張海龍，何云鳳，黨儒堯，陳 玥，李佩國(guó)，李蘊(yùn)玉

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島，066600)

雞呼吸道傳染病大多是由一種病原體單獨(dú)感染或多種病原體混合感染引起的，在寒冷的冬春季節(jié)最常發(fā)生，可危害所有日齡的雞，臨床表現(xiàn)為咳嗽，噴嚏等呼吸道癥狀，發(fā)病率和死亡率較高[1]，病程較長(zhǎng)，難于治愈，成為危害我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)較為嚴(yán)重的疾病[2]。在生產(chǎn)實(shí)踐中，當(dāng)雞群出現(xiàn)呼吸道癥狀后，往往不經(jīng)確診就大劑量使用抗生素、抗病毒藥，存在藥物品種、劑量和使用療程的盲目性，不僅增加了生產(chǎn)成本，還破壞了腸道正常菌群，產(chǎn)生耐藥菌株，甚至導(dǎo)致二重感染，給診斷和治療帶來一定的困難[3]。2020年11月17日，河北省秦皇島市撫寧區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的8 000只175日齡的海蘭褐蛋雞出現(xiàn)精神沉郁，采食量減少，咳嗽，氣喘，有啰音，每天死亡10余只，為了確定引起蛋雞呼吸道疾病的病原，進(jìn)行了病原檢查，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

1.1 病料來源

2020年11月17日，河北省秦皇島市撫寧區(qū)某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)場(chǎng)主攜帶病死雞來河北科技師范學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院就診，經(jīng)病理剖檢觀察后采集肝臟，脾臟，氣管等組織，備檢。

1.2 主要試劑與儀器

DNA，RNA提取試劑盒，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)于TIANGEN生物公司；腸桿菌科和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒(比色法)購(gòu)于bioMerieux,sa公司；DL2000 Marker，2×Taq Marker Mix 購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；TSB培養(yǎng)基，血瓊脂平板，TSA平板購(gòu)于北京奧星生物技術(shù)公司；胎牛血清購(gòu)于Gibco公司；藥敏紙片購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司。培養(yǎng)箱(IGS100)由美國(guó)熱電公司生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-ZFD)由南京貝登電子商務(wù)公司生產(chǎn)；核酸凝膠電泳儀槽(DYCP-31DN)與PCR儀(C1 000 TOUCH)由北京六一生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇36日齡健康的肉雜雞20只作為試驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)買于秦皇島市昌黎縣某養(yǎng)雞場(chǎng)。

1.4 細(xì)菌鑒定與藥敏檢測(cè)

1.4.1細(xì)菌分離與培養(yǎng) 將病死雞的肝臟組織劃線接種于血瓊脂平板，于37 ℃培養(yǎng)12～18 h，挑取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行涂片鏡檢，觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4.2細(xì)菌生化鑒定 按試劑盒說明書對(duì)分離的菌株進(jìn)行操作，用自動(dòng)生化鑒定儀進(jìn)行生化鑒定。

1.4.3細(xì)菌PCR鑒定 按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取，用16S rRNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，45 s；56 ℃，30 s；72 ℃，1 min；72 ℃，5 min，引物序列：16S rRNA-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16S rRNA-R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3’。反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL ，無RNA酶水6 μL。將PCR產(chǎn)物于10 g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，觀察結(jié)果并將陽性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析和遺傳進(jìn)化樹分析。

1.4.4致病性試驗(yàn) 將20只36日齡肉雜雞隨機(jī)分為2組，每組10只，試驗(yàn)組每只雞腹腔注射分離培養(yǎng)的菌液0.25 mL (CFU 108/mL)，對(duì)照組每只雞注射相同劑量的生理鹽水，觀察發(fā)病和死亡情況，對(duì)死亡的雞進(jìn)行剖檢，無菌取其肝臟、肺等組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定和鏡檢。

1.4.5藥敏試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS) 推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法對(duì)分離的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，將TSB培養(yǎng)基(含50 mL/L的胎牛血清)培養(yǎng)的菌液，用滅菌的棉簽涂布在平板上，用無菌鑷子取藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果并記錄。

1.5 病毒檢測(cè)

1.5.1雞新城疫病毒(NDV)和雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)PCR檢測(cè) 無菌采集病死雞的氣管、脾臟，勻漿破碎后12 000 r/min，離心5 min，取200 μL的上清液，按照RNA提取試劑盒提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，NDV反應(yīng)條件為95 ℃，3 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，45 s；72℃，7 min。IBV反應(yīng)條件為94 ℃，10 min；94 ℃，40 s；57 ℃，40 s；72 ℃，1 min；72 ℃，10 min。NDV與IBV的反應(yīng)體系為2×Taq PCR Master mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL ，無RNA酶水6 μL。引物序列NDV-F；5’-AAGGAGCCTTGATCTATCTGTCGG-3’，NDV-R：5’-TGTGCCCCTTCTCCAGCTTAGTA-3’。引物序列IBV-F：5’-GAGGATCCATGGCGAGCGGTAAAGTATCTGGAA-3’,IBV-R:5’-GCCTCGAGTCAAAGTTCATTTTCACCAAGTGCT-3’。取PCR產(chǎn)物各5 μL于10 g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行鑒定，觀察結(jié)果。

1.5.2雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)PCR檢測(cè) 無菌采集病死雞的喉頭氣管，勻漿破碎后離心取上清液200 μL，按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行樣品DNA的提取，以提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃，5 min；94 ℃，30 s；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s；72 ℃，10 min。反應(yīng)體系為2×Taq PCR Master mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，無RNA酶水6 μL,引物序列ILTV-F:5’-GAAGATCTAATTATAGCCCAGGCGTGCAACCG-3’，ILTV-R：5’-CCCTCGAGTTAAGGATCCACGTAACTACCAAGTTCCACCCCGGAG-3’。取適量的PCR產(chǎn)物于10 g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行鑒定，觀察結(jié)果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 臨床剖檢結(jié)果

剖檢結(jié)果顯示，患有雞呼吸道傳染病的雞脾臟腫大(圖1 A)，肝臟呈土黃色(圖1 B)，并有針尖大的出血點(diǎn)，腺胃乳頭水腫，乳頭上有出血點(diǎn)(圖1 C)，喉頭、氣管出血，伴有粘液和血凝塊(圖1 D)，卵泡變形，破裂，有黃色液體流入腹腔(圖1 E)。

2.2 細(xì)菌鑒定與藥敏檢測(cè)

2.2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)與鏡檢結(jié)果 采集病雞肝臟組織在血液瓊脂平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，結(jié)果顯示，長(zhǎng)出灰白色、圓形、濕潤(rùn)、大小均勻不溶血的露珠樣菌落(圖2 A)；涂片經(jīng)瑞氏染色可見陰性短桿狀，兩極濃染的藍(lán)色球桿狀菌，有莢膜(圖2 B)。

2.2.2細(xì)菌生化鑒定結(jié)果 分離的菌株能發(fā)酵葡萄糖、果糖、甘露醇，不發(fā)酵麥芽糖、鼠李糖，L天冬氨酸芳胺酶、精氨酸雙水解酶、尿素酶呈陰性；鳥氨酸脫羧酶、氧化酶為陽性，吲哚試驗(yàn)為陽性。經(jīng)自動(dòng)生化儀鑒定分析，結(jié)果為多殺性巴氏桿菌，命名為FN-Q菌株。

2.2.3FN-Q菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果 PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分離的2株FN-Q菌株在大約1 500 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖3)。

2.2.4FN-Q菌株的同源性及進(jìn)化樹分析 同源性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 FN-Q株的16S rRNA基因序列與Genbank中多殺性巴氏桿菌同源性達(dá)到99.5%以上(圖4)；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)N-Q株與MN022586.1參考株處于同一分支，親緣性最近，F(xiàn)N-Q株、MN022586.1和MH150894.1參考株形成一個(gè)獨(dú)立的分支；FN-Q株與MG597096.1處于不同的分支，親緣性關(guān)系最遠(yuǎn)，可能FN-Q株發(fā)生了變異(圖5)。

圖1 病雞的病理剖檢結(jié)果

圖3 分離菌株16S rRNA基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果M: DL2000 Marker；1，2：檢測(cè)樣品；3：陰性對(duì)照

圖4 FN-Q菌株同源性分析

圖5 FN-Q菌株系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2.5FN-Q菌株的致病性檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組雞的采食、飲水、排泄均正常。試驗(yàn)組雞只于攻菌后12 h開始發(fā)病，20只雞于24～36 h全部死亡。無菌采集死亡雞的肺臟、肝臟等組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，鑒定結(jié)果與2.2.1分離的菌株一致，說明該菌株有很強(qiáng)的致病性。

2.2.6FN-Q菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 FN-Q菌株對(duì)卡那霉素、恩諾沙星、頭孢曲松、丁胺卡那4種藥物有較強(qiáng)的敏感性，對(duì)頭孢拉定、氟苯尼考、環(huán)丙沙星3種藥物中敏，對(duì)磺胺間甲氧嘧啶、四環(huán)素、鏈霉素、新霉素、慶大霉素等7種藥物耐藥(表1)。

表1 FN-Q菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3 病毒PCR檢測(cè)結(jié)果

圖6 雞NDV PCR 檢測(cè)結(jié)果M: DL2000 Marker；1：陽性對(duì)照；2，3：檢測(cè)樣品；4: 陰性對(duì)照

2.3.1雞NDV PCR檢測(cè) 2份樣品PCR擴(kuò)增后，在280 bp處沒有出現(xiàn)與陽性對(duì)照片段大小一樣的目的基因(圖6)，說明組織樣品中不存在NDV感染。

2.3.2雞IBV PCR檢測(cè) 2份樣品PCR擴(kuò)增后均出現(xiàn)1 230 bp大小的目的基因片段，與陽性對(duì)照片段大小一致(圖7)，說明2份組織樣品中均存在IBV感染。

2.3.3雞ILTV PCR檢測(cè) 2份樣品PCR擴(kuò)增后均出現(xiàn)334 bp大小的目的基因片段，與陽性對(duì)照片段大小一致(圖8)，說明2份組織樣品中均存在ILTV感染。

圖7 雞IBV PCR 檢測(cè)結(jié)果 圖8 雞ILTV PCR 檢測(cè)結(jié)果 M: DL2000 Marker；1：陽性對(duì)照； M: DL2000 Marker；1：陽性對(duì)照； 2，3：檢測(cè)樣品；4: 陰性對(duì)照 2，3：檢測(cè)樣品；4: 陰性對(duì)照

3 討 論

呼吸道病是養(yǎng)雞場(chǎng)最常見的一類疾病[4]，引起雞呼吸道病的原因有兩類，即傳染性和非傳染性，傳染性病原包括細(xì)菌、病毒、支原體等，非傳染性包括環(huán)境與管理等因素。冬季是呼吸道疾病的高發(fā)季節(jié)，進(jìn)入冬季氣溫低下，氣候干燥，致病性微生物能較長(zhǎng)時(shí)間存活，以及雞舍通風(fēng)與保溫之間矛盾突出，有害氣體增加，如果不注重改善飼養(yǎng)環(huán)境，飼養(yǎng)密度過大，消毒不規(guī)范，免疫程序不合理，極易引起呼吸道疾病的發(fā)生[5]。本次試驗(yàn)通過對(duì)病死雞剖檢病理觀察和病原檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致該場(chǎng)雞死亡的原因?yàn)镮LTV，IBV和多殺性巴氏桿菌混合感染。近幾年，雞呼吸道病原體多重交叉感染的現(xiàn)象逐年增多，所造成的經(jīng)濟(jì)損失在大部分雞群中占全部疾病的50%以上。其中，雞傳染性喉氣管炎是由ILTV引起的一種急性、接觸性上部呼吸道傳染病，其特征是呼吸困難、咳嗽和咳出含有血樣的滲出物，典型病變?cè)跉夤芎秃聿拷M織[6～8]，目前因用于預(yù)防傳染性喉氣管炎感染的減毒疫苗的毒力偏強(qiáng)，免疫后可能形成潛伏感染，導(dǎo)致該病防治困難。

雞傳染性支氣管炎是由雞IBV引起的一種急性、高度傳染性的呼吸道疾病[9]，IBV的血清型眾多，根據(jù)血清型的不同，雞感染后出現(xiàn)的癥狀也各不相同，除侵害呼吸系統(tǒng)外，還導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的損傷。雞群在雛雞階段感染IBV后，到了產(chǎn)蛋期易出現(xiàn)“假母雞”，雞群產(chǎn)蛋率較低[10, 11]，維持在70%～80%左右[12]。產(chǎn)蛋期感染IBV后，產(chǎn)蛋率下降約10個(gè)百分點(diǎn)，蛋殼質(zhì)量變差，嚴(yán)重影響雞群的生產(chǎn)性能。免疫接種是防控傳染性支氣管炎的主要手段，但在生產(chǎn)實(shí)踐中即使免疫后也時(shí)常會(huì)有發(fā)病現(xiàn)象，主要是因?yàn)椴煌逍投局甑慕徊姹Ｗo(hù)作用較差，當(dāng)疫苗毒株與當(dāng)前流行毒株不一致時(shí)，不能產(chǎn)生針對(duì)流行毒株的特異性抗體，從而導(dǎo)致雞群發(fā)病。

禽巴氏桿菌病，又稱禽霍亂，是由多殺性巴氏桿菌引起的一種急性敗血性傳染病，最急性型常見不到明顯變化[13]，發(fā)病率和致死率很高。多殺性巴氏桿菌是一種條件性病原菌，當(dāng)飼養(yǎng)管理不當(dāng)，天氣突然變化，機(jī)體抵抗力下降或感染其他疾病時(shí)，均可誘發(fā)該病。目前，接種菌苗和使用抗生素仍是臨床上防治禽巴氏桿菌病的首選。但巴氏桿菌疫苗存在有效期短、毒力反強(qiáng)，成本高等問題；抗生素的頻繁使用導(dǎo)致耐藥性和藥殘問題也亟待解決。姜海清[14]研究表明，分離的禽霍亂菌株對(duì)氨芐西林和土霉素耐藥，常超越等[15]研究發(fā)現(xiàn)，禽巴氏桿菌菌株QHP-1株對(duì)阿莫西林、氨芐西林、四環(huán)素等5種抗生素耐藥；本次試驗(yàn)從病死雞肝、脾等組織分離的FN-Q菌株對(duì)四環(huán)素、鏈霉素、新霉素、氨芐西林、慶大霉素等7種藥物耐藥，其耐藥種類呈上升趨勢(shì)，且該菌株有較強(qiáng)的致病性，這可能與用藥習(xí)慣以及盲目長(zhǎng)期使用某種抗菌藥物有關(guān)。綜上所述，對(duì)于雞呼吸道疾病的防控，首先要制定科學(xué)的飼養(yǎng)管理方案，保持雞舍舒適的溫度、濕度和清潔的環(huán)境，確保適當(dāng)?shù)耐L(fēng)。制定日常巡查制度并做好記錄，做到早發(fā)現(xiàn)、早處理。在免疫方面制定合理的免疫程序，選擇與流行株一致的疫苗株，并定期監(jiān)測(cè)免疫抗體水平，投藥前最好進(jìn)行敏感藥物的檢測(cè)，做到科學(xué)精準(zhǔn)防治。