧化作用；抗糖尿病作用；抗過敏和抑制腫瘤作用等，這些益處和機制與特定乳酸桿菌種屬或菌株有關(guān)[48]. 如植物乳桿菌至少可以產(chǎn)生六種不同的細菌素，其中，plantaricin 也是已知最重要的細菌素之一.Zhang 等[49]從中國傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離出來的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarumJ23)，產(chǎn)生的細菌素 J23 在 100 ℃，30 min 表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性，pH 穩(wěn)定性范圍在2.0 ～12.0 之間，對單增李斯特菌的抗菌活性強，認為細菌素J23 在食品工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用前景. Ben Omar 等[50]從剛果發(fā)酵玉米產(chǎn)品poto 中分離出產(chǎn)細菌素的L.plantarumC11 對腸炎沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌、糞腸球菌和單增李斯特菌具有抑菌活性，并可用于提高發(fā)酵玉米產(chǎn)品poto 的安全性和貯藏穩(wěn)定性. Zhao 等[51]從中國傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中分離出植物乳桿菌JLA-9，并純化得到一種新的細菌素plantaricin JLA-9，該細菌素對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌以及芽孢桿菌屬表現(xiàn)出廣譜抗菌活性，具有熱穩(wěn)定性(20 min，121 °C)，認為 plantaricin JLA-9 在控制芽孢桿菌屬具有潛在的應(yīng)用價值. Song 等[52]從發(fā)酵芥末中分離 plantaricin ZJ5，具有極高的pH 和熱穩(wěn)定性，對金黃色葡萄球菌有很強的活性，使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)發(fā)現(xiàn)plantaricin ZJ5 的分子量為2572.9 Da.使用氨基酸測序和DNA 測序確定該肽的一級結(jié)構(gòu)，為44 個殘基的前體，其中含有22 個氨基酸的N 端延伸，屬于雙甘氨酸類型.與數(shù)據(jù)庫中可用的細菌素序列相比，細菌素序列與已知細菌素沒有同源性，表明是一種新的IId類細菌素[42].可見，新型細菌素的開發(fā)將具有廣泛的應(yīng)用前景.

(3)腸球菌及其產(chǎn)生的細菌素

腸球菌是繼乳桿菌屬和乳球菌屬之后的第三大乳酸菌，它也是人類和動物胃腸道中普遍存在的細菌，廣泛存在于蔬菜、肉類、牛奶和奶酪中. 楊珍珠等[53]從鮮羊奶中篩選獲得2 株糞腸球菌(DH9003 和DH9012)和1 株乳酸乳球菌(DH9011).3 株乳酸菌的抑菌產(chǎn)物具有細菌素的特征(耐高溫和蛋白酶處理后失活)，且在低質(zhì)量濃度條件下(MIC50 和4MIC50)可阻止單增李斯特菌生長，具有益生菌特質(zhì)及應(yīng)用價值.盡管人們擔心腸球菌作為重要的機會病原體存在可能會導致多種感染，但它們表現(xiàn)出多種功能，大多數(shù)從腸球菌中鑒定的細菌素屬于II 類.目前已經(jīng)報道了腸球菌細菌素的純化和遺傳特征，其中大部分來自糞腸球菌(E.faecalis)和屎腸球菌(E.faecium)[42，54].由于這些細菌素中的一些不能根據(jù)傳統(tǒng)分類與典型LAB 細菌素歸為一類，F(xiàn)ranz 等[55]提出將 Enterocins分為四個新類別，該分類方案主要基于結(jié)構(gòu)差異和氨基酸序列.盡管腸球菌細菌素通常對許多食源性致病菌具有抑制作用，但使用腸球菌作為起始培養(yǎng)物的缺點是它們不具有GRAS(通常被認為是安全的)認證.因此，在使用時必須對發(fā)酵劑培養(yǎng)物或產(chǎn)細菌素的腸球菌進行潛在毒力因子以及抗生素抗性基因的篩選與評價.

7 結(jié)語與展望

本文概述了乳酸菌及其產(chǎn)生的細菌素，特別是細菌素的特性、來源與分類、生物合成與潛在應(yīng)用，以及影響因素等. 強調(diào)了正確選擇適用于食品工業(yè)LAB菌株的重要性.LAB 作為細菌素的主要生產(chǎn)菌株，其產(chǎn)生的細菌素是一種多功能的抗菌劑，具有明顯的效力，可用作生物防腐劑、抗生素替代品、促進腸道健康的調(diào)節(jié)劑和動物生長促進劑.未來要充分利用細菌素作為抗菌肽的潛力，通過對LAB 的基因組廣泛挖掘，為細菌素的應(yīng)用開辟更廣泛的可能性.