郝 艷，安明燕，張岱琳，張立彬，肖 嘯，武軍凱

(河北科技師范學院園藝科技學院，河北 秦皇島，066600)

我國桃[Prunuspersica(L.) Batsch]品種育種資源較為豐富，種植面積廣泛，為解決花期不遇和異地雜交問題，在桃育種上多選用人工授粉或雜交授粉。桃花粉的壽命很短，一旦離開植株后在自然環(huán)境中存活時間短[1]。因此，如何保存花粉成為許多研究者關注的焦點。對水稻、玉米、大豆、白杏、蘋果和軟棗獼猴桃[2～7]研究發(fā)現(xiàn)，高溫貯藏會使花粉萌發(fā)率顯著下降，并且可能會出現(xiàn)畸形花粉[8]。對花粉進行低溫或超低溫保存，不僅可以解決不同花期的授粉問題，便于不同地區(qū)種質資源交換，對遺傳育種具有重要意義。筆者選用久脆和久紅等2個桃品種花粉，對不同貯藏溫度下的花粉萌發(fā)率進行試驗，以期篩選出最佳的桃花粉貯藏條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以昌黎縣石橋營桃園內(nèi)的久脆、久紅等2個品種為試驗材料。取大蕾期的完整花朵50朵，剝落花藥，取合格的花藥放入裝有石臘紙的培養(yǎng)皿，于室內(nèi)晾制。待完全散粉后，收集花粉，作為花粉貯藏試驗的材料。在花藥選取過程中，每個品種選取30枚花藥作為花粉量測定的試驗樣本。將收集的每個品種的桃花粉分別加入到4個2 mL的離心管內(nèi)密封貯藏。設置4個處理：-80 ℃，-20 ℃，4 ℃，室溫。各處理條件下的花粉間隔0，10，20，30，180 d進行花粉萌發(fā)率測定。

1.2 試驗方法

1.2.1花粉萌發(fā)率和花粉管長度的測定 本次試驗對兩個桃品種進行花粉萌發(fā)率的測定采用離體萌發(fā)法。配置固體培養(yǎng)基(配方為8 g·L-1瓊脂+50 mg·L-1硼酸+200 g·L-1蔗糖)，待固體培養(yǎng)基冷凝后，在超凈工作臺上用不同的牙簽分別蘸取-80 ℃，-20 ℃，4 ℃，室溫等4個溫度下貯藏的花粉，并在培養(yǎng)基上方輕輕抖動牙簽，使蘸取的花粉均勻的鋪在培養(yǎng)基表面，做好標記。將培養(yǎng)皿放置到25 ℃的培養(yǎng)箱中，分別于30，60，90，120，180 min后觀察花粉的萌發(fā)情況。對每個離體培養(yǎng)的花粉培養(yǎng)基用倒置顯微鏡進行觀察，分別選取3個區(qū)域(選取標準為該區(qū)域的花粉粒不少于20粒)進行觀察，記錄每個區(qū)域內(nèi)的花粉粒萌發(fā)數(shù)(判定標準為花粉管長度超過花粉粒直徑的1/2)和總數(shù)。用測微尺測量長度來統(tǒng)計每個品種花粉管的平均長度，以此觀察花粉萌發(fā)和花粉管伸長的情況。

1.2.2花粉量的測定 本次試驗對2個不同桃品種花粉量的測定采用計數(shù)板計數(shù)法。每個品種選取30枚花藥放到無菌的10 mL離心管底部。將離心管置于50 ℃的烘箱中烘干，至每個花藥開裂，花粉完全散出。加入20%的六偏磷酸鈉溶液，定容到6 mL充分混勻，移液器吸取2 μL的懸浮液滴在血細胞計數(shù)板上。用顯微鏡(10×40倍)對每個處理隨機選取3個視野進行花粉量的計數(shù)，3次重復，計算平均值。

花粉量=(80個小格內(nèi)的花粉數(shù)/80)×血細胞計數(shù)板小格總個數(shù)×稀釋倍數(shù)×10 000

1.2.3花粉活力的測定 本次試驗對2個桃品種當天采集花粉進行花粉活力的測定采用FDA染色法。配制FDA-buffer：1 μL FDA母液+1 mL BK bufferS15MOPS pH 7.5。用體積分數(shù)75%酒精清洗載玻片，然后滴1滴配置好的FDA-buffer，加花粉到液滴中，蓋上蓋玻片，室溫靜置5 min。在藍光光學顯微鏡(100倍)下觀察花粉活力，若發(fā)出熒光則表示花粉有活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本次試驗通過Excel和GraphPad軟件進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和處理。

2 結果與分析

2.1 久紅、久脆桃品種的單花藥花粉量統(tǒng)計分析

對久紅、久脆等2個桃品種進行花粉量測定。統(tǒng)計結果顯示，久紅和久脆等2品種花粉量接近，久紅平均單花藥花粉量為2 813個，久脆為2 696個，均在2 532～2 930之間。

2.2 不同貯藏條件對久紅、久脆桃花粉萌發(fā)率的影響

在不同貯藏溫度條件下，久紅和久脆花粉的萌發(fā)率隨著貯藏時間的延長均呈下降趨勢(圖1)。久紅花粉在室溫條件下貯藏10 d時，其萌發(fā)率較其他3個貯藏溫度條件下的萌發(fā)率下降顯著，由最初的82%下降到51%；貯藏10～30 d時，其花粉萌發(fā)率下降趨勢則表現(xiàn)緩和，由51%下降到37%。貯藏180 d時，各貯藏溫度下的花粉萌發(fā)率均明顯下降至幾乎為0。然而，在4 ℃條件下貯藏10 d時，久脆的花粉萌發(fā)率出現(xiàn)明顯下降，由最初的84%下降到64%；貯藏10～20 d時，花粉萌發(fā)率變化不明顯；貯藏20～30 d時，花粉萌發(fā)率再次出現(xiàn)明顯下降，由67%下降至33%。與此同時，在室溫條件下貯藏的久脆花粉，在貯藏10 d時花粉萌發(fā)率也出現(xiàn)明顯下降，由最初的82%下降到42%；貯藏10～20 d時花粉萌發(fā)率變化趨勢緩和；貯藏20～30 d時花粉萌發(fā)率顯著下降，由48%下降到25%。貯藏180 d時各貯藏溫度下的花粉萌發(fā)率均明顯下降至近乎為0(圖1)。

注：A：久紅；B：久脆圖1 不同貯藏條件對久紅、久脆桃花粉萌發(fā)率的影響

2.3 不同貯藏條件對久紅、久脆桃花粉管長度的影響

久紅和久脆的花粉在培養(yǎng)時間為30，60，90，120，180 min時，花粉管長度逐漸增長，在培養(yǎng)180 min時，花粉管達到最長。新采集花粉管長度在5 865～6 546 μm范圍內(nèi)。貯藏時間在20 d時，久紅和久脆花粉管長度均可以保持在3 368～5 658 μm范圍內(nèi)，但不同貯藏溫度條件下的花粉管長度具有顯著差異，室溫貯藏和-80 ℃貯藏條件下的花粉管長度最多相差1 579 μm。貯藏30 d時，花粉管長度明顯下降到693～1 266 μm(圖2和圖3)，在-80 ℃，-20 ℃，4 ℃，室溫各貯藏溫度條件下，花粉管的長度隨著花粉貯藏時間的延長總體下降，由0 d時的5 865～6 546 μm下降到180 d時的0 μm(圖4)。

2.4 久紅、久脆桃花粉生活力的最佳貯藏條件分析

久紅和久脆花粉貯藏時間為20 d以內(nèi)，在-80 ℃，-20 ℃，4 ℃，室溫等貯藏條件下，花粉的萌發(fā)率均在42.4%以上(表1)。其中，在-80 ℃下貯藏的花粉萌發(fā)率最高，在68.6% 以上?；ǚ酃荛L度均在3 368 μm以上。而貯藏30 d時，久紅花粉在室溫條件下貯藏萌發(fā)率最低，為34.2%；而久脆花粉在室溫條件下貯藏萌發(fā)率最低，為25.0%。二者花粉管生長長度下降到693～1 266 μm。當花粉貯藏180 d時，花粉萌發(fā)率降到較低水平，最高萌發(fā)率僅有4.4%，而花粉管長度也下降到80 μm以下。基于此，筆者認為貯藏30 d時久紅和久脆花粉能夠較好的維持花粉萌發(fā)率且貯藏溫度越低維持效果越好。

2.5 久紅、久脆桃花粉活力FDA染色

為了驗證花粉活力，對久紅和久脆的花粉粒進行了FDA染色。具有活力的花粉能被醋酸熒光素(FDA)染色，可在顯微鏡下觀察到熒光色，試驗結果顯示，久脆和久紅的花粉粒均觀察到了明顯熒光色(圖5)，說明久紅和久脆的花粉是可育的。

圖2 不同貯藏溫度和培養(yǎng)時間對久紅花粉管長度的影響

圖3 不同貯藏溫度和培養(yǎng)時間對久脆花粉管長度的影響

注：A，久紅；B，久脆圖4 不同貯藏條件對久紅、久脆桃花粉管長度的影響

表1 不同貯藏條件下2種桃花粉相關數(shù)據(jù)匯總

注：A，久脆；B，久紅圖5 久脆和久紅桃花粉育性觀察

3 結論與討論

桃花粉量和萌發(fā)率研究對于桃授粉與育種有重要意義。影響桃花粉量、萌發(fā)率以及育性的因素有很多，主要包括品種、環(huán)境、氣候、溫度和貯藏時間等。徐坤[8]對梨花粉、蘭旭等[2]對水稻花粉、陳康玉等[5]對香白杏花粉、李仁浩等[7]對軟棗獼猴桃花粉均進行了相關研究。結果表明，不同種類的植物花粉量和花粉萌發(fā)率差異較大，這與遺傳基因不同有密切關系。本次試驗主要對久紅、久脆等2個桃品種的花粉量和萌發(fā)率進行了重點研究，并測定了在不同貯藏時間和貯藏溫度下花粉管長度和萌發(fā)率的變化情況。結果顯示，久紅和久脆花粉量接近，在2 532～2 930范圍內(nèi)，最大值2 930個，低于六灶特晚、大觀3號、黃水蜜、離核蟠等幾個品種的花粉量[9]，這可能是由于品種的遺傳特性所致，同時可能與不同日照時間，以及土壤環(huán)境密切相關。本次試驗結果表明，久脆和久紅花粉萌發(fā)率隨著貯藏時間的延長整體呈下降趨勢，這與郭瑞等[10]在其他桃品種上以及張慶等[11]在牡丹上的研究結果一致。而蔡堅等[12]在油茶花粉貯藏條件的研究中顯示，油茶花粉在-20 ℃條件下貯藏0～150 d花粉萌發(fā)率無明顯變化，150 d時萌發(fā)率仍保持在55% 以上，而本次試驗結果顯示久脆和久紅的花粉在-20 ℃條件下貯藏，隨著貯藏時間的延長花粉萌發(fā)率逐漸下降，貯藏180 d時萌發(fā)率基本降為0，這表明不同物種之間花粉萌發(fā)率存在顯著差異。與此同時，在相同萌發(fā)時間內(nèi)，花粉管的長度也隨著貯藏時間的延長而逐漸減小。久紅花粉在室溫貯藏10～20 d時，花粉管長度明顯下降，而在其他貯藏溫度下貯藏20 d之后，花粉管長度出現(xiàn)顯著下降；久脆花粉貯藏20 d之后花粉管長度也顯著下降。

低溫貯藏有利于大多數(shù)植物花粉萌發(fā)率的保持，且在干燥條件下，溫度越低貯藏時間越長[13]。本次試驗結果顯示，在-80 ℃，-20 ℃，4 ℃和室溫等4個溫度下貯藏的花粉，隨著貯藏時間的延長溫度越低花粉萌發(fā)率下降越慢。曲柏宏等[14]對梨花粉進行低溫保存并進行授粉試驗，結果表明，冷凍條件下貯藏1年的花粉座果率與對照無顯著差異,授粉能力很強；而冷藏條件下貯藏1年的花粉座果率均顯著低于對照，但也有一定的授粉能力。本次試驗未對貯藏后的花粉進行授粉試驗，不同貯藏條件下貯藏的桃花粉是否具有授粉結實能力還有待進一步研究。