梁巧蘭　魏列新　柳利龍　吳瓊　徐秉良

摘要

為了解甘肅省裸仁美洲南瓜白粉菌對(duì)己唑醇敏感性及抗性產(chǎn)生情況，采用小株噴霧法對(duì)采自蘭州、武威、景泰等地的20個(gè)南瓜白粉菌菌株對(duì)己唑醇的敏感性進(jìn)行了測(cè)定，利用紫外誘導(dǎo)、藥劑馴化、先紫外后藥劑馴化三種方法對(duì)敏感菌株進(jìn)行了抗藥性誘導(dǎo)，并對(duì)抗性突變菌株的生物學(xué)性狀及其對(duì)丙環(huán)唑、氟硅唑、腈菌唑和戊唑醇的交互抗性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明20個(gè)南瓜白粉菌菌株對(duì)己唑醇的敏感性存在一定差異，EC50值在17.77～285.54 μg/mL范圍內(nèi)；與其他兩種誘導(dǎo)方法相比藥劑馴化方法獲得的抗性突變菌株的抗性倍數(shù)最高，為 8.94倍。敏感菌株和抗性突變菌株孢子萌發(fā)的最佳時(shí)間分別為36 h和48 h；抗性突變菌株產(chǎn)孢量和致病力明顯高于敏感菌株；適合度測(cè)定表明抗性突變菌株與敏感菌株之間存在競(jìng)爭(zhēng)力，孢子萌發(fā)率、芽管個(gè)數(shù)之間差異顯著，菌絲分支數(shù)、產(chǎn)孢量之間差異不顯著；抗性突變菌株在抗性突變菌株和敏感菌株混合比例為80∶20的群體中，存在頻率比較穩(wěn)定，連續(xù)培養(yǎng)7代后仍占85.69%；己唑醇抗性突變菌株對(duì)丙環(huán)唑、氟硅唑、腈菌唑和戊唑醇4種藥劑未表現(xiàn)出交互抗性。研究結(jié)果可為甘肅省防治南瓜白粉病提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞

裸仁美洲南瓜； 白粉菌； 己唑醇； 抗性誘導(dǎo)； 抗性菌株； 生物學(xué)性狀； 交互抗性

中圖分類(lèi)號(hào)：

S 481.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017152

Resistance induction of Podosphaera xanthii in pumpkin to hexaconazole and

biological characterization of its resistant strains in Gansu

LIANG Qiaolan， WEI Liexin， LIU Lilong， WU Qiong， XU Bingliang

（College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Biocontrol Engineering Laboratory of

Crop Diseases and Pests of Gansu Province， Lanzhou 730070， China）

Abstract

To understand the sensitivity and resistance of the pathogen powdery mildew in hullless pumpkin to hexaconazole in Gansu Province， the sensitivity of 20 Podosphaera xanthii strains collected from the fields of Lanzhou， Wuwei， Jingtai and other places to hexaconazole were measured in pumpkin seedling leaves by smallseedling spray method； the resistance of sensitive strain to hexaconazole was induced by using three kinds of UVinduction， fungicide screening， UVinduction before fungicide screening methods and biological characterization of the resistant strains and its crossresistance to propiconazole， myclobutanil， flusilazole， tebuconazole were also studied. The results indicated that there were some differences in the susceptibility of the 20 strains of Podosphaera xanthii to hexaconazole， with EC50 value from 17.77 μg/mL to 285.54 μg/mL. Compared with the other two methods， the resistance fold of the resistant mutant strains obtained by hexaconazole screening in the laboratory was the highest （8.94 fold）. The optimum times for spore germination of sensitive strains and resistant mutant strains were 36 h and 48 h， respectively. The sporulation and pathogenicity of resistant strains were higher than those of sensitive strains， and there were significantly differences in conidial germination percentage and the number of germ tubes between resistant mutant strains and sensitive strains； however， the difference in their mycelial branch and sporulation rate were not significant. Resistant mutant strains were more stable in the mixed ratio of resistant and susceptible strains of 80：20， and still accounted for 85.69% after continuous cultivation for 7 generations. Resistant mutant strains to hexaconazole exhibited no crossresistance among the 4 kinds of triazole fungicides， i.e. propiconazole， myclobutanil， flusilazole， and tebuconazole. The results provided a theoretical basis for the efficient application of hexaconazole for the control of pumpkin powdery mildew in the field in Gansu Province.

Key words

hullless pumpkin； Podosphaera xanthii； hexaconazole； resistance induction； resistant strain； biological characterization； crossresistance of triazole fungicide

裸仁美洲南瓜Cucurbita moschata Duch. ex Lam.為葫蘆科南瓜屬一年生草本植物。因其種子有種仁而無(wú)種皮，故而又稱(chēng)無(wú)殼南瓜，是一種比較罕見(jiàn)的變異類(lèi)型。由于其營(yíng)養(yǎng)豐富、用途廣泛、經(jīng)濟(jì)效益高而發(fā)展非常迅速[1]。目前，裸仁美洲南瓜在全國(guó)各地均有種植，產(chǎn)量約180萬(wàn)t，占世界總產(chǎn)量的1/3[2]，對(duì)提高農(nóng)民收入和帶動(dòng)本地經(jīng)濟(jì)發(fā)展起到了重要作用。但是，白粉病Podosphaera xanthii的發(fā)生日趨嚴(yán)重，已成為我國(guó)乃至國(guó)外生產(chǎn)綠色南瓜的主要制約因素[34]。南瓜白粉病不僅能降低植株的光合利用率，嚴(yán)重時(shí)還能使整株黃萎干枯，早衰死亡，最終導(dǎo)致南瓜產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)下降[56]。目前，南瓜白粉病的防治主要采用化學(xué)藥劑，化學(xué)藥劑具有防治迅速、見(jiàn)效快等特點(diǎn)。三唑類(lèi)殺菌劑是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治瓜類(lèi)白粉病的高效藥劑，其中又以己唑醇防效最為突出[7]，具有高效、低毒、廣譜和內(nèi)吸活性，對(duì)多種真菌引起的病害具有保護(hù)和鏟除作用[8]。該藥劑于2004年在我國(guó)登記用于防治黃瓜白粉病，具有用量少、對(duì)植株相對(duì)安全性高的特點(diǎn)，應(yīng)用潛力較大。但由于三唑類(lèi)殺菌劑具有共同的作用位點(diǎn)，長(zhǎng)期、大量使用易使病原菌產(chǎn)生抗藥性[9]。1984年用該類(lèi)藥劑防治瓜類(lèi)白粉病菌表現(xiàn)出藥效下降的現(xiàn)象[10]。另?yè)?jù)報(bào)道，三唑類(lèi)殺菌劑還存在抗藥性風(fēng)險(xiǎn)以及同類(lèi)藥劑之間的交互抗性問(wèn)題[11]。

目前針對(duì)瓜類(lèi)白粉菌抗藥性的研究，僅在黃瓜白粉病菌對(duì)己唑醇的抗性、室內(nèi)采用離體葉片接種法連續(xù)2次使用己唑醇防治南瓜白粉病菌后，病原菌對(duì)5%己唑醇ME產(chǎn)生了輕度抗性的報(bào)道[7，9，1213]，而己唑醇等三唑類(lèi)藥劑尚未在南瓜田廣泛應(yīng)用，所以有必要對(duì)其抗藥性風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。本研究測(cè)定了采自甘肅省不同地方的20株南瓜白粉病菌對(duì)己唑醇的敏感性；采用藥劑馴化方法獲得了對(duì)己唑醇的抗性突變菌株，對(duì)抗性突變菌株和敏感菌株的生物學(xué)性狀、適合度進(jìn)行了比較，并測(cè)定了己唑醇抗性突變菌株對(duì)4種三唑類(lèi)殺菌劑的交互抗性。試驗(yàn)結(jié)果對(duì)指導(dǎo)己唑醇在南瓜白粉病防治中的科學(xué)合理應(yīng)用具有重要意義；同時(shí)，可為評(píng)估南瓜白粉病菌對(duì)己唑醇抗藥性風(fēng)險(xiǎn)以及制定科學(xué)的抗藥性治理措施奠定基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 材料

供試藥劑：95%己唑醇（hexaconazole）原藥，江蘇豐登農(nóng)藥有限公司；95%腈菌唑（myclobutanil）原藥，漯河市新浩元農(nóng)資有限公司；95%丙環(huán)唑（propiconazole）原藥，溫州綠佳化工有限公司；98%氟硅唑（flusilazole）原藥，常熟恒耀新材料有限公司；98%戊唑醇（tebuconazole）原藥，河南萬(wàn)山化工產(chǎn)品有限公司。

供試菌種：供試菌株從南瓜種植田中感染白粉病的南瓜上采集，其中蘭州9株、武威5株、景泰4株，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)1株；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供的室內(nèi)培養(yǎng)的南瓜白粉病菌菌株（SY2）1株。

供試品種：裸仁美洲南瓜感病品種‘天然，由武威金蘋(píng)果種業(yè)有限公司提供。

試驗(yàn)材料：光學(xué)顯微鏡、毛筆、紫外燈、燒杯、小型噴霧器、考馬斯亮藍(lán)、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate， 簡(jiǎn)稱(chēng)SDS）。

1.2 方法

1.2.1 南瓜白粉病菌對(duì)己唑醇敏感性測(cè)定及敏感菌株的獲得

用環(huán)己酮和二甲基甲酰胺將農(nóng)藥原藥溶解，然后加乳化劑E l10和1602#，配制成有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的微乳劑，噴施時(shí)直接用水稀釋至使用濃度。病害調(diào)查參考賈忠明的方法[7]。采用小株噴霧法測(cè)定南瓜白粉病菌對(duì)己唑醇敏感性，將采自不同地方的南瓜白粉病菌孢子用毛筆刷下溶于5 mL含0.1%SDS的溶液中，接種在實(shí)驗(yàn)室盆栽的健康南瓜植株上（兩葉期）。發(fā)病后將病原菌制成臨時(shí)玻片在顯微鏡下觀察病原菌形態(tài)，確定為南瓜白粉病病原后，取單個(gè)病斑接種到健康南瓜植株上進(jìn)行白粉菌擴(kuò)繁，將擴(kuò)繁得到的白粉菌配成孢子懸浮液，孢子濃度為50～60個(gè)分生孢子/視野（10×10倍），采用涂抹法接種健康南瓜植株，3 d后噴施系列濃度的己唑醇水稀釋液（濃度分別為：1 000、500、250、125、62.5 μg/mL、CK）。每濃度處理10株，重復(fù)3次，放置在室溫下（25℃）培養(yǎng)7 d，按下列分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病斑（表1），并按下式計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[14]。

1.2.2 南瓜白粉病菌抗藥性突變菌株的獲得

南瓜白粉菌對(duì)己唑醇抗性的誘導(dǎo)參考楊連來(lái)等[12]的方法進(jìn)行，略有修改。根據(jù)1.2.1毒力測(cè)定的結(jié)果，選取對(duì)己唑醇極敏感的菌株在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)接種培養(yǎng)作為敏感菌株，將其分生孢子配制成懸浮液，孢子濃度為50～60個(gè)分生孢子/視野（10×10倍），采用涂抹法接種在南瓜葉片上，在25℃、RH 60%、4 400 lx光照12 h/d的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d后，備用。

1.2.2.1 紫外誘導(dǎo)

接種敏感菌株后培養(yǎng)3 d的南瓜幼苗放在功率為30 W的紫外燈（波長(zhǎng)254 nm）下分別照射（預(yù)熱30 min，距離南瓜子葉30 cm）2、3、4、5.5、10 min后，放置在培養(yǎng)箱內(nèi)20℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)移到25℃、RH 60%、4 400 lx光照12 h/d的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，待產(chǎn)生大量孢子堆后，用毛筆掃下，配成孢子懸浮液再次接種，3 d后用小型噴霧器均勻噴施系列濃度的己唑醇水稀釋液，晾干后繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，有明顯可見(jiàn)病斑后檢查并記錄葉片發(fā)病情況。按1.2.1中的方法檢查病斑個(gè)數(shù)并計(jì)算藥劑防治效果，求其EC50，將紫外照射后獲得的菌株EC50與敏感菌株EC50相比，計(jì)算抗性突變菌株的抗性倍數(shù)，抗性類(lèi)別參考慕立義害蟲(chóng)抗藥性類(lèi)別制定，略有修改（表2）[15]。評(píng)價(jià)室內(nèi)誘導(dǎo)的抗性突變菌株的抗性水平，確定紫外線(xiàn)最佳誘導(dǎo)時(shí)間；選擇抗性水平最高的菌株以篩選出的最佳誘導(dǎo)時(shí)間再通過(guò)紫外照射，連續(xù)誘變7代，記錄第1、3、5、7代的抗性水平。孢子懸浮液濃度和培養(yǎng)條件同上。

抗性倍數(shù)RF=抗性菌株EC50/敏感菌株EC50。

1.2.2.2 藥劑馴化

用小型噴霧器向接種敏感菌株后培養(yǎng)3 d的南瓜幼苗均勻噴施系列濃度的己唑醇水稀釋液，晾干后在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)7 d，檢查并記錄葉片發(fā)病情況。計(jì)算其EC50。用毛筆掃下發(fā)病的孢子堆配成孢子懸浮液再次接種南瓜葉片，培養(yǎng)3 d后噴施濃度為EC50值的己唑醇水稀釋液，發(fā)病后獲得的白粉菌孢子作為藥劑馴化的第1代，如此連續(xù)馴化7代后，測(cè)定每一代的EC50和抗性水平。孢子懸浮液濃度、培養(yǎng)條件和計(jì)算方法同上。

1.2.2.3 先紫外誘導(dǎo)后藥劑馴化

按上述篩選出最佳誘導(dǎo)時(shí)間紫外誘導(dǎo)結(jié)束后，將產(chǎn)生的孢子堆配成孢子懸浮液接種在南瓜葉片上，以第1次藥劑馴化所測(cè)得的敏感菌株EC50作為藥液濃度噴施處理接種發(fā)病的南瓜幼苗后，產(chǎn)生的白粉菌作為第1代誘導(dǎo)菌株，再用第1代誘導(dǎo)菌株接種南瓜幼苗，培養(yǎng)3 d后用紫外線(xiàn)照射相同的時(shí)間，然后噴施己唑醇水稀釋液（濃度為第1代誘導(dǎo)菌株的EC50），重復(fù)上述步驟，共誘導(dǎo)7代，測(cè)定每一代的EC50和抗性水平。孢子懸浮液濃度、培養(yǎng)條件和計(jì)算方法同上。

1.2.3 南瓜白粉病菌抗性突變菌株的生物學(xué)特性

1.2.3.1 抗性突變菌株的抗性穩(wěn)定性測(cè)定

將上述藥劑馴化獲得的抗性突變菌株在不施藥的情況下連續(xù)培養(yǎng)5代后，噴施系列濃度的己唑醇（濃度同1.2.1），計(jì)算每代的EC50，比較抗性水平的變化。

1.2.3.2 抗性突變菌株的生物學(xué)性狀

選取對(duì)己唑醇極敏感的菌株在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)接種培養(yǎng)作為敏感菌株，以藥劑馴化的為抗性突變菌株，觀察兩者的孢子萌發(fā)，將敏感菌株和抗性突變菌株的孢子懸浮液分別涂抹接種于南瓜葉片，在25℃、RH 60%、4 400 lx光照12 h/d的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，于接種后不同時(shí)間打取葉子圓片后按照Kuzuyal等[16]所描述的方法觀察并計(jì)算孢子萌發(fā)率，每12 h檢查1次結(jié)果，試驗(yàn)重復(fù)3次，按下式計(jì)算孢子萌發(fā)率。

孢子萌發(fā)率=萌發(fā)的孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100%。

敏感菌株和抗性突變菌株致病力和產(chǎn)孢量測(cè)定參考楊連來(lái)方法[12]進(jìn)行。接種的南瓜植株放置于25℃、RH 60%、4 400 lx光照12 h/d的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，7 d后按表1中的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病情況，分別計(jì)算敏感菌株和抗性突變菌株的發(fā)病率和病情指數(shù)，重復(fù)3次。

1.2.4 抗性突變菌株適合度及其與敏感菌株的競(jìng)爭(zhēng)力測(cè)定

參考楊連來(lái)等[9]的方法進(jìn)行，略有修改。將相同濃度的敏感菌株和抗性突變菌株孢子懸浮液（1×105個(gè)/mL）分別涂抹接種在南瓜葉片上培養(yǎng)，于接種40、52、96 h、發(fā)病10 d后顯微鏡下對(duì)抗性菌株和敏感菌株的分生孢子萌發(fā)率、分生孢子芽管數(shù)目、菌絲體的分支數(shù)目和病斑中分生孢子的數(shù)量進(jìn)行適合度測(cè)定；競(jìng)爭(zhēng)力測(cè)定中，將敏感菌株和抗性突變菌株的分生孢子懸浮液（1×105個(gè)/mL），分別按照20∶80，50∶50和80∶20體積比混合后，涂抹接種南瓜葉片，14 d后收集分生孢子接種下一代，如此重復(fù)1、3、7代后，再將收集到的第7代分生孢子配制成懸浮液接種南瓜葉片，發(fā)病后用打孔器將單個(gè)病斑取下，漂浮在對(duì)敏感菌株具有最小抑制作用濃度（10 μg/mL）的己唑醇藥液中。然后放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察病斑擴(kuò)大情況，記錄其數(shù)量，按下式計(jì)算抗藥性菌株頻率。以上數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0進(jìn)行LSD法統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05。

抗藥性菌株頻率=病斑擴(kuò)大的數(shù)量/打取葉片的總數(shù)量×100%。

1.3 己唑醇抗性突變菌株對(duì)4種三唑類(lèi)殺菌劑的交互抗性

配制己唑醇F7代抗性突變菌株和敏感菌株的分生孢子懸浮液，涂抹接種于南瓜葉片上， 96 h后分別噴系列濃度的氟硅唑、丙環(huán)唑、戊唑醇和腈菌唑等藥液，每處理重復(fù)4次，噴藥7 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)南瓜葉片上的病斑數(shù)目，計(jì)算防治效果及抗性菌株和敏感菌株的EC50，并進(jìn)行比較，求出抗性倍數(shù)（公式同1.2.2.1中抗性倍數(shù)計(jì)算公式），按表2中標(biāo)準(zhǔn)確定抗藥性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜白粉病菌己唑醇敏感菌株的獲得

對(duì)采自蘭州市、武威、景泰和甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)校園等不同地區(qū)的南瓜白粉菌19個(gè)菌株和SY2對(duì)己唑醇的敏感性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明這20個(gè)菌株對(duì)己唑醇敏感性存在一定差異，其中采自武威的菌株EC50最高達(dá)285.54 μg/mL，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)的菌株EC50最低，為17.77 μg/mL，相差15.07倍，其余各菌株的EC50介于兩者之間；將采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)的菌株ND1經(jīng)室內(nèi)接種南瓜幼苗培養(yǎng)擴(kuò)繁5代后，測(cè)定其對(duì)己唑醇的EC50后發(fā)現(xiàn)，與SY2菌株的EC50相接近，為此以SY2作為己唑醇敏感菌株（表3）。

2.2 南瓜白粉菌對(duì)己唑醇抗性的獲得

2.2.1 紫外照射不同時(shí)間對(duì)南瓜白粉菌抗性突變體的誘導(dǎo)

通過(guò)紫外線(xiàn)對(duì)以上敏感性測(cè)定獲得的南瓜白粉病菌敏感菌株SY2照射不同時(shí)間后，獲得了南瓜白粉病菌抗性突變菌株，且隨著紫外線(xiàn)照射時(shí)間的增加，南瓜白粉病菌對(duì)己唑醇抗性倍數(shù)呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，其中以照射2 min時(shí)所獲得的抗性倍數(shù)最低，為1.39，照射3 min所獲得的抗性倍數(shù)最高，為2.53，其他照射時(shí)間的抗性倍數(shù)均低于2.53，分別為1.81、1.73和1.67，而且照射時(shí)間超過(guò)3 min后南瓜幼苗死亡嚴(yán)重，因此，紫外線(xiàn)最佳照射誘導(dǎo)時(shí)間為3 min（圖1）。

2.2.2 抗性突變菌株誘導(dǎo)方法比較

通過(guò)對(duì)三種方法誘導(dǎo)南瓜白粉病菌SY2菌株對(duì)己唑醇產(chǎn)生抗性的比較，發(fā)現(xiàn)三種方法均能獲得抗性突變菌株（每種方法誘導(dǎo)獲得1株），隨著抗性誘導(dǎo)代數(shù)的增加， 抗性倍數(shù)逐漸增大，其中藥劑馴化方法獲得的抗性突變菌株的抗性倍數(shù)最高，且與其他兩種方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗性突變菌株抗性倍數(shù)之間存在極顯著差異（表4）。

2.3 南瓜白粉病菌抗性突變菌株穩(wěn)定性測(cè)定

通過(guò)對(duì)己唑醇藥劑馴化獲得的抗性突變菌株抗性穩(wěn)定性測(cè)定，結(jié)果表明將抗性突變菌株（F7，RF=8.94）連續(xù)培養(yǎng)5代后（F8、F9、F10、F11、F12），其抗性倍數(shù)相對(duì)于F7菌株的抗性倍數(shù)差異不大，表明抗性穩(wěn)定性較好（圖2）。

2.4 南瓜白粉菌抗性突變菌株生物學(xué)性狀研究

2.4.1 南瓜白粉菌敏感菌株和抗性突變菌株孢子萌發(fā)觀察

通過(guò)對(duì)己唑醇藥劑馴化獲得的抗性突變菌株（F7，RF=8.94）孢子萌發(fā)率測(cè)定，結(jié)果表明敏感菌株（SY2）和抗性突變菌株均在接菌8 h后開(kāi)始萌發(fā)；其萌發(fā)的最佳時(shí)間分別為36 h和48 h，孢子萌發(fā)率分別達(dá)到13.58%和16.26%。方差分析表明，抗性突變菌株和敏感菌株孢子萌發(fā)率在48 h差異極顯著，其他時(shí)間差異不顯著（圖3，表5）。

2.4.2 敏感菌株和藥劑馴化菌株致病力和產(chǎn)孢量的測(cè)定

通過(guò)致病力測(cè)定，結(jié)果表明隨著藥劑馴化次數(shù)的增加，誘導(dǎo)菌株的發(fā)病率和病情指數(shù)均高于敏感菌株，第1、3、5、7代藥劑馴化菌株的發(fā)病率分別比敏感菌株（SY2）提高了1.71%、16.00%、12.55%和15.65%；病情指數(shù)分別比敏感菌株的高3.16、7.31、5.95、13.48，表明藥劑馴化菌株的致病力隨著藥劑馴化次數(shù)的增加而增強(qiáng)。方差分析表明，第7代馴化菌株和敏感菌株的發(fā)病率和平均病情指數(shù)之間差異極顯著，其他各代的發(fā)病率和病情指數(shù)介于兩者之間（表6）。

對(duì)敏感菌株和藥劑馴化菌株產(chǎn)孢量測(cè)定結(jié)果表明，隨著藥劑馴化次數(shù)的增加抗性突變菌株后代的產(chǎn)孢量相對(duì)于敏感菌株（SY2）有所增加，接種10 d后第1、3、5、7代藥劑馴化的抗性突變菌株產(chǎn)孢量分別比敏感菌株高1.07×105、1.21×105、1.28×105、1.85×105個(gè)/mL。方差分析結(jié)果表明第7代藥劑馴化的抗性突變菌株（F7）產(chǎn)孢量與敏感菌株（SY2）的產(chǎn)孢量之間存在顯著差異，其他菌株產(chǎn)孢量介于兩者之間（表6）。

2.4.3 抗藥性菌株適合度的測(cè)定

通過(guò)己唑醇藥劑馴化第7代的白粉菌抗性突變菌株（F7，RF=8.94）適合度測(cè)定，結(jié)果表明抗性突變菌株在孢子萌發(fā)率、芽管個(gè)數(shù)、菌絲的分支數(shù)目和產(chǎn)孢量等方面均高于敏感菌株，其中藥劑馴化菌株和敏感菌株的孢子萌發(fā)率、芽管個(gè)數(shù)之間差異顯著，而菌絲的分支數(shù)目、產(chǎn)孢量差異不顯著（表7）。

2.4.4 敏感菌株和抗性突變菌株分生孢子競(jìng)爭(zhēng)能力的測(cè)定

使用藥劑馴化后獲得的抗性突變菌株（F7，RF=8.94）和敏感菌株之間的競(jìng)爭(zhēng)力測(cè)定結(jié)果表明，抗性突變菌株和敏感菌株等量混合培養(yǎng)中，抗性突變菌株的頻率在混合群體中逐漸下降，但培養(yǎng)7代后，仍然有30%的抗性突變菌株存在；混合比例在20∶80的處理培養(yǎng)7代后，只有2.47%的抗性突變菌株存在；混合比例在80∶20的處理中，抗性突變菌株的頻率在混合群體中變化趨勢(shì)是先上升后緩慢下降再上升，但變化幅度不大，培養(yǎng)7代后仍有85.69%的抗性突變菌株存在，表明抗性頻率基本保持穩(wěn)定（表8）。

2.5 己唑醇抗性突變菌株對(duì)4種三唑類(lèi)殺菌劑的交互抗性

己唑醇抗性突變菌株對(duì)丙環(huán)唑、氟硅唑、腈菌唑和戊唑醇的抗性水平分別為2.86、1.09、1.85和1.04，表明己唑醇抗性突變菌株對(duì)這4種藥劑未表現(xiàn)出交互抗性（表9）。

3 討論

南瓜白粉病是南瓜種植中發(fā)生和危害較重的病害之一，由于用藥頻繁，致使病原菌對(duì)藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗性，防效大幅度降低。因此對(duì)白粉病菌進(jìn)行抗藥性監(jiān)測(cè)和篩選更高效藥劑是一項(xiàng)長(zhǎng)期工作。在抗性試驗(yàn)中，建立敏感基線(xiàn)最為重要，是抗藥性鑒別和監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)。南瓜白粉病菌是專(zhuān)性寄生菌，無(wú)法離體培養(yǎng)，選擇合適的材料和方法最為重要，國(guó)外Bardin等[17]和Mcgrath等[18]采用固體培養(yǎng)基子葉葉盤(pán)法進(jìn)行抗性測(cè)定，國(guó)內(nèi)嚴(yán)紅等[19]采用子葉法監(jiān)測(cè)了北京地區(qū)瓜類(lèi)白粉病菌對(duì)三唑酮的抗性。為了明確蘭州市周邊地區(qū)南瓜白粉菌對(duì)己唑醇的敏感性現(xiàn)狀，分別采集、分離了19個(gè)南瓜白粉菌菌株，采用小株噴霧法測(cè)定了其對(duì)己唑醇的敏感性。結(jié)果表明19個(gè)白粉菌株對(duì)己唑醇表現(xiàn)為極敏感、敏感、低抗、中抗，EC50在17.77～285.54 μg/mL范圍內(nèi)。對(duì)敏感菌株采用三種方法進(jìn)行了抗藥性誘導(dǎo)，共獲得3株抗性突變菌株，其中藥劑馴化獲得的抗性突變菌株的抗性倍數(shù)最高，先紫外誘導(dǎo)后藥劑馴化的菌株抗性倍數(shù)最低，紫外誘導(dǎo)的菌株抗性倍數(shù)介于兩者之間，隨著誘導(dǎo)代數(shù)的增加，3種馴化方法誘導(dǎo)的菌株抗性倍數(shù)逐漸增大，其中藥劑馴化第7代的抗性倍數(shù)最大，為8.94，表現(xiàn)為低度抗性，這與在實(shí)驗(yàn)室采用離體葉片法連續(xù)兩次使用5%己唑醇微乳劑后產(chǎn)生低度抗性的結(jié)果相一致[13]。

敏感菌株、抗性突變菌株生物學(xué)特性測(cè)定表明其孢子萌發(fā)最佳時(shí)間分別為36 h和48 h；且抗性突變菌株的產(chǎn)孢量和致病力明顯高于敏感菌株，其適合度在孢子萌發(fā)率、芽管個(gè)數(shù)與敏感菌株的差異顯著；抗性突變菌株和敏感菌株之間的競(jìng)爭(zhēng)力測(cè)定表明，在培養(yǎng)7代后抗性突變菌株的頻率在80∶20混合群體比較穩(wěn)定，為85.69%， 在20∶80混合群體中（抗性菌株∶敏感菌株）不穩(wěn)定，只有2.47%的抗性突變菌株存在；這與楊連來(lái)等報(bào)道的研究結(jié)果一致[9]；實(shí)際生產(chǎn)中抗藥性能否產(chǎn)生與病原菌抗性突變體出現(xiàn)的頻率有關(guān)[20]，本試驗(yàn)也表明抗性突變菌株與敏感菌株的競(jìng)爭(zhēng)力可能與它們各自在病原菌群體中的比例有關(guān)，當(dāng)己唑醇抗性突變菌株在病原菌群體中占80%時(shí)，即使離開(kāi)藥劑的選擇壓力，它仍然保持較高頻率。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)禾谷類(lèi)作物白粉病菌Erysiphe graminis的抗藥性研究較多，結(jié)果均是由于病菌潛育期短、再侵染頻繁、流行速度快，同時(shí)，病原菌群體本身也具有很高的潛在適應(yīng)力，對(duì)殺菌劑產(chǎn)生了抗性，表現(xiàn)出對(duì)三唑類(lèi)殺菌劑的敏感性大幅度降低；另?yè)?jù)Collins等[21]對(duì)禾谷類(lèi)白粉病菌的研究發(fā)現(xiàn)，三唑類(lèi)殺菌劑品種之間存在交互抗性，而在本研究中，己唑醇誘導(dǎo)的抗性菌株對(duì)丙環(huán)唑、氟硅唑、腈菌唑和戊唑醇均未表現(xiàn)出交互抗性，表明在南瓜生產(chǎn)中只要科學(xué)合理地使用上述5種三唑類(lèi)殺菌劑不僅可以有效防治南瓜白粉病，同時(shí)還可延緩白粉菌抗藥性的產(chǎn)生，延長(zhǎng)三唑類(lèi)殺菌劑防治白粉病的使用壽命。

綜上所述，蘭州周邊不同地區(qū)19個(gè)南瓜白粉病菌株和SY2對(duì)己唑醇的敏感性存在一定差異，EC50值在17.77～285.54 μg/mL范圍內(nèi)；通過(guò)己唑醇誘導(dǎo)敏感菌株SY2 7代后，獲得了抗性突變菌株，抗性突變菌株產(chǎn)孢量和致病力明顯高于敏感菌株；適合度測(cè)定表明抗性突變菌株與敏感菌株之間存在競(jìng)爭(zhēng)力，兩者孢子萌發(fā)率、芽管個(gè)數(shù)差異顯著，而菌絲分支、產(chǎn)孢量差異不顯著；在抗性突變菌株和敏感菌株混合比例為80∶20的群體中，抗性菌株存在頻率比較穩(wěn)定，連續(xù)培養(yǎng)7代后仍占85.69%；己唑醇抗性菌株對(duì)丙環(huán)唑、氟硅唑、腈菌唑和戊唑醇4種藥劑未表現(xiàn)出交互抗性。

本試驗(yàn)采用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，僅對(duì)蘭州周邊的19個(gè)南瓜白粉病菌株及SY2對(duì)己唑醇的敏感性、抗性誘導(dǎo)方法和誘導(dǎo)獲得的抗性突變菌株生物學(xué)特性、己唑醇抗性突變菌株對(duì)4種三唑類(lèi)殺菌劑交互抗性進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)于其他地區(qū)南瓜白粉病菌對(duì)己唑醇的敏感性、田間抗藥性試驗(yàn)以及與其他農(nóng)藥交互抗性等問(wèn)題尚未涉及；另外三唑類(lèi)殺菌劑由于作用位點(diǎn)相同，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中極易產(chǎn)生交互抗性，但本試驗(yàn)中對(duì)己唑醇產(chǎn)生抗性的白粉菌并沒(méi)有對(duì)丙環(huán)唑、氟硅唑、腈菌唑和戊唑醇表現(xiàn)出抗性，有關(guān)這些問(wèn)題還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 王洪偉，徐亞琴.南瓜功能成分研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2004，20（4）：5557.

[2] 王鳴.南瓜屬—多樣性（Diversity）之最[J].中國(guó)西瓜甜瓜，2002（3）：4245.

[3] 梁巧蘭，徐秉良，顏惠霞，等.南瓜白粉病病原菌鑒定及寄主范圍測(cè)定[J].菌物學(xué)報(bào)，2010，29（5）：636643.

[4] 周威，李彩霞，王飛，等.白粉病菌入侵對(duì)不同抗性南瓜品種的病理和生理影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（6）：17111713.

[5] 中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書(shū)總編輯委員會(huì)蔬菜卷編輯委員會(huì)，中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書(shū)編輯部.中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書(shū)（蔬菜卷）[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1990：713.

[6] 呂佩珂，李明遠(yuǎn)，吳鉅文，等.中國(guó)蔬菜病蟲(chóng)原色圖譜[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1992：1718.

[7] 賈忠明，劉峰，慕衛(wèi)，等.黃瓜白粉病菌接種及對(duì)殺菌劑敏感性測(cè)定方法[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2006，33（1）：99103.

[8] 廖金海.南瓜白粉病的危害與防治技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2005（6）：4546.

[9] 楊連來(lái)，劉瑋瑋，劉躍群，等.黃瓜白粉病菌對(duì)己唑醇的敏感基線(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室抗性獲得[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2007，34（4）：431435.

[10]HUGGENBEGER F， COLLINS M A， SKYLAKAKIS G. Decreased sensitivity of Sphaerotheca fuliginea to fenarimol and other ergosterol biosynthesis inhibitor[J]. Crop Protection， 1984， 3 （2）： 137149.

[11]KENDALL S J. Crossresistance of triadimenol resistant fungal isolates to other sterol C14 demethy lation inhibitor fungicides [C]∥ Brighton Crop Protection Conferencepests & and Diseases， 1986： 539547.

[12]楊連來(lái)，慕衛(wèi)，劉峰，等.黃瓜白粉病菌對(duì)己唑醇抗性誘導(dǎo)及抗性菌株生物學(xué)性狀的研究[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，9（1）：2933.

[13]梁巧蘭，魏列新，徐秉良.裸仁美洲南瓜白粉病菌對(duì)幾種殺菌劑敏感性及抗藥性誘導(dǎo)[J].農(nóng)藥，2012，51（11）：840844.

[14]方中達(dá).植物病害研究法[M].第3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[15]慕立義.植物化學(xué)保護(hù)研究法[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1991.

[16]KUZUYAL M， HOSOYA K， YASHIRO K， et al. Powdery mildew （Sphaerotheca fuliginea） resistance in melon is selectable at the haploid level [J]. Journal of Experimental Botany， 2003， 54 （384）： 10691074.