于永峰，權 衡，董文豪，鄒榮華，吳曉妮，宮曉煒，陳啟偉

(中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046)

近年來，由于抗生素、飼料添加劑、消毒劑在畜牧生產中的過度使用，很多養(yǎng)殖場已成為耐藥菌和耐藥基因的重要貯庫。這不但加劇了動物源性耐藥菌的產生與傳播，而且嚴重危害了我國畜牧業(yè)的健康快速發(fā)展。出于對人病獸防，關口前移政策的理解，遏制食品性和食源性動物源耐藥菌株的傳播路徑已十分迫切。大腸桿菌(，)、腸炎沙門菌(Enteritidis，. Enteritidis)、肺炎克雷伯菌(，)、銅綠假單胞菌(，)、鮑曼不動桿菌(，)、鴨疫里默氏桿菌(，)等都是臨床上已知重要的革蘭陰性致病菌，廣泛存在于養(yǎng)殖場、屠宰場以及生肉商場等地。這些細菌經常能夠單獨或者混合感染牛、豬、雞、鴨等，從而導致動物出現(xiàn)嚴重的腹瀉、流產、呼吸困難及神經癥狀。據(jù)報道，在我國的廣西、河南和蘭州等地區(qū)，已連續(xù)多年從畜禽體內分離到這些菌株的耐藥株，甚至是多重耐藥菌株(multidrug-resistant，MDR)或泛耐藥菌株(the emergence of pan-drug-resistant，PDR)。此外，在作者的前期研究中還發(fā)現(xiàn)可能是替加環(huán)素耐藥基因() 的天然存儲庫。這表明，攜帶抗生素耐藥基因的“超級細菌”已經嚴重危害了畜牧業(yè)的發(fā)展，同時給臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)，導致出現(xiàn)無藥可用的窘境和跨物種傳播的風險，必須引起人們的高度重視。

目前已知的革蘭陰性菌的抗生素耐藥性可以通過多種機制產生(圖1)。這些機制大致可分為兩類：內在的抗性和獲得性的抗性。內在的抗性機制包括：改變細菌外膜通透性、脂多糖的修飾和自身外排泵的活化等；而獲得性抗性機制則涉及抗性基因的水平轉移、質?；蜣D座子介導的修飾酶基因的獲取等。這些耐藥機制廣泛存在于臨床常見的致病菌中，其中，大部分機制都直接或者間接受雙組分調控系統(tǒng)(two-component regulatory systems，TCS)的調節(jié)。TCS是細菌維持胞內平衡的重要機制之一，幾乎存在于所有細菌內，使細菌能夠感知環(huán)境的變化并作出相應的反應。雖然大部分TCS的作用是發(fā)起對簡單刺激的響應，例如營養(yǎng)限制、氧氣濃度改變、磷酸鹽限制、滲透壓改變等，但依然存在很多TCS能夠直接或間接降低細菌對抗生素的敏感性。那么TCS是如何感知抗生素并調控相應基因表達的？這些基因又是怎樣介導細菌耐藥的？就此，本文從TCS的基本結構和調控機理、TCS在革蘭陰性菌產生耐藥過程中的調控作用進行綜述，這對于闡明革蘭陰性菌耐藥機制及開發(fā)新的防治藥物具有重要意義。

1 經典TCS的基本結構和調控機理

經典的TCS由一對相互作用的蛋白質組成，這包括一個存在于膜上的感受器組氨酸激酶(histidine protein kinase，HK)和一個存在于細胞質的反應調節(jié)蛋白(response regulator protein，RR)。當然，除了典型的TCS，很多細菌內還存在各種各樣非典型的TCS，而這些非典型的TCS中HK和RR并非是唯一的，例如弗朗西斯菌屬中的QseC和QseB/PmrA，其不同于經典的TCS，這里的HK是QseC，而RR是QseB和PmrA。無論是經典的TCS還是非經典的TCS，其中，HK都是一種跨膜蛋白，而且?guī)缀跛械腍K都含有2個跨膜區(qū)(TM1、TM2)。此外，在HK的N-端有一個能感受外界信號的輸入?yún)^(qū)，在C-端有一個由約250個氨基酸殘基組成的轉導區(qū)，該區(qū)具有磷酸激酶的功能，其磷酸化位點一般是保守的His殘基(H)。這些結構域由一系列跨膜螺旋連接，跨膜螺旋的數(shù)量因TCS而異。此外，轉導區(qū)中還含有5個由5～10個氨基酸殘基組成的高度保守區(qū)。一般認為，當受到外界環(huán)境的某種刺激時，HK會使其互作蛋白RR發(fā)生磷酸化，進而激活或阻遏靶基因。不僅如此，HK還能使與其相關聯(lián)的RR蛋白表現(xiàn)出磷酸酶活性，從而使RR蛋白去磷酸化。TCS中已發(fā)現(xiàn)的RR已有400多種，同源性分析表明，這些RR之間具有20%～30%的相似性。它們的N-端都含有一個約由110個氨基酸組成的信號接收區(qū)，其中，有一個保守的天冬氨酸殘基(Asp)是發(fā)生磷酸化的位點。RR的C端是具有某種輸出或效應器活性的結構域，稱為輸出區(qū)。在信號轉導的過程中，由HK自磷酸化產生的磷酸集團會被轉移到RR保守N端結構域的Asp殘基上，從而激活RR可變C端的輸出結構域，使其通過結合靶基因的啟動子來調節(jié)基因的表達(圖2)。通過這種磷酸化信號傳導通路，細菌能夠有效地感知周圍環(huán)境的變化(營養(yǎng)、pH、滲透壓、抗生素等)，從而使其能夠對動態(tài)環(huán)境進行快速、高效的反應。

圖1 革蘭陰性菌的關鍵耐藥機制[16]Fig.1 Key resistance mechanisms in gram-negative pathogenic bacteria[16]

2 TCS在革蘭陰性菌產生耐藥性過程中的作用

大多數(shù)情況下，TCS會直接對抗生素作出反應，如自身外排泵(efflux pump, EP)的活化等。而少數(shù)情況下TCS會參與到環(huán)境驟變或其他壓力刺激的調節(jié)中，導致細胞生理變化，從而間接使細菌對抗生素產生抗藥性。研究數(shù)據(jù)表明，TCS參與革蘭陰性菌耐藥性生成的主要機制包括外排泵的活化、生物被膜(biofilms，BF)的形成、外膜孔蛋白(outer membrane porin, OMP)擴散通道的減少、脂質A(lipid A)的修飾等(圖3)。例如，在中，PmrA/PmrB在抗生素的刺激下能夠調節(jié)lipid A的磷酸乙醇胺修飾，經過修飾的lipid A會讓細菌表面的負電荷減少，從而使多黏菌素無法結合到細菌表面；EvgA/EvgS能夠使編碼MDR外排泵的基因上調數(shù)百倍，讓對阿奇霉素的抗性提高64倍；CpxA/CpxR可以改變膜的通透性，下調OMP的表達，減少藥物流入等。此外，. Enteritidis中RcsC/RcsB可參與莢膜多糖生物合成、調控III型分泌系統(tǒng)、調節(jié)主要菌毛蛋白MrkA的產生以及賦予菌體抵抗低pH環(huán)境的能力等。

2.1 TCS調控細菌外排泵的活化

細菌外排泵(bacteria efflux pump，EPs)是存在于細菌外膜上的一組轉運蛋白。到目前為止，已經發(fā)現(xiàn)了八種與細菌耐藥相關的外排泵：ABC(ATP結合盒)超家族轉運蛋白、MATE(多藥及毒性化合物外排家族)、AbgT(對氨基苯甲酰-谷氨酸轉運蛋白)、RND(耐藥-結節(jié)-分化)家族、DMT(藥物/代謝物轉運蛋白超家族)、SMR(小型多重耐藥家族)、MFS(主要易化子超家族)和PACE(蛋白細菌抗菌化合物外排)。EP所轉運的底物可單一，也可以多種多樣，即可以專一地外排一種底物，也可以排出多種不同的物質。所以，當抗生素入侵到細菌內部時，EP就會被激活，激活后的EP可以識別并向胞外特異性的排出一種或多種抗生素，從而使菌株產生耐藥性。

圖2 雙組分調控系統(tǒng)(TCS)信號傳導基本過程Fig.2 The basic process of signal conduction in two-component regulatory systems

圖3 雙組分調控系統(tǒng)(TCS)在促進細菌耐藥形成過程中的作用Fig.3 The role of the two-component regulatory systems in promoting the formation of bacterial resistance

2004年，Marchand等首次在中發(fā)現(xiàn)AdeR/AdeS能夠調節(jié)AdeABC多藥耐藥性EP的產生。在AdeR/AdeS中，AdeS是該菌adeABC操縱子表達所必需的基因，而adeABC正是編碼RND、MDR外排系統(tǒng)的基因。此外，通過對比AdeR/AdeS缺失株的轉錄數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，adeABC的表達量發(fā)生了明顯的下降。同時，AdeR/AdeS缺失株對亞胺培南(imipenem)、卡那霉素(kanamycin)、慶大霉素(gentamycin)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、四環(huán)素(tetracycline)、替加環(huán)素(tigecycline)、氯霉素(chloramphenicol)和溴化乙錠(ethidium bromide)的MIC值也都出現(xiàn)了顯著降低。除此之外，中的EvgA/EvgS和YhiU/YhiV；Enteritidis 中的CusS/CusR和BaeS/BaeR等TCS都與EP的活化相關(見表1)。據(jù)報道，有超過10%的細菌基因組中存在大量編碼EP的基因，EP的廣泛存在表明它是細菌產生耐藥性的重要原因之一。在鼠傷寒沙門菌中，BaeS/BaeR可以通過正向調控靶基因、、、、和的轉錄表達，并直接調控marR的表達,從而影響菌株對氟喹諾酮類藥物的耐藥性。同時，EP的過表達還是抗微生物治療過程中頻繁失敗的標志之一。正如上面所提及的，TCS能夠廣泛參與到EP過表達的調控中，所以說TCS在調控細菌EP活化的過程中發(fā)揮著重大作用。

表1 介導活化EPs的TCS

2.2 TCS調控細菌外膜Lipid A的修飾

臨床中常見的帶正電荷的抗生素，如多黏菌素B(polymyxin B)、黏菌素(colistin)、氨基糖苷類(aminoglycosides)以及宿主陽離子抗菌肽 (cationic antimicrobial peptide，CAMP)，它們的殺菌機制主要是利用其自身的正電荷與革蘭陰性菌外膜上帶負電荷的Lipid A通過靜電作用結合，導致膜破裂，使得藥物或肽進入細菌。然而，為了在殺菌壓力中存活下來，病原菌采取了相應的抵抗機制。比如，細菌可以通過Lipid A 的共價修飾來逆轉這種狀態(tài)。經過Lipid A的修飾，其外膜帶正電荷，可降低或消除抗生素的作用。而修飾Lipid A的3種最常見方式是添加4-氨基阿拉伯糖 (L-Ara4 N)、磷酸乙醇胺 (PEtN) 或棕櫚酸。其中棕櫚酸修飾僅會降低膜流動性，并不影響電荷。

TCS在Lipid A的修飾中起主要調控作用。在許多革蘭陰性細菌物種中，如、、等，存在著兩種經典的修飾Lipid A的TCS，即PhoP/Q和PmrA/B。這兩對TCS在不同的革蘭陰性菌中對Lipid A進行修飾的途徑不同。比如，雖然PhoQ均是位于內膜中的HK，能夠在低濃度的Mg或聚陽離子肽的存在下被激活，進而激活PhoP。在. Enteritidis中，激活后的PhoP可以進一步激活PmrA/B，進而分別激活pmrCAB和arnBCADTEF-pmrE操縱子，從而添加PEtN和L-Ara4 N以修飾Lipid A。而在中，arnBCADTEF-pmrE操縱子可以由PhoP或PmrA/B直接激活。此外，PmrA/B還能夠通過感知低pH或高Fe水平，獨立于PhoP/Q而激活。中PmrA/B的高表達可使編碼Lipid A磷酸乙醇胺轉移酶的pmrC轉錄增加30倍。不僅如此，PhoP 還可以激活pagB，這是一種編碼棕櫚酰轉移酶的基因，通過添加棕櫚酸來修飾Lipid A。

雖然TCS對Lipid A的修飾(如表2)讓很多革蘭陰性菌獲得了對帶正電荷抗生素的抗性，增加了臨床治療的難度，但在該修飾過程中眾多細節(jié)值得深入挖掘并利用。比如，上述提及的修飾機制大多是由修飾酶來完成的，而這些修飾酶大多為膜蛋白, 其活性位點多存在于細菌外膜的外側或者周質，這就使得以這些修飾酶為靶點開發(fā)相應的藥物成為可能。此外，Lipid A除了是維持革蘭陰性菌細胞外膜滲透性屏障的主要組分，同時也是內毒素的活性成分。這使得Lipid A可以成為一種很好的免疫激活因子，這為Lipid A成為免疫佐劑提供了可能。

表2 介導LPS修飾的TCS

2.3 TCS調控細菌OMP擴散通道的減少

細菌能夠通過調控孔蛋白和外排泵的表達來調節(jié)許多分子的進出。其中，孔蛋白也稱為外膜蛋白(OMP)，是嵌入革蘭陰性細菌OMP中的β-桶狀蛋白，允許分子的被動擴散。孔蛋白還充當噬菌體和細菌素的受體，并與肽聚糖和LPS一起在維持細菌細胞的完整性方面發(fā)揮重要作用。因此，OMP表達水平的改變，進而導致外膜通透性的改變，已成為革蘭陰性菌產生MDR機制的主要原因。也正因為臨床常見的β-內酰胺類(beta-lactam antibiotics)、氨基糖苷類、碳青霉烯類(carbapenems)和氟喹諾酮類(fluoroquinolones)等親水性抗生素都是通過孔蛋白進入細胞的。因此，通過TCS下調孔蛋白的表達，可以有效減少藥物滲透，從而降低細菌對多種抗生素的敏感性。

一般認為33～36 ku的外膜蛋白(Omp33-36)可作為水通道。此前有學者對碳青霉烯類抗生素具有抗性的JC10/01菌株進行分析，發(fā)現(xiàn)該菌株有Omp33-36的缺失。此后，通過過表達該菌株中Omp33-36，發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠明顯降低JC10/01菌株對亞胺培南和美羅培南(meropenem)的MIC，這印證了OMP對耐藥性的產生至關重要。

EnvZ/OmpR，是一對存在于、和等革蘭陰性菌中經典的TCS。在這個TCS中，EnvZ主要通過感知滲透壓變化而調節(jié)OmpR，從而根據(jù)環(huán)境中某些化學物質的水平調節(jié)OMP孔蛋白OmpC和OmpF的表達水平。已發(fā)現(xiàn)這些OMP表達水平的降低可使得多種革蘭陰性菌對β-內酰胺類抗生素產生高水平抗性。除此之外，在中，CzcR/CzcS和CopR/CopS能夠響應環(huán)境中金屬離子的存在。其中CzcS感應鋅、鈷、鎘和銅金屬離子，CopS感應銅金屬離子；CzcR和CopR能夠抑制OrpD孔蛋白的表達，從而導致耐β-內酰胺類抗生素的的廣泛產生和大流行，使得在治療該細菌感染時，效果不理想。的兩種TCS，即CpxA/CpxR和PhoB/PhoR，它們也能抑制KpnO孔蛋白的表達，從而降低包括氯霉素、阿米卡星、萘啶酸和四環(huán)素在內的抗生素的敏感性。

OMP除了與細菌的毒力和代謝密切相關之外，它還是細菌引起機體免疫反應的重要免疫刺激物。這使得當TCS調控OMP表達量下降后，不僅使菌株變得耐藥，還會在一定程度上使菌株更難被免疫系統(tǒng)識別和清除。所以說，TCS調控所帶來的耐藥菌株的危害并不僅僅是在耐藥性方面。

部分調控細菌OMP的TCS見表3。

表3 調控細菌OMP的TCS

2.4 TCS調控細菌BF的形成

BF是附著于有生命或無生命物體表面被細菌胞外大分子包裹的有組織的細菌群體，是許多細菌感染治療的主要障礙。這種結構對于細菌生存至關重要，它可以在一定程度上保護細胞免受環(huán)境影響、抵消內部高膨脹壓力、充當滲透屏障，還可以將信息從細胞周圍環(huán)境最終傳輸?shù)狡鋬炔康幕蚪M中。

現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示，有的TCS(表4)在感受到外界特異性刺激信號后能夠上調編碼BF的基因，從而促進BF生成。例如中的SagS/SagR、BfiS/BfiR、BfmS/BfmR和MifS/MifR等。在該調控機制中，SagS通過接收浮游狀態(tài)下的細菌特異性信號，進而將信號傳遞給BF特異性的TCS BfiS/BfiR，從而促進與菌體附著相關的微調控RNA RsmZ的表達，并實現(xiàn)最初依附到BF發(fā)展進程的轉變。此外，在這個級聯(lián)調控機制中，SagS可以通過激活第2個TCS，即BfiS/BfiR，促進微調控RNA RsmZ的表達，從而實現(xiàn)完成BF從附著期到擴散期的發(fā)育過程。上述的4對TCS的缺失使得的BF在3個不同的發(fā)育階段被終止。其中，SagS和BfiS的缺失讓BF的形成停滯于附著階段，而BfmR和MifR的缺失讓BF分別在其發(fā)育成熟的Ⅰ和Ⅱ階段停滯。

此外，中的GacS/GacA也是BF形成必不可少的，不同于其他的TCS，GacS不能發(fā)生自磷酸化，必須由傳感器激酶RetS激活，RetS能夠對GacS起到激酶和磷酸酶的作用。除此之外還有很多TCS也能間接地參與到BF的生成過程中，比如Rcs/Pvr、PprA/PprB和PilR/PilS，它們能夠調節(jié)IV型菌毛的表達，而這些菌毛是表面黏附和BF形成的先決條件。副豬嗜血桿菌和雙基因缺失后，形成生物被膜的能力明顯弱于野毒株。生物被膜作為細菌生長的一種自我保護狀態(tài)，它的表達在很大程度上影響著細菌的毒力和生存能力。同時，由于TCS在生存過程中的調控作用，使得BF的形成獲得了更高的靈活性，增加了菌株應對環(huán)境刺激的能力。而目前抗細菌BF的藥物仍未達到預期的治療效果。

3 討 論

TCS是細菌適應外界環(huán)境或宿主內環(huán)境的自身調節(jié)機制，這是一個自動的、智能的調節(jié)過程。有研究表明，自動調節(jié)會導致“短期記憶”或“學習行為”。這意味著一旦細菌曾經感知過某一刺激信號，就會形成對該刺激的記憶，并且在隨后的暴露接觸中對信號作出更快或更廣泛的反應。此外，雖然TCS的自動調節(jié)機制既能促進基因表達，也能抑制基因表達。但是，在常見的革蘭陰性菌中，促進機制較常見，較少有抑制機制，該現(xiàn)象可能與細菌受外界刺激信號的類型相關。

細菌內部存在的TCS的種類很多，如表3所列，同一種TCS，如 PmrA/PmrB，在不同的細菌中發(fā)揮著相同的調控作用，而CusS/CusR，卻在不同細菌中發(fā)揮著相近而又不相同的生物學功能。同時，圖3表明有的TCS涉及兩個或多個完全不同的生理過程，不同的TCS之間還會存在垂直或者水平的調控機制，使得該機制在細菌內形成了一個結構復雜的調控網(wǎng)絡。在所統(tǒng)計的TCS之外，還有很多未發(fā)現(xiàn)的或者功能未驗證的TCS，在作者前期研究中發(fā)現(xiàn)，所產生耐藥現(xiàn)象并不都是因為菌株攜帶耐藥基因或藥物靶位點的突變導致，而是存在另外的一些耐藥機制來協(xié)同發(fā)揮作用的。當添加兩種外排泵抑制劑(CCCP和PAβN)后，將與不同種類的抗生素相互作用，利用q-RT-PCR檢測菌株中外排基因與抗生素的相關性，發(fā)現(xiàn)在菌株中主要存在RND和MFS兩種發(fā)揮作用的外排泵系統(tǒng)。比較基因組學分析后發(fā)現(xiàn)染色體中存在三對假定的TCS(296_08465296_0847、296_05850296_05845、296_06485296_06480)，通過缺失株的構建及MIC檢測，發(fā)現(xiàn)TCS (296_06485296_06480)與的耐藥緊密相關。

表4 介導BF形成的TCS

雖然上文提及的TCS能夠介導細菌多種類型的耐藥機制，使得耐藥現(xiàn)象更加普遍。但是，以組氨酸為基礎的TCS作為細菌內部長期穩(wěn)定存在的調控機制，與真核細胞內以絲氨酸或蘇氨酸為基礎的信號傳導系統(tǒng)有很大的不同。同時，很多不同種屬的細菌中存在結構和功能高度同源的TCS。TCS的這些特點為其在未來成為抗細菌藥物靶位點提供了可能，并且可以同時對多種細菌產生殺傷作用。其次，由于TCS能夠在細菌內形成復雜的調控網(wǎng)絡，所以針對于TCS的藥物不僅能夠針對一條調控途徑，還能夠通過廣泛影響調控網(wǎng)絡從而在整體上影響細菌活性。再次，細菌內存在很多直接或間接受TCS調控的抗性基因，所以靶向TCS藥物還可以作為很好的輔助治療藥物。雖然目前尚未報道成熟的以TCS為靶位點的藥物，但科學家們在對TCS中的RR DNA結合域、自磷酸化位點以及ATP結合域的研究中所取得的進展，為這一想法實施提供了堅實的基礎。

總之，細菌TCS的發(fā)現(xiàn), 加深了人們對微生物體內復雜調控網(wǎng)絡的理解。當然，TCS中還存在很多未知而又神秘的地方等待人們去探索。同時，筆者相信在不久的未來，一定可以通過對TCS的深入研究來實現(xiàn)造福人類的美好愿望。