蘭淑慧，溫曉蕾,3，馮麗娜，霍佳歡何新月，孫偉明*，齊慧霞*

(1 板栗產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，河北 秦皇島，066004；2 河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，河北省特色園藝種質(zhì)挖掘與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院)

隨著板栗(CastaneamollissimaBlume)產(chǎn)量的提高，板栗貯藏期的病害逐年加重[1]。其中，栗實(shí)腐爛病危害日漸凸顯，果實(shí)腐爛率最高達(dá)到40%～50%[2]，嚴(yán)重威脅著板栗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。關(guān)于栗實(shí)貯藏期腐爛病發(fā)生原因的研究較多，普遍認(rèn)為是由致病微生物侵染引起，常見的致腐微生物有鏈格孢屬(Alternariaalternata)、聚端孢屬(Trichotheciumsp.)、殼梭孢屬(Fusicoccumsp.)、小穴殼屬(Dothiorellasp. )、絲核菌屬(Rhizoctoniasp.)、青霉菌屬(Penicilliumsp.)、鐮孢菌屬(Fusariumsp.)等[3～6]。其中，青霉菌屬廣泛分布于我國南北各產(chǎn)區(qū)腐爛栗實(shí)中[6]，小刺青霉、擴(kuò)展青霉等均已報(bào)道能夠侵染板栗果實(shí)[7，8]，但關(guān)于草酸青霉致病力的研究相對較少，相關(guān)報(bào)道主要圍繞草酸青霉在纖維素降解、發(fā)酵生產(chǎn)、生物防治等方面的應(yīng)用效果而展開[9，10]。筆者對引起栗果腐爛的草酸青霉菌的最適生長條件進(jìn)行了室內(nèi)試驗(yàn)，以期明確環(huán)境因子對菌絲生長及產(chǎn)孢的影響，為板栗采后貯藏及相關(guān)病害防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2019～2020年在河北科技師范學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

栗果草酸青霉(Penicilliumoxalate)由河北科技師范學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1,葡萄糖20 g·L-1,瓊脂20 g·L-1,自然pH，蒸餾水1 000 mL。

察氏培養(yǎng)基：NaNO33 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1，KCl 0.5 g·L-1，F(xiàn)eSO40.01 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1不同培養(yǎng)基對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 選用燕麥馬鈴薯培養(yǎng)基[11]、綠豆培養(yǎng)基[12]、玉米汁培養(yǎng)基[13]、板栗培養(yǎng)基[14]、胡蘿卜培養(yǎng)基[15]、肉汁胨培養(yǎng)基[16]、沙堡弱培養(yǎng)基[17]共7種，即7個處理。用5 mm的打孔器從菌落邊緣取菌餅，將菌餅放置于培平板的中央位置，做好標(biāo)記，每個處理3次重復(fù)，置于25 ℃恒溫全黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用十字交叉法連續(xù)測定10 d菌落直徑。同樣方法培養(yǎng)7 d后，使用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下測定菌落產(chǎn)孢的情況。

1.2.2不同溫度對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 將直徑5 mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中，設(shè)置溫度從5 ℃開始，每5 ℃為一個溫度梯度，35 ℃為試驗(yàn)終止溫度，共計(jì)7個溫度梯度，每個處理3次重復(fù)。培養(yǎng)及測定方法同1.2.1。

1.2.3不同光照對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 將直徑5 mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基，將培養(yǎng)箱分別設(shè)置全光照、全黑暗和光暗交替共3個處理，25 ℃恒溫培養(yǎng)，每個處理3次重復(fù)。菌落直徑的測量和產(chǎn)孢量的測定方法同1.2.1。

1.2.4不同pH對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)節(jié)至5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0和11.0共計(jì)7個處理，將直徑5 mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中，每個處理3次重復(fù)，培養(yǎng)及測定方法同1.2.1。

1.2.5不同氮源對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以相同含氮量的NH4Cl,牛肉膏，(NH4)2SO4，蛋白胨，酵母浸粉和KNO3置換其中的NaNO3制成7種不同的培養(yǎng)基，接種直徑為5 mm的菌種，每個處理3次重復(fù)，培養(yǎng)及測定方法同1.2.1。

1.2.6不同碳源對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以相同含碳量的麥芽糖、果糖、乳糖、木糖醇、葡萄糖、可溶性淀粉置換其中的蔗糖，制成7種不同的培養(yǎng)基，接種直徑為5 mm的菌種，每個處理3次重復(fù)，培養(yǎng)及測定方法同1.2.1。

1.2.7通氣狀況對菌絲干質(zhì)量的影響 以PDA液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將純化后的菌種用直徑5 mm的打孔器在菌落的邊緣打成菌餅在超凈工作臺中移入250 mL的錐形瓶中，每個錐形瓶分裝100 mL培養(yǎng)基。搖床分別設(shè)置為連續(xù)震蕩、完全靜止、間歇震蕩(12 h震蕩+12 h靜止)共計(jì)3個處理，每個處理3次重復(fù)，培養(yǎng)5 d后用烘干箱烘干至恒質(zhì)量，測定菌絲干質(zhì)量。

表1 培養(yǎng)基對草酸青霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

栗果草酸青霉菌在7種培養(yǎng)基上均可生長和產(chǎn)孢(表1)，在燕麥馬鈴薯培養(yǎng)基上菌絲生長最快且產(chǎn)孢最多，10 d菌落直徑為8.50 cm(圖1)，7 d產(chǎn)孢量達(dá)到了4.93×107個/皿；板栗培養(yǎng)基及胡蘿卜培養(yǎng)基對菌絲生長的影響無明顯差異；胡蘿卜培養(yǎng)基及沙堡弱培養(yǎng)基對產(chǎn)孢量的影響無明顯差異；菌絲在沙堡弱培養(yǎng)基中生長緩慢，平均菌落直徑為3.45 cm，在板栗培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢數(shù)量最少，為0.4×107個/皿。

注：A，板栗培養(yǎng)基； B，胡蘿卜培養(yǎng)基； C，綠豆培養(yǎng)基； D，肉汁胨培養(yǎng)基； E，沙堡弱培養(yǎng)基； F，燕麥+馬鈴薯培養(yǎng)基； G，玉米汁培養(yǎng)基圖1 不同培養(yǎng)基對草酸青霉菌菌絲生長的影響

2.2 溫度對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

栗果草酸青霉菌在5～35 ℃均可生長(表2)。30 ℃時板栗草酸青霉菌菌絲生長最快產(chǎn)孢量最多，10 d菌落直徑為4.28 cm，7 d時的產(chǎn)孢量為3.03×107個/皿；產(chǎn)孢量在25，30 ℃培養(yǎng)時無明顯差異，在20，35 ℃培養(yǎng)時產(chǎn)孢量無明顯差異；菌絲在5 ℃時菌落生長最慢，10 d菌落直徑為0.97 cm，7 d產(chǎn)孢量最少，為0.40×107個/皿。

2.3 光照對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

栗果草酸青霉菌在3種光照條件下均可生長和產(chǎn)孢(表3)。在全黑暗條件有利于菌絲生長及產(chǎn)孢，10 d菌落直徑達(dá)到了3.0 cm(圖2)，7 d時產(chǎn)孢量5.50×107個/皿；菌絲在全光照條件下生長最慢，光暗交替時產(chǎn)孢最少；菌絲生長及產(chǎn)孢量在各處理間均存在顯著差異。

2.4 pH對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

栗果草酸青霉菌在pH 5.0～11.0時均可生長產(chǎn)孢(表4)。菌絲生長的最適pH為7.0，10 d時菌落直徑為5.98 cm(圖3)；最適產(chǎn)孢的pH為8.0，7 d時產(chǎn)孢量為3.83×107個/皿；菌絲在pH為8.0和9.0的培養(yǎng)基上生長時無顯著差異；pH為5.0，9.0的培養(yǎng)基對產(chǎn)孢量的影響無顯著差異；pH為11.0時不利于菌絲生長及產(chǎn)孢。

表3 光照對草酸青霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

注：A，全黑暗；B，光暗交替；C，全光照圖2 光照對草酸青霉菌菌絲生長的影響

表2 溫度對草酸青霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

表4 pH對草酸青霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

注：A，pH 5.0; B，pH 6.0; C，pH 7.0; D，pH 8.0; E，pH 9.0; F，pH 10.0; G，pH 11.0圖3 pH對草酸青霉菌絲生長的影響

2.5 不同氮源對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

表5 不同氮源對草酸青霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

在7種氮源中，板栗草酸青霉對牛肉膏及酵母浸粉的利用率最高(表5)，以牛肉膏為基礎(chǔ)氮源的培養(yǎng)基最適宜菌絲生長，10 d時菌落直徑為8.50 cm(圖4)；以酵母浸粉為基礎(chǔ)氮源的培養(yǎng)基最適宜產(chǎn)孢，7 d時的產(chǎn)孢量為2.30×107個/皿；菌絲在以NH4Cl和(NH4)2SO4為氮源的培養(yǎng)基上生長情況無顯著差異；在牛肉膏及蛋白胨為氮源的兩培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量無顯著差異；7種氮源中，NH4Cl為氮源最不利于菌絲生長，(NH4)2SO4為氮源最不利于產(chǎn)孢。

注：A，蛋白胨；B，酵母浸粉；C，(NH4)2SO4；D，NH4Cl；E，牛肉膏；F，KNO3；G，NaNO3圖4 不同氮源對草酸青霉菌菌絲生長的影響

表6 不同碳源對草酸青霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

2.6 不同碳源對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

栗果草酸青霉菌在7種不同碳源的培養(yǎng)基上均可生長產(chǎn)孢(表6)。以可溶性淀粉為基礎(chǔ)碳源的培養(yǎng)基最適宜菌絲生長且產(chǎn)孢量最多，10 d時菌落直徑為6.15 cm(圖5)，7 d時產(chǎn)孢量為3.35×107個/皿；以乳糖為基礎(chǔ)碳源的培養(yǎng)基最不利于菌絲生長；以果糖為基礎(chǔ)碳源的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最少。

注：A，可溶性淀粉;B，麥芽糖;C，果糖;D，木糖醇;E，乳糖;F，蔗糖;G，葡萄糖圖5 不同碳源對草酸青霉菌菌絲生長的影響

圖6 各處理菌絲干質(zhì)量5%顯著水平差異分析

2.7 通氣狀況對菌絲干質(zhì)量的影響

不同通氣狀況對栗果草酸青霉菌菌絲干質(zhì)量影響較大，在間歇震蕩下菌絲干質(zhì)量最大，為0.35 g；連續(xù)震蕩下菌絲干質(zhì)量次之；完全靜止下菌絲干質(zhì)量為最低值0.13 g(圖6)。

3 結(jié)論與討論

本次試驗(yàn)結(jié)合菌絲生長量及產(chǎn)孢量2個標(biāo)準(zhǔn)來衡量草酸青霉菌適宜的培養(yǎng)條件。試驗(yàn)結(jié)果表明：板栗草酸青霉菌菌絲生長及產(chǎn)孢最適宜的培養(yǎng)基為燕麥馬鈴薯培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度為30 ℃時最有利于菌絲生長及產(chǎn)孢，與杜奕君等[18]得出的草酸青霉最適宜的產(chǎn)孢溫度為30 ℃的結(jié)果一致；全黑暗時最有利于菌絲生長及產(chǎn)孢，說明黑暗刺激有利于草酸青霉菌絲生長及產(chǎn)孢；12 h震蕩+12 h靜止循環(huán)培養(yǎng)條件最有利于草酸青霉菌絲生長，培養(yǎng)5 d后菌落干質(zhì)量達(dá)0.35 g；最適宜草酸青霉菌菌絲生長的pH為7.0，與王俊鳳等[7]所得出的小刺青霉菌最適宜pH為7的結(jié)論一致，說明草酸青霉及小刺青霉對酸堿環(huán)境要求一致。

氮源對草酸青霉菌菌絲生長影響較大，最有利于菌絲生長的氮源為牛肉膏，與郜海燕等[19]及丁仁惠等[20]有利于波蘭青霉、擴(kuò)展青霉、指狀青霉及意大利青霉菌絲生長的氮源為蛋白胨的結(jié)論有所不同；以可溶性淀粉為基礎(chǔ)碳源的培養(yǎng)基同時適合草酸青霉菌菌絲生長及產(chǎn)孢，與郜海燕等[19]最適合擴(kuò)展青霉菌絲生長的碳源為可溶性淀粉的結(jié)論一致，說明擴(kuò)展青霉與草酸青霉對碳源的要求一致。與王俊鳳等[7]所得出最適宜菌絲生長和產(chǎn)孢的碳源分別為可溶性淀粉和甘露醇的結(jié)論有所不同。本次研究明確了板栗草酸青霉菌對環(huán)境和營養(yǎng)條件的需求，但其防控技術(shù)還需進(jìn)一步研究。