袁 婧，張欣欣，周 迪，楊 帥，周家彥，梁愛心,2，楊利國,2*

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，武漢 430070；2. 水牛繁育與加工湖北省工程研究中心，武漢 430070)

生長抑素(somatostatin，SS)能夠抑制細胞的增殖和多種神經(jīng)內(nèi)分泌激素的分泌，包括生長激素(GH)、胰島素(INS)、促甲狀腺激素(TSH)、三碘甲狀腺原氨酸(T)和四碘甲狀腺原氨酸(T)等，從而抑制動物的生長。皮質(zhì)抑素(cortistatin，CST)是一種內(nèi)源性神經(jīng)肽，能與所有的SS受體結(jié)合，具有SS類似的功能。利用SS的免疫中和作用可以促進畜禽的生長。目前，國內(nèi)外已經(jīng)研制了多種生長抑素DNA疫苗，在小動物上取得了良好的免疫效果和增重效果，但在大動物上的效果卻不容樂觀。為了進一步提高生長抑素DNA疫苗的免疫效果，本實驗室構(gòu)建了以減毒沙門菌為載體的SS和CST雙表達DNA疫苗(pVGS/2SS-2A-S/CST-asd)，發(fā)現(xiàn)其能顯著提高小鼠的平均日增重，并探索了鼻飼接種雙表達DNA疫苗對水牛免疫效果的影響，發(fā)現(xiàn)增重效果不明顯，這嚴重限制了雙表達疫苗的推廣應用。因此，急需探討雙表達DNA疫苗在大動物上的最佳免疫程序。

影響DNA疫苗免疫效果的因素有很多，其中,免疫接種途徑是影響DNA疫苗效力的一個重要方面。不同的免疫途徑會影響抗原DNA的轉(zhuǎn)染效率 (吸收、表達) 和遞呈效率，從而影響DNA疫苗的免疫效力和免疫應答的持久性。DNA疫苗的接種方式主要包括肌肉注射、基因槍、口服、鼻飼、滴眼等多種途徑。近年來，多種途徑聯(lián)合免疫已經(jīng)成為提高DNA疫苗免疫原性的新型接種方式，且多種途徑聯(lián)合免疫的效果要優(yōu)于單一途徑免疫。

SS和CST雙表達DNA疫苗研究的最終目的是應用于生產(chǎn)實踐，目前，該疫苗免疫多采用單一的免疫方式，而采用組合免疫方式來提高反芻動物生長性能的研究尚未見報道。本試驗探討了口服、噴鼻、口服+噴鼻3種不同免疫方式接種SS和CST雙表達DNA疫苗對奶水牛犢牛免疫效果以及促生長效果的影響，為優(yōu)化DNA疫苗的免疫程序、促進其推廣應用奠定基礎和提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 DNA疫苗 以減毒沙門菌(C500)為載體的SS和CST雙表達非抗性篩選DNA疫苗(pVGS/2SS-2A-S/CST-asd)由祖卓鑫構(gòu)建(質(zhì)粒圖譜如圖1所示)，質(zhì)粒、菌種由本實驗室提供。

GMCSF. 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，467 bp；S/SS. 乙肝表面抗原/生長抑素，388 bp；S/CST. 乙肝表面抗原/皮質(zhì)抑素，726 bp；2A. 2A肽，豬teschovirus-1病毒，66 bpGMCSF. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，467 bp; S/SS. Hepatitis B surface antigen/Somatostatin, 388 bp; S/CST. Hepatitis B surface antigen/Cortistatin，726 bp; 2A. P2A, porcine teschovirus-1 virus, 66 bp圖1 pVGS/2SS-2A-S/CST-asd質(zhì)粒圖譜Fig.1 Plasmid map of pVGS/2SS-2A-S/CST-asd

1.1.2 試驗動物 從湖北勁牛牧業(yè)有限公司選擇27頭2～6月齡、體重體況相近、健康無疾病的雜交奶水牛犢牛用于試驗。

1.1.3 主要試劑 無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒、全血液DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；牛GH、IGF-1、IL-4、INF-γ、T、TELISA試劑盒均購自(泉州)睿信生物科技有限公司；2×Master Mix、ELISA顯色液、ELISA終止液購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；羊抗牛IgG/HRP購自SouthernBiotech公司；DNA Maker、限制性內(nèi)切酶均購自Thermo Fisher Scientific公司；生長抑素標準抗原、皮質(zhì)抑素標準抗原均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 質(zhì)粒的鑒定與DNA疫苗的大量制備

將以減毒沙門菌(C500)為載體的重組DNA疫苗(pVGS/2SS-2A-S/CST-asd)從-80 ℃超低溫冰箱取出，用接種環(huán)接種于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落于200 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖培養(yǎng)過夜，按照北京天根高純度質(zhì)粒小提試劑盒的說明書，提取質(zhì)粒。將雙表達質(zhì)粒pVGS/2SS-2A-S/CST-asd分別經(jīng)Ⅰ/d Ⅲ和Ⅰ/d Ⅲ進行雙酶切，37 ℃水浴2～3 h， 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將鑒定正確的質(zhì)粒送至武漢擎科生物技術有限公司測序。

將鑒定正確的重組菌按1∶100的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min振搖培養(yǎng)16～18 h， 采用平板計數(shù)法檢測細菌濃度，用滅菌的PBS調(diào)整細菌濃度至3×10CFU·mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動物分組、免疫、飼養(yǎng)管理及樣品采集

將27頭2～6月齡的奶水牛犢牛隨機分為4組， 試驗組每組均為7頭，對照組為6頭，試驗組設計3種不同的免疫方式(口服、噴鼻、口服+噴鼻)，分別記為O組、N組、ON組。3個試驗組疫苗的濃度均為3×10CFU·mL，劑量為15 mL·頭，每天兩次(早上9:00，下午15:00)，連續(xù)免疫3 d。對照組(C組)每天用等體積的PBS口服和噴鼻免疫。首次免疫后間隔2周，以相同程序加強免疫一次。試驗期間，所有犢牛均進行人工哺乳(2 L·頭，每天喂兩次)，試驗動物自由飲水、采食(青貯+稻草)。

分別于初免后2、6、10周頸靜脈采血，每頭牛在采血前稱重、測體尺(體高、體長、體斜長、胸圍、胸深、腿臀圍)，采集的血液，3 000 r·min離心10 min，取上清用于后續(xù)試驗。

1.4 SS和CST抗體檢測

采用間接ELISA方法檢測不同時期所有試驗牛血清中抗生長抑素和皮質(zhì)抑素抗體。測定參照劉青方法。在同一稀釋倍數(shù)下，樣本血清的OD值>陰性血清OD平均值+2倍標準差()時，則此稀釋倍數(shù)即為樣本血清的最終抗體滴度，判定為陽性，反之為陰性。

1.5 相關激素及細胞因子的檢測

參照董方曉的方法，用雙抗體一步夾心ELISA法檢測犢牛血清中GH、IGF-1、T、T、IL-4、 INF-γ的含量，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算各樣品中GH、IGF-1、T、T、IL-4、INF-γ的濃度(計算值乘以5為最終濃度值)。

1.6 血清生化指標檢測

將血清樣品送至生工生物工程武漢分公司，采用全自動生化分析儀BS-420進行血清生化指標檢測，檢測項目有總蛋白(TP)、葡萄糖(Glu)、游離脂肪酸(NEFA)、尿素氮(BUN)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

雙表達質(zhì)粒pVGS/2SS-2A-S/CST-asd的雙酶切結(jié)果如圖1，質(zhì)粒經(jīng)Ⅰ和d Ⅲ酶切后，DNA產(chǎn)物電泳后分別在5 000 bp附近以及1 500 bp附近出現(xiàn)條帶(1和2)，與p-2A-S/CST-asd片段(4 535 bp)和GM/2SS片段(1 245 bp)大小一致；經(jīng)Ⅰ和d Ⅲ酶切后，DNA產(chǎn)物電泳后分別在5 000 bp附近以及750 bp附近出現(xiàn)條帶(3和4)，與pVGS/2SS-asd片段(4 992 bp)和2A-S/CST片段(798 bp)大小一致。重組質(zhì)粒的測序結(jié)果與構(gòu)建圖譜序列進行BLAST對比，匹配率100%，無基因突變，進一步說明實驗室所保存的工程菌具有良好的穩(wěn)定性，滿足后續(xù)試驗需求。

2.2 不同免疫方式對犢牛血清SS和CST抗體及細胞因子的影響

3種免疫方式均可以誘導犢牛產(chǎn)生SS抗體(表1)和CST抗體(表2)，各個試驗階段抗體水平不顯著(>0.05)。6周時，O組、N組的抗體水平以及陽性率下降，雖然ON組的陽性率下降，但抗體水平升高。在10周時，O組和N組均檢測不到SS抗體和CST抗體，ON組能檢測到SS抗體，陽性率只有14.29%。從陽性率和產(chǎn)生抗體的持久性方面綜合評判，噴鼻+口服的免疫方式優(yōu)于噴鼻免疫方式，噴鼻免疫方式優(yōu)于口服免疫方式。

從表3可知，隨周齡的增加，3個試驗組IL-4的含量均呈下降趨勢，這與檢測的抗體陽性率結(jié)果一致；2周時，3 個試驗組INF-γ、IL-4的含量均高于對

1、2. 雙表達質(zhì)粒經(jīng)Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ酶切的產(chǎn)物；M. DNA相對分子質(zhì)量標準；3、4. 雙表達質(zhì)粒經(jīng)Xho Ⅰ和Hind Ⅲ酶切的產(chǎn)物1, 2. The enzyme digesting products of pVGS/2SS 2A-S/CST-asd plasmid by Nhe Ⅰ and Hind Ⅲ; M. DNA marker; 3, 4. The enzyme digesting products of pVGS/2SS 2A-S/CST-asd plasmid by Xho Ⅰ and Hind Ⅲ圖2 pVGS/2SS-2A-S/CST-asd質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis diagram of double digestion products for pVGS/2SS-2A-S/CST-asd plasmid

照組，但各組之間差異不顯著(>0.05)；6周時，ON組INF-γ的含量顯著高于C組(<0.05)；10周時，ON組INF-γ的含量均顯著高于O組、N組、C組(<0.05)。說明3種免疫方式均能較好地激發(fā)機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫。

2.3 不同免疫方式對犢牛生長性能的影響

從表4可知，在各時期內(nèi)，均以ON組的平均日增重最高，其次為N組、O組、C組，與抗體陽性率結(jié)果一致；在初免后2周，ON組日增重顯著高于其他各組(<0.05)，而其他各時期內(nèi)各組間日增重差異均不顯著(>0.05)；在整個試驗周期(0～10周)， 與C組相比，O組、N組、ON組犢牛日增重分別提高了5.26%、10.53%、15.79%。由表5可知，6、10周時，ON組的胸圍顯著高于C組(<0.05)；10周時，ON組的腿臀圍顯著高于C組、N組(<0.05)，其他體尺指標均為無顯著差異(>0.05)。

2.4 不同免疫方式對犢牛血清中生長相關激素的影響

從表6可知，不同階段，各試驗組的GH、IGF-1、T的濃度均高于對照組，且ON>N>O組，與增重趨勢一致；其中，2周時，3個試驗組血清中的IGF-1的濃度顯著高于C組(<0.05)；6周時，ON組T和T的濃度均顯著高于O組、C組(<0.05)，各組之間GH、IGF-1的濃度差異不顯著(>0.05)；10周時，ON組T的濃度顯著高于對照組(<0.05)，各組之間GH、IGF-1、T的濃度差異不顯著(>0.05)。

表1 不同免疫方式各組犢牛血清中SS抗體水平

表2 不同免疫方式各組犢牛血清中CST抗體水平

表3 不同免疫方式各組犢牛血清中細胞因子水平

表4 不同免疫方式各組犢牛的日增重

表5 不同免疫方式組間犢牛的體尺

表6 不同免疫方式組間犢牛血清中生長相關激素水平

2.5 不同免疫方式對犢牛血清生化指標的影響

在初免后2及6周，3個免疫組血清的總蛋白(TP)、葡萄糖(Glu)、游離脂肪酸(NEFA)的含量略高于對照組，尿素氮(BUN)的含量低于對照組(表7)， 但各項指標在各組之間差異均不顯著(>0.05)。

表7 不同免疫方式組間犢牛血清生化指標

3 討 論

黏膜是機體最大的免疫器官，分布在呼吸道、消化道、泌尿生殖道以及某些外分泌腺(唾液腺、胰腺、淚管等)。通過黏膜表面(如口腔、鼻、直腸或陰道等)接種疫苗不僅可以激發(fā)保護性黏膜免疫反應，還可誘導全身抗原特異性體液免疫和細胞免疫。以減毒沙門菌為載體的DNA疫苗可以通過口腔或鼻腔進行免疫接種，有效地在動物體內(nèi)表達外源抗原。本研究采用口服、噴鼻、口服+噴鼻3種免疫方式免疫2～6月齡的奶水牛犢牛，均能誘導犢牛產(chǎn)生SS和CST抗體，且加強免疫后ON組的SS和CST抗體水平有所提高，在初免后10周，只有ON組檢測到了陽性，說明口服+噴鼻的免疫方式可以誘導犢牛產(chǎn)生更持久的免疫應答。O組、N組均檢測不到抗體，提示在6～10周，疫苗的免疫效果已逐漸消失，具體的消失時間還需要進一步探究。整個試驗期間，從產(chǎn)生抗體的持久性和陽性率綜合來看，口服+噴鼻的免疫方式要優(yōu)于噴鼻免疫，噴鼻免疫優(yōu)于口服免疫。這可能是由于口服免疫產(chǎn)生的免疫應答持續(xù)時間較短。一方面，鼻腔提供了一個廣泛的、高度血管化的和相對容易滲透的表面，提高了鼻黏膜攝取DNA疫苗的效率，而且鼻腔黏膜不僅可以激發(fā)上呼吸道可產(chǎn)生較強的免疫應答，還可以誘導機體下呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道產(chǎn)生明顯的免疫應答；另一方面，口腔免疫也可以通過口腔黏膜、消化道黏膜以及胃腸道黏膜遞呈抗原，誘導動物機體產(chǎn)生有效的免疫應答。因此多種方式聯(lián)合免疫要優(yōu)于單一的免疫方式。

與其他促生長的DNA疫苗相比，祖卓鑫首次采用2A肽雙順反子原件，引入平衡致死系統(tǒng)構(gòu)建了非抗性篩選SS和CST雙表達DNA疫苗，有效提高了下游基因的表達量及其免疫效力。該雙表達DNA疫苗可以誘導機體產(chǎn)生SS抗體和CST抗體，中和內(nèi)源性生長抑素，從而提高生長激素的分泌，并最終提高生長速率。SS基因疫苗可以改善小鼠、羊、肉牛、仔豬、雞等動物的生產(chǎn)性能。在本研究中，不同階段犢牛的平均日增重由高到低的順序為口服+噴鼻組>噴鼻組>口服組>對照組，進一步證明了多種途徑聯(lián)合免疫的效果要優(yōu)于單一途徑免疫；但各組平均日增重水平整體較低，這可能與牛場的飼養(yǎng)管理條件有關。另外，體尺指標也可以反映犢牛的生長發(fā)育狀況，與犢牛的生產(chǎn)性能、繁殖性能有著密切聯(lián)系。本研究首次探究了該疫苗對犢牛體尺的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生長抑素和皮質(zhì)抑素雙表達DNA疫苗通過口服+噴鼻的免疫方式對水牛犢牛腿臀圍和胸圍的影響最顯著。

畜禽的生長發(fā)育受多種內(nèi)源性激素共同調(diào)節(jié)，主要包括GH、IGF-1、T、T等。GH能促進機體組織的生長，下丘腦分泌的GH可直接作用于動物靶器官，分泌IGF-1；IGF-1可以促進機體細胞增殖，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成，促進動物組織器官發(fā)育和骨骼生長。甲狀腺激素(包括T和T)是影響動物生長發(fā)育和新陳代謝的主要激素，對幼齡動物正常生長和骨骼發(fā)育的影響尤為突出，且T和T是GH發(fā)揮促生長作用的基礎。大量研究表明，生長抑素DNA疫苗可以提高機體內(nèi)GH、IGF-1、T、T的濃度，從而促進動物的生長。在本試驗中，不同免疫時期犢牛體內(nèi)GH、IGF-1、T、T的水平：口服+噴鼻組>噴鼻組>口服組>對照組，與增重趨勢一致，進一步說明了生長抑素和皮質(zhì)抑素DNA疫苗可以通過提高機體內(nèi)與生長相關的激素的水平，從而達到促生長效果，表明該疫苗通過口服+噴鼻聯(lián)合免疫的方式產(chǎn)生的促生長效果更佳。

DNA疫苗的作用機理就是其通過不同的途徑進入機體內(nèi)，在動物體內(nèi)產(chǎn)生微量的抗原蛋白，從而引發(fā)全面的體液免疫和細胞免疫應答反應。Th1細胞主要參與細胞免疫應答，而Th2細胞在體液免疫應答中起核心作用，因此，Th1細胞因子(IFN-γ、IL-2等)和Th2細胞因子(IL-4、IL-10等)的檢測可以在一定程度上反映細胞和體液免疫反應。與韓麗的研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果表明，不同免疫方式組犢牛血清中IFN-γ和IL-4的含量均高于對照組，說明3種免疫方式接種此DNA疫苗都能有效地激發(fā)機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫應答。其中，口服+噴鼻組INF-γ的含量顯著提高，說明口服+噴鼻這種免疫方式接種此雙表達DNA疫苗，可以顯著提高機體的細胞免疫反應；因此，雙表達DNA疫苗的口服+噴鼻的免疫效果要優(yōu)于口服或噴鼻免疫效果。關于生長抑素DNA疫苗對動物血清生化指標的影響，研究結(jié)果也不盡相同。本研究發(fā)現(xiàn)無論以哪種方式免疫接種雙表達DNA疫苗，對犢牛血清總蛋白、葡萄糖、游離脂肪酸以及尿素氮的含量均無明顯影響?？赡苁怯捎谑茉噭游?、免疫途徑、免疫劑量不同以及飼養(yǎng)管理等多種因素造成的，而且免疫并非直接影響代謝，是通過影響GH、IGF-1等內(nèi)分泌激素的分泌，從而影響機體的代謝，具體機制有待于進一步研究證實。

4 結(jié) 論

3種不同免疫方式均可以使奶水牛犢牛產(chǎn)生較好的免疫效果，但是口服+噴鼻免疫產(chǎn)生的抗體水平持續(xù)時間更長，陽性率更高，且增重效果更好。結(jié)果表明，在給犢牛接種促生長DNA疫苗時，口服+噴鼻聯(lián)合免疫效果要優(yōu)于噴鼻免疫，噴鼻免疫優(yōu)于口服免疫。