王雪梅，翟 哲，陳巧玲，吳艷茹，吳昊天，黃惠嫻，劉志勇，李崇瑞，滿初日嘎，王鳳陽，杜 麗，陳 思

(海南大學(xué)動物科技學(xué)院 海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ?？谑袆游锘蚬こ讨攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?70228)

海南黑山羊又稱東山羊，是海南省目前唯一的地方優(yōu)良山羊品種，在全省均有分布，主要集中于萬寧、瓊中、儋州、澄邁等市縣。在長期熱帶環(huán)境的自然選擇下，海南黑山羊形成耐高溫高濕、性成熟早、耐粗飼、抗病力強(qiáng)、無膻味等特點(diǎn)。研究表明，海南黑山羊的抗病力除了受飼養(yǎng)管理和營養(yǎng)水平等因素影響外，還受到基因表達(dá)調(diào)控的影響。因此，通過基因?qū)用嫜芯亢Ｄ虾谏窖虻目共C(jī)制，對于山羊疾病的預(yù)防和控制具有重要意義。甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannose binding lectin，MBL)作為一種重要的抗感染免疫分子，是目前發(fā)現(xiàn)的少數(shù)能活化補(bǔ)體系統(tǒng)的膠凝素。補(bǔ)體通過凝集素途徑在病原體或細(xì)胞表面活化，發(fā)揮消滅病原體和調(diào)理吞噬等免疫防御功能。研究表明，動物體內(nèi)的1和2基因分別編碼MBL-A和MBL-C蛋白。其中，2基因編碼的甘露聚糖結(jié)合凝集素C(mannose binding lectin C，MBL-C)是存在于動物體內(nèi)、由肝組織合成并分泌到血液中的一種血清型膠凝集素，屬于C型(Ca依賴型)凝集素超家族的成員。MBL-C作為一種急性期蛋白，以激活補(bǔ)體效應(yīng)的方式參與動物體內(nèi)的體液免疫途徑，在宿主抵抗病原體感染過程中發(fā)揮重要的天然抗感染免疫功能。2基因能夠通過補(bǔ)體依賴和非依賴的機(jī)制中和登革熱病毒，進(jìn)而抑制登革熱病毒的感染。此外，多數(shù)研究表明，2基因的多態(tài)性與感染性疾病的易感性有關(guān)。Fraser等的研究發(fā)現(xiàn)，牛的兩種膠原凝集素基因(1和2)的突變與乳腺炎有關(guān)。牦牛2基因3′-UTR區(qū)的A997C/T1295C位點(diǎn)多態(tài)性與牦牛血清巴氏桿菌抗體水平相關(guān)，提示可能參與牦牛巴氏桿菌體液免疫反應(yīng)。水牛基因的多態(tài)性與水牛抵御布氏桿菌感染的能力顯著相關(guān)，其原因可能是基因的變異導(dǎo)致水牛體內(nèi)MBL表達(dá)的不足，影響了水牛正常的免疫功能。

目前，2基因的研究主要集中在其多態(tài)性與疾病的關(guān)聯(lián)分析，對于該基因在山羊上的表達(dá)調(diào)控研究相對較少。因此，本研究選取海南黑山羊2基因啟動子序列1 009 bp，構(gòu)建了一系列啟動子截短的pGL3-Basic重組質(zhì)粒。在線網(wǎng)站預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并利用點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失的pGL3-Basic重組質(zhì)粒。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測所構(gòu)建的重組質(zhì)粒的啟動子轉(zhuǎn)錄活性變化情況，進(jìn)一步確定山羊2基因的最小核心啟動子區(qū)域以及對2基因起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。期望有助于揭示海南黑山羊2基因表達(dá)分子調(diào)控機(jī)制，為探尋其免疫基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

本研究采集2頭海南黑山羊(海南初心牧業(yè)有限公司)的肝組織，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)材料

pGL3-Basic質(zhì)粒、pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒于本實(shí)驗(yàn)室保存，雙熒光素酶基因內(nèi)參pRL-TK載體、Dual-LuciferaseReporter Assay System雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；脂質(zhì)體Lipofectamine2000 Reagent、限制性內(nèi)切酶1、1和1、T4 DNA連接酶購自美國Invitrogen公司；胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco公司；PBS 緩沖液、DMEM培養(yǎng)基購自Boster美國公司；2XPCR MasterMix、D2000 DNA maker、1 kb DNA ladder、DEPC水、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；氨芐青霉素(AMP)購自索萊寶科技有限公司；293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；NanoPhotometer購自德國Implen公司；DNA 膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小提試劑盒、引物合成購自生工生物工程(上海)股份有限公司；測序由北京六合華大基因公司完成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 進(jìn)化樹分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中檢索并下載20個(gè)物種的2基因序列。用ClustalW(codon)方法對20條基因CDS區(qū)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。利用MEGA X軟件采用極大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。模擬1 000次重復(fù)抽樣中獲得Bootstrap值。

1.3.2 山羊2基因啟動子區(qū)的生物信息學(xué)分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫搜索山羊2(NCBI登錄號：NC_030833.1)基因組DNA信息，并結(jié)合NCBI公布的2基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的位置，選取山羊2基因5′UTR上游啟動子區(qū)1 009 bp (Chr26：45045136-45046144) 作為研究的序列。使用Promoter 2.0在線軟件對啟動子的序列特征進(jìn)行分析。采用在線軟件JASPAR、AnimalTFDB3.0和Alibaba2對啟動子區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測。采用RepeatMasker程序來預(yù)測序列的重復(fù)元件。同時(shí)使用MethPrimer軟件對啟動子區(qū)進(jìn)行CpG島預(yù)測，具體的生物信息學(xué)軟件信息見表1。

表1 生物信息學(xué)分析MBL2啟動子區(qū)所用的軟件

1.3.3 山羊2基因啟動子截短片段的PCR擴(kuò)增 提取山羊肝組織的基因組DNA，濃度測定及瓊脂糖凝膠電泳合格后置于-20 ℃?zhèn)溆?。采用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增山羊2基因啟動子的7條引物(上游：F1、F2、F3、F4、F5、F6，下游：R)上游引物5′端加1酶切位點(diǎn)，下游引物5′端加1酶切位點(diǎn)，引物具體信息見表2。以山羊肝組織基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)體系為50 μL：基因組DNA模板為200 ng，上下游引物各2 μL，25 μL的2XPPCR MasterMix，ddHO水補(bǔ)齊體系。PCR的擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 kb/2 min，32個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸 5 min。將反應(yīng)完成的PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測后利用膠回收試劑盒回收目的條帶。

表2 擴(kuò)增山羊MBL2基因啟動子區(qū)的引物信息

1.3.4 山羊2基因啟動子報(bào)告重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 使用1酶和1酶在37 ℃分別酶切目的片段和pGL3-Basic空載體2 h，之后用DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化酶切反應(yīng)物。將得到的純化產(chǎn)物用T4連接酶16 ℃連接過夜，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的玻璃平板中培養(yǎng)8～10 h，經(jīng)菌落PCR鑒定出陽性單克隆菌落，進(jìn)一步取陽性單克隆菌落在LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)12 h，提取重組質(zhì)粒后經(jīng)限制性內(nèi)切酶1和1酶切和測序鑒定。將測序正確的6個(gè)2基因啟動子截短重組質(zhì)粒分別命名為pGL3-F1(-945/+64)、pGL3-F2(-741/+64)、pGL3-F3(-629/+64)、pGL3-F4(-483/+64)、pGL3-F5(-304/+64)、pGL3-F6(-45/+64)。將測序正確的陽性單克隆過夜擴(kuò)大培養(yǎng)，之后用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，并經(jīng)NanoPhotometer檢測濃度和純度。

1.3.5 細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測 將10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中處于指數(shù)生長期的293T細(xì)胞，按每孔2.4×10個(gè)細(xì)胞的密度接種至96孔板，置于37 ℃，5%CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞的融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，根據(jù)Lipofectamine2000 Reagent 轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。為研究山羊2基因啟動子不同區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性，按照Lipofectamine2000∶截短重組質(zhì)?！脙?nèi)參質(zhì)粒pRL-TK為0.5 μL∶200 ng∶4 ng的比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，pGL3-Basic質(zhì)粒為陰性對照，pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒為陽性對照，按照試劑盒的說明書進(jìn)行試驗(yàn)操作，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染6～8 h將無血清的培養(yǎng)基換成含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至48 h后裂解細(xì)胞，利用Promega公司的Dual-LuciferaseReporter Assay System雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒和奧地利Tecan公司的Spark多功能微孔板檢測儀檢測螢火蟲熒光素酶(F值)和海腎熒光素酶(R值)。通過計(jì)算螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的比值(Luc)來確定山羊2基因的核心啟動子區(qū)域。

1.3.6 山羊2基因核心啟動子區(qū)載體的構(gòu)建 利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增山羊2基因核心啟動子區(qū)(-304/-45 bp)的上、下游引物(F7、R1，表1)，并在上、下游引物的5′端分別引入1酶和1酶的酶切位點(diǎn)。以重組質(zhì)粒pGL3-F5為模板，核心啟動子區(qū)載體的構(gòu)建過程參照“1.3.3”和“1.3.4”的操作步驟。將測序正確的陽性單克隆命名為pGL3-F7，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)陽性單克隆并使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。

1.3.7 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測及定點(diǎn)突變載體的構(gòu)建 通過在線軟件再次對山羊2基因的核心啟動區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，取它們的交集結(jié)果并篩選出評分較高的3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。參照天根生化科技有限公司的點(diǎn)突變試劑盒說明書對預(yù)測的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)缺失引物，引物的具體信息見表3。以構(gòu)建成功的pGL3-F7重組質(zhì)粒為模板，PCR反應(yīng)體系同“1.3.3”，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，18個(gè)循環(huán)，68 ℃ 10 min。將1 μL的1酶及2 μL的10×Green Buffer加到PCR產(chǎn)物中，37 ℃孵育2～3 h。取出10 μL的酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測是否出現(xiàn)目的產(chǎn)物，采用DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，菌液PCR及酶切鑒定陽性單克隆，經(jīng)測序正確的陽性單克隆過夜擴(kuò)大培養(yǎng)，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。構(gòu)建成功的缺失載體命名為pGL3-轉(zhuǎn)錄因子。

表3 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的突變引物

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用GraphPad Prism8軟件分析數(shù)據(jù)，one-way ANOVA方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 MBL2基因在不同物種中的進(jìn)化樹分析

為了解2基因在不同物種中潛在的進(jìn)化關(guān)系，采用MEGA X軟件對20個(gè)物種的2基因編碼序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，山羊2基因編碼序列與反芻動物(綿羊、牛)具有較近的遺傳距離，與藍(lán)鯨的遺傳距離較遠(yuǎn)。

2.2 山羊MBL2基因啟動子序列的生物信息學(xué)分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫下載山羊2基因啟動子序列(-945/+64 bp)，利用Promoter 2.0軟件預(yù)測山羊2基因-446 bp為啟動子位置，分值為1.076。用RepeatMasker程序來預(yù)測序列的重復(fù)元件，發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)重復(fù)元件LINE1(-945/-618 bp)、LINE2 (-477/-369 bp)。采用Methprimer軟件對預(yù)測的啟動子序列進(jìn)行CpG島分析，未發(fā)現(xiàn)CpG島存在(圖2)。并利用在線軟件對啟動子區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測，預(yù)測的結(jié)果見圖3。

圖1 MBL2基因的進(jìn)化分析Fig.1 Evolutional analysis of MBL2 gene

圖2 山羊MBL2基因啟動子甲基化位點(diǎn)分析Fig.2 Methylation site analysis of goat MBL2 gene promoter

潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在序列中用方框標(biāo)明Putative transcription factor binding sites are boxed in the sequence圖3 山羊MBL2基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果圖Fig.3 Predicted results of transcription factor binding sites in goat MBL2 gene promoter region

2.3 山羊MBL2基因啟動子區(qū)截短載體的構(gòu)建

利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)的引物(F1/R、F2/R、F3/R、F4/R、F5/R、F6/R)對啟動子序列進(jìn)行逐段PCR截短，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠檢測得到6個(gè)不同的逐段截短的單一條帶啟動子片段(圖4A)，與預(yù)期的結(jié)果一致。構(gòu)建的重組載體經(jīng)1和1雙酶切鑒定，結(jié)果(圖4B)發(fā)現(xiàn)各個(gè)重組質(zhì)粒酶切后均出現(xiàn)了兩條帶，一條為目的片段1 009、803、693、547、368、109 bp，另一條為4 818 bp的pGL3-Basic片段。將經(jīng)酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒送北京六合華大基因公司測序，測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件比對發(fā)現(xiàn)與預(yù)期結(jié)果一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Marker.D2000 DNA marker；A. F1～F6為系列截短的片段；B. F1～F6為重組質(zhì)粒pGL3-F1至pGL3-F6經(jīng)Kpn1和Sac1雙酶切的結(jié)果Marker. D2000 DNA marker; A. F1-F6 is a series of truncated segments; B. F1-F6 was the result of recombined plasmid pGL3-F1 to pGL3-F6 digested with Kpn1 and Sac1 double enzymes圖4 系列截短的MBL2基因啟動子序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和重組質(zhì)粒雙酶切的電泳圖Fig.4 The electrophoresis image of PCR amplification products of series truncated promoter sequence of MBL2 gene and double digestion of recombined plasmid

2.4 山羊MBL2基因最小活性區(qū)域的確定

使用Lipofectamine2000將構(gòu)建的6個(gè)雙熒光素報(bào)告載體pGL3-F1～pGL3-F6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測啟動子系列截短的雙熒光素酶載體的活性(圖5)。結(jié)果所示，隨著啟動子片段的逐段截短，啟動子的熒光活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，表明在啟動子區(qū)(-945/-629 bp)中存在著抑制啟動子熒光活性的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)截短到山羊2基因啟動子區(qū)-304/-45 bp之間時(shí)，熒光活性的比值變化最大，啟動子的活性降到較低。這一結(jié)果說明山羊2基因5′UTR上游啟動子區(qū)1 009 bp(-945/+64 bp)具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能，且在啟動子區(qū)(-304/-45 bp)為山羊2基因近端的核心啟動子區(qū)。

*. P<0.05,**. P<0.01，下同*. P<0.05,**. P<0.01, the same as follow圖5 MBL2啟動子截短體pGL3-F1到pGL3-F6的熒光活性檢測Fig.5 The MBL2 promoter activities of pGL3-F1 to pGL3-F6

2.5 山羊MBL2基因的核心啟動子區(qū)的載體構(gòu)建

以構(gòu)建成功的pGL3-F5(-304/+64 bp)重組載體為模板，PCR擴(kuò)增出2基因核心啟動區(qū)的片段(圖6A)，構(gòu)建重組載體。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后,采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳(圖6B)鑒定出兩條帶，分別為4 818 bp 的pGL3-Basic質(zhì)粒以及259 bp的目的片段。測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN比對與預(yù)期片段一致，說明重組載體pGL3-F7構(gòu)建成功。

Marker.D2000 DNA marker；A. 1～2:MBL2基因核心啟動子區(qū)域的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；B. MBL2基因核心啟動子區(qū)域的重組質(zhì)粒經(jīng)Sac1和Kpn1雙酶切圖Marker. D2000 DNA marker; A. Electrophoresis image of PCR amplification products in the core promoter region of MBL2 gene; B. The recombinant plasmid in the core promoter region of MBL2 gene was digested by Sac1 and Kpn1 enzymes圖6 MBL2基因核心啟動子區(qū)域的PCR擴(kuò)增和重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.6 Electrophoresis image of PCR amplification and double digestion of recombinant plasmid in the MBL2 gene core promoter region

2.6 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的缺失載體的構(gòu)建及熒光活性

使用在線軟件JASPAR和AnimalTFDB3.0對山羊2基因核心啟動子區(qū)進(jìn)行關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2核心啟動子區(qū)存在RELA、MZF1、NF-κB2等3個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，與前期預(yù)測的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)果一致(圖7)。以構(gòu)建成功的pGL3-F7為模板，PCR擴(kuò)增出3個(gè)不同的啟動子缺失載體pGL3-RELA、pGL3-NF-κB2、pGL3-MZF1(圖8A)，構(gòu)建的缺失載體經(jīng)1和1雙酶切(圖8B)和測序鑒定，測序結(jié)果與預(yù)期片段一致。將3個(gè)構(gòu)建成功的缺失載體轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，48 h后檢測螢火蟲熒光值(F)和海腎熒光值(R)，計(jì)算F/R相對比值。結(jié)果顯示(圖9)，缺失MZF1的結(jié)合位點(diǎn)后，其熒光活性相對于對照組(pGL3-F7載體)上升，說明了轉(zhuǎn)錄因子MZF1可能對山羊2基因的轉(zhuǎn)錄起到負(fù)調(diào)控的作用或者是不起作用。缺失RELA和NF-κB2結(jié)合位點(diǎn)后，pGL3-RELA和pGL3-NF-κB2的熒光活性相對于對照組有極顯著下降(<0.01)，說明了轉(zhuǎn)錄因子RELA和NF-κB2可能對山羊2基因的轉(zhuǎn)錄活性有正調(diào)控作用。進(jìn)一步比較pGL3-RELA和pGL3-NF-κB2之間的熒光活性，發(fā)現(xiàn)pGL3-RELA較pGL3-NF-κB2的熒光活性有著顯著的下降(<0.05)。

潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在序列中用方框標(biāo)明Putative transcription factor binding sites are boxed in the sequence圖7 山羊MBL2基因核心啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測Fig.7 Prediction of transcription factor binding sites in the core promoter region of goat MBL2 gene

A. Marker:1 kb DNA Ladder；1～4: MBL2核心啟動子區(qū)域、轉(zhuǎn)錄因子(RELA、NF-κB2、MZF1)結(jié)合位點(diǎn)缺失的PCR擴(kuò)增圖；B. Marker:D2000 DNA marker；1～5：MBL2核心啟動子區(qū)域重組質(zhì)粒pGL3-F7、結(jié)合位點(diǎn)缺失載體pGL3-MZF1、pGL3-NF-κB2、pGL3-RELA和pGL3-Basic空載體的雙酶切圖A. Marker: 1 kb DNA Ladder; 1-4: PCR amplification diagram of MBL2 core promoter region, transcription factor(RELA,NF-κB2,MZF1) binding site deletion. B. Marker:D2000 DNA marker; MBL2 core promoter region recombinant plasmid pGL3-F7, binding site deletion vector pGL3-MZF1,pGL3-NF-κB2,pGL3-RELA and pGL3-Basic empty vector dual enzyme digestion diagram圖8 MBL2核心啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失載體的PCR擴(kuò)增和雙酶切電泳圖Fig.8 PCR amplification and double digestion electrophoresis images of vectors with deletion of transcription factor binding sites in the MBL2 core promoter region

潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的缺失在序列中用黑色橫線標(biāo)明The deletion of potential transcription factor binding sites are indicated by black horizontal line in the sequence圖9 定點(diǎn)缺失關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的熒光活性測定Fig.9 Fluorescence activity determination of site-deletions of key transcription factors

3 討 論

C型(Ca依賴型)凝集素基因超家族成員在脊椎動物的天然免疫中發(fā)揮著調(diào)理吞噬和抵御外界病原體入侵的作用。2基因作為C型鈣依賴凝集素基因超家族成員之一，在宿主抵御病原體感染的第一道防線中扮演著重要角色。2基因編碼的MBL-C蛋白作為人和動物先天性免疫凝集素途徑中的重要組分，能夠在個(gè)體發(fā)育的早期發(fā)揮直接抵御病原體感染的作用。MBL-C普遍存在于人和動物的血液中，2基因中的短核苷酸變異(SNVs)與多種感染性疾病的易感性相關(guān)。研究表明，人類2基因1號外顯子的突變與麻風(fēng)桿菌的易感性有關(guān)。趙中利對奶牛2基因研究發(fā)現(xiàn)，2基因的多態(tài)性與金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎存在著顯著相關(guān)，其可能的機(jī)理是奶牛2基因突變導(dǎo)致血清中MBL-C水平下降，影響奶牛的免疫功能。2基因作為先天性免疫應(yīng)答機(jī)制的重要組分，是調(diào)控畜禽對病原體抗性或易感的關(guān)鍵基因。因此，2基因的表達(dá)調(diào)控研究對探索山羊在抵抗細(xì)菌性感染的機(jī)理中有著重要的理論和實(shí)踐意義。

本研究利用啟動子定位軟件對2基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 009 bp(-945/+64)的序列上存在MZF1、FOXC2、RELA等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，提示該序列可能屬于啟動子區(qū)域。CpG島作為位于真核生物轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近富含GC的序列，具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄效率的作用。在本研究中，利用生物信息學(xué)軟件對山羊2基因啟動子序列1 009 bp進(jìn)行分析，預(yù)測結(jié)果顯示，該序列GC含量不高(42.7%)，無真核生物啟動子經(jīng)典CpG島。對重復(fù)元件預(yù)測，分析表明該序列存在兩個(gè)重復(fù)元件LINE1(-945/-618 bp)和LINE2 (-477/-369 bp)。通常認(rèn)為重復(fù)元件是由于反轉(zhuǎn)錄元件的插入形成的序列，是生物進(jìn)化過程中的一種保護(hù)機(jī)制。重復(fù)元件能保護(hù)基因的外顯子、啟動子部位免受突變而引起的功能喪失，但其具體的作用機(jī)制還需深入研究。

通過對啟動子序列5′端側(cè)翼區(qū)進(jìn)行逐段缺失，聯(lián)合雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測山羊2基因的核心啟動子區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其啟動子最小活性區(qū)域介于-304至-45 bp，與奶牛2基因啟動子的最小活性區(qū)域介于-85至+52 bp略有差別。進(jìn)一步運(yùn)用點(diǎn)突變技術(shù)和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)對該區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)缺失RELA或NF-κB2的結(jié)合位點(diǎn)，山羊2基因的轉(zhuǎn)錄活性較對照組極顯著下降，且pGL3-RELA較pGL3-NF-κB2的熒光活性顯著下降。該結(jié)果表明，雖然RELA和NF-κB2的結(jié)合位點(diǎn)僅有3個(gè)堿基的差異，但它們在調(diào)控山羊2基因的轉(zhuǎn)錄能力上卻存在顯著差異。究其原因可能是RELA與山羊2基因啟動子序列結(jié)合比NF-κB2更穩(wěn)定。研究表明，NF-κB2能與人類免疫缺陷病毒(HIV)的啟動子序列穩(wěn)定結(jié)合可能是由RELA對該序列有比較低的親和力決定。研究報(bào)道，NF-κB2對結(jié)合位點(diǎn)的親和力比NF-κB1弱得多，但當(dāng)RELA協(xié)同作用時(shí)，NF-κB2較NF-κB1能更有效地與基因的啟動子序列結(jié)合，進(jìn)而激活基因的定向轉(zhuǎn)錄。綜上所述，盡管NF-κB各亞基在DNA結(jié)合上存在相似性，但它們在激活基因轉(zhuǎn)錄的能力上卻存在顯著差異。

NF-κB是一類多效性的轉(zhuǎn)錄因子，能識別并結(jié)合多種靶基因啟動子部位上特定的序列，從而啟動靶基因的表達(dá)。RELA和NF-κB2均屬于NF-κB家族重要的成員，都具有一個(gè)N端Rel同源結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)其與DNA結(jié)合以及二聚體化。RELA無前體，其C端有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域，具有直接作用于轉(zhuǎn)錄元件促進(jìn)激活基因轉(zhuǎn)錄的功能。NF-κB2含有前體p100，缺乏轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域，沒有獨(dú)立激活基因轉(zhuǎn)錄的功能，其同源二聚體可以抑制基因的轉(zhuǎn)錄。因此，NF-κB亞基之間通常是以二聚體的形式存在。研究表明，RELA與NF-κB2組成的異源二聚體存在協(xié)同作用，能共同激活基因的轉(zhuǎn)錄，但是沒有說明這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是結(jié)合在基因的同一位點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，RELA和NF-κB2有可能以結(jié)合在山羊2基因啟動子部位的同一個(gè)位點(diǎn)的方式，從而發(fā)揮了協(xié)同促進(jìn)山羊2基因轉(zhuǎn)錄的作用。

RELA作為一個(gè)真核生物轉(zhuǎn)錄因子，能參與信號分子和調(diào)節(jié)許多炎癥基因的表達(dá)。RELA是REL家族中研究最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子成員之一，該轉(zhuǎn)錄因子廣泛地調(diào)節(jié)真核生物基因的表達(dá)并參與到多種生物過程，如炎癥、腫瘤形成、病毒復(fù)制、細(xì)胞凋亡和增殖等過程，并與許多炎性相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制有密切的聯(lián)系。研究表明，向肝組織缺失基因的小鼠和正常小鼠的腹腔中注射肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌，缺失RELA小鼠較正常小鼠的免疫力降低，對病原體的易感性增強(qiáng)，容易使其誘發(fā)肺炎、敗血癥或激活NKT細(xì)胞，說明RELA對小鼠肝感染致病菌期間產(chǎn)生的對肝具有保護(hù)作用的急性期反應(yīng)至關(guān)重要。在綿羊感染肺炎支原體的過程中，RELA的轉(zhuǎn)錄水平和磷酸化水平顯著提高，使綿羊體內(nèi)的肺炎支原體數(shù)量增加，說明RELA在綿羊肺炎支原體致病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道合胞病毒通過捕獲RELA到細(xì)胞質(zhì)包涵體中，阻斷被感染細(xì)胞內(nèi)先天免疫信號的激活，使病毒在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，從而引起牛的呼吸道急性疾病。

NF-κB2是參與NF-κB非經(jīng)典途徑的主要轉(zhuǎn)錄因子，是多種靶基因的關(guān)鍵調(diào)控因子，在炎癥組織中表達(dá)量很高。研究表明NF-κB2通路可影響T細(xì)胞、B細(xì)胞的分化及NK細(xì)胞的功能，該基因的遺傳突變與人的免疫缺陷病相關(guān)。通過RNAi技術(shù)沉默NF-κB2的表達(dá)，使人類巨細(xì)胞病毒蛋白US31的表達(dá)量降低，并抑制了NF-κB2在單核巨噬細(xì)胞中的激活，這在一定程度上有助于全身性紅斑狼瘡病的治療。

本研究中缺失了轉(zhuǎn)錄因子RELA、NF-κB2的結(jié)合位點(diǎn)，山羊2基因的啟動子轉(zhuǎn)錄活性顯著下降，說明RELA和NF-κB2可能在對調(diào)控山羊2基因的轉(zhuǎn)錄上發(fā)揮了正調(diào)控的作用。2基因作為C型鈣依賴凝集素基因超家族成員之一，其編碼的MBL-C蛋白通過凝集素途徑激活補(bǔ)體，發(fā)揮調(diào)理吞噬、清除病原體的作用，其免疫防御功能的實(shí)現(xiàn)受到轉(zhuǎn)錄因子RELA、NF-κB2的調(diào)控。因此推測，轉(zhuǎn)錄因子RELA、NF-κB2可能通過調(diào)控海南黑山羊2基因在血漿中的表達(dá)水平，增強(qiáng)海南黑山羊?qū)Σ≡w的抵抗力。

4 結(jié) 論

本研究通過體外試驗(yàn)確定了山羊2基因核心啟動子位于-304至-45 bp區(qū)域。結(jié)合在線軟件預(yù)測、借助定點(diǎn)突變技術(shù)及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)初步鑒定NF-κB家族的成員RELA和NF-κB2對山羊2基因的轉(zhuǎn)錄活性可能有正調(diào)控作用，且RELA和NF-κB2有可能發(fā)揮了促進(jìn)山羊2基因轉(zhuǎn)錄的協(xié)同作用。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究2基因在調(diào)控山羊抗病功能中提供了理論依據(jù)。