趙惠媛，郝文文，耿立英，張傳生，李祥龍

(河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北省特色動(dòng)物種質(zhì)資源挖掘與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島，066004)

禽類作為一種色敏性動(dòng)物，對(duì)于不同波長(zhǎng)光的辨色力極強(qiáng)，繼而影響其生長(zhǎng)發(fā)育、生產(chǎn)性能、免疫功能等[1]。郝文文等[2]研究發(fā)現(xiàn)，孵化期使用適宜綠光照明可以促進(jìn)雞胚肌纖維發(fā)育；譚子超等[3]研究發(fā)現(xiàn)，以綠光LED為光源間歇照明可提高肉雞生長(zhǎng)性能，毛雞出欄的經(jīng)濟(jì)效益最高；謝電等[4]在研究中使用15 lx的綠光照明生長(zhǎng)早期(0～6 d)雛雞，通過對(duì)小腸各段絨毛高度、粘膜厚度及杯狀細(xì)胞數(shù)量等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該條件下綠光照可在一定程度上改善肉雞小腸黏膜結(jié)構(gòu)，繼而提高小腸消化吸收能力，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育；李然等[5]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光在產(chǎn)蛋高峰期及后期可顯著提高海蘭褐蛋雞脾臟細(xì)胞免疫功能；段龍等[6]研究發(fā)現(xiàn)，間歇光照可顯著提高肉仔雞(14～42 d)的脾臟和法氏囊指數(shù)。除了作為一種消化器官，小腸還具有免疫功能，其粘膜層中的淋巴細(xì)胞可對(duì)腸道中的病原體發(fā)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，屬于腸道相關(guān)淋巴組織中的重要成員[7]。作為腸道免疫系統(tǒng)的重要組成部分，腸道相關(guān)淋巴組織還包括法氏囊、腸道淋巴結(jié)、盲腸扁桃體、幽門扁桃體[8]等免疫器官，其中法氏囊是禽類所特有的中樞免疫器官，是B淋巴細(xì)胞發(fā)育分化的場(chǎng)所，多能干細(xì)胞于雞胚孵化發(fā)育的第8～18天來到法氏囊[9]，在激素作用下形成具有免疫活性的B淋巴細(xì)胞，以淋巴濾泡的形式存在。禽類作為一種經(jīng)濟(jì)型動(dòng)物，提高其消化能力、增強(qiáng)免疫功能，可顯著改善其生產(chǎn)性能，繼而帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益。壩上長(zhǎng)尾雞生存于壩上高寒環(huán)境中的特殊性，造就了其抗寒力強(qiáng)、耐粗飼的優(yōu)良特性[10]，然而其生產(chǎn)性能較低、產(chǎn)肉率低限制了其在養(yǎng)殖領(lǐng)域中的發(fā)展，在孵化階段雞消化系統(tǒng)的早期發(fā)育對(duì)于實(shí)現(xiàn)出殼后雛雞的體質(zhì)量增長(zhǎng)發(fā)育尤為關(guān)鍵，而與之相關(guān)的腸道相關(guān)淋巴組織作為機(jī)體免疫的第一道屏障，可有效抵御病原體的侵襲，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。因此，筆者以壩上長(zhǎng)尾雞為研究對(duì)象，研究不同強(qiáng)度的LED綠光照明對(duì)孵化期小腸及法氏囊發(fā)育的影響，為在生產(chǎn)實(shí)踐中合理改良?jí)紊祥L(zhǎng)尾雞種蛋孵化條件提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所需120枚質(zhì)量相近的壩上長(zhǎng)尾雞種蛋購自張家口市綠色田園禽業(yè)科技有限公司，孵化前對(duì)其進(jìn)行消毒、編號(hào)、稱質(zhì)量。

試驗(yàn)所需的甲醛溶液、無水乙醇、二甲苯、蘇木素染液、伊紅染液、鹽酸、石蠟及中性樹脂等均購自石家莊豐悅科技有限公司。

奧林巴斯BX-40倒置顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司(中國)。NLF-320型微電腦全自動(dòng)孵化器購自山東農(nóng)科孵化設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取重量相近的壩上長(zhǎng)尾雞種蛋120枚，隨機(jī)分成4組，分別為弱光組(30～80 lx綠光)，中光組(90～140 lx綠光)，強(qiáng)光組(150～200 lx綠光)，黑暗組。孵化條件:1～6 d溫度38.0 ℃，濕度60%；7～18 d溫度37.8 ℃，濕度55%；19～20 d溫度37.2 ℃，濕度65%。各光照組種蛋分別于孵化的10～18 d給予12 h光照-12 h黑暗的照明，光源波長(zhǎng)為525 nm±10 nm。各組分別于16，18，20日胚齡時(shí)收集6枚種蛋，二氧化碳法處死雞胚后，取小腸各段(十二指腸、空腸、回腸)和法氏囊，置于1.44 mol/L甲醛中固定24 h，以備待測(cè)試驗(yàn)。

1.2.2石蠟切片 本試驗(yàn)對(duì)不同組別的雞胚十二指腸、空腸、回腸及法氏囊進(jìn)行了組織石蠟切片并染色，以觀察不同組別雞胚各器官的顯微結(jié)構(gòu)。石蠟切片步驟如下：

①分別將各組不同胚齡的雞胚十二指腸、空腸、回腸及法氏囊用1.44 mol/L甲醛溶液固定24 h。

②梯度脫水(順序及時(shí)間為50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的乙醇1 h，70%乙醇1 h，85%乙醇1 h，95%乙醇40 min共2次，無水乙醇30 min共2次)。

③二甲苯透明(每小時(shí)更換1次二甲苯，共3次)。

④浸蠟與包埋：將透明化的組織浸入60 ℃的石蠟中進(jìn)行浸蠟處理，共3次，每次1 h，隨后將組織包埋于包埋盒中。

⑤塑型與切片：包埋好的石蠟塊塑型成棱臺(tái)狀固定于木托上，即可用切片機(jī)進(jìn)行組織切片，厚度為5 μm。

⑥展片與粘片：切好后的組織薄片需在42 ℃水浴鍋中進(jìn)行展片，隨后撈至涂有蛋白甘油的載玻片上，于37 ℃恒溫箱中過夜烘干后即可進(jìn)行H.E染色。

1.2.3H.E染色 H.E染色法又稱之為蘇木素—伊紅染色法，染色步驟如下：

①首先將石蠟切片利用二甲苯進(jìn)行脫蠟處理，共2次，每次10 min。

②將切片依次在梯度濃度下降的酒精中浸泡處理(順序?yàn)闊o水乙醇2 min，無水乙醇2 min，95%乙醇2 min，80%乙醇2 min，70%乙醇2 min)，最后用蒸餾水洗2 min。

③將切片放入蘇木素染液中浸泡3 min。

④將切片放入1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸酒精中酚化2下，自來水沖洗3 min。

⑤將切片放入淡氨水中返藍(lán)20 s，自來水沖洗5 min，直至顯微鏡下細(xì)胞核呈現(xiàn)清晰的藍(lán)色。

⑥將切片放入伊紅染液中染色3 min。

⑦切片依次放入70%乙醇30 s，80%乙醇30 s，90%乙醇30 s，95%乙醇5 min共2次，無水乙醇5 min共2次進(jìn)行脫水處理。

⑧切片放入二甲苯中進(jìn)行透明處理，每次10 min，共2次。

⑨擦片后利用中性樹脂封片，隨后鏡檢即可。

1.2.4顯微鏡觀察及數(shù)據(jù)采集 利用奧林巴斯BX-40倒置顯微鏡進(jìn)行組織切片觀察，并利用顯微鏡成像系統(tǒng)拍攝照片進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。分別測(cè)量各組雞胚E16，E18和E20時(shí)十二指腸、空腸及回腸絨毛高度及肌層厚度，絨毛高度以每張切片中最長(zhǎng)的10根絨毛長(zhǎng)度平均值為測(cè)定數(shù)值，肌層厚度以每張切片最厚肌層位置厚度為測(cè)定數(shù)值。分別測(cè)量各組雞胚E16，E18，E20時(shí)法氏囊濾泡面積，以每張切片中最大的10個(gè)濾泡面積平均值作為測(cè)定數(shù)值。

1.2.5數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 本次試驗(yàn)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，利用LSD檢驗(yàn)方法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照度LED綠光照明對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期小腸絨毛和胚層發(fā)育的影響

觀察各組雞胚十二指腸段組織切片(圖1)，并對(duì)其絨毛高度和肌層厚度進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果表明：在16胚齡時(shí)，弱光組絨毛高度顯著高于黑暗組(P<0.05)，而中光組和強(qiáng)光組與黑暗組無顯著性差異(P>0.05)(表1)；中光組肌層厚度顯著高于弱光組和強(qiáng)光組(P<0.05)，黑暗組與該3組無顯著性差異(P>0.05)。在18胚齡，4組間絨毛高度均存在顯著性差異(P<0.05)，其中中光組最高，強(qiáng)光組最低；中光組肌層厚度顯著性高于黑暗組(P<0.05)，其余各組間無顯著性差異(P>0.05)。在20胚齡，弱光組絨毛高度顯著高于其余3組(P<0.05)，其中中光組和強(qiáng)光組絨毛高度顯著性低于黑暗組(P<0.05)；中光組肌層厚度顯著性高于弱光組(P<0.05)，其余各組間無顯著性差異(P>0.05)。

注：E16，E18，E20分別代表16胚齡，18胚齡，20胚齡。下同。圖1 不同光照度LED綠光孵化下壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期十二指腸顯微結(jié)構(gòu)

觀察各組雞胚空腸段組織切片(圖2)，并對(duì)其絨毛高度和肌層厚度進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果表明：在16胚齡，弱光組絨毛高度顯著性高于中光組和黑暗組(P<0.05)，強(qiáng)光組絨毛高度顯著性低于中光組和黑暗組(P<0.05)(表1)；試驗(yàn)各組間肌層厚度均存在顯著性差異(P<0.05)，其中弱光組最高，黑暗組最低。在18胚齡，中光組和黑暗組絨毛高度顯著性高于弱光組和強(qiáng)光組(P<0.05)，中光組和黑暗組之間無顯著差異(P>0.05)；而弱光組和中光組肌層厚度顯著性高黑暗組(P<0.05)，強(qiáng)光組與黑暗組之間無顯著差異(P>0.05)。在20胚齡，弱光組絨毛高度顯著性高于其它3組(P<0.05)，其余各組間無顯著性差異(P>0.05)；強(qiáng)光組肌層厚度顯著性高于弱光組和中光組(P<0.05)，黑暗組肌層厚度最低，顯著性低于另外3組。

圖2 不同光照度LED綠光孵化下壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期空腸顯微結(jié)構(gòu)

觀察各組雞胚回腸段組織切片(圖3)，并對(duì)其絨毛高度和肌層厚度進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果表明：在16胚齡時(shí)，弱光組和中光組絨毛高度顯著性高于黑暗組(P<0.05)，強(qiáng)光組與黑暗組間無顯著性差異(P>0.05)(表1)；肌層厚度中光組最高，弱光組次之，均顯著性高于黑暗組(P<0.05)，強(qiáng)光組與黑暗組間無顯著性差異(P>0.05)。在18胚齡時(shí)，黑暗組絨毛高度顯著高于另外3組(P<0.05)，強(qiáng)光組最低；中光組和強(qiáng)光組肌層厚度顯著高于黑暗組(P<0.05)，弱光組與黑暗組間無顯著差異(P>0.05)。在20胚齡，中光組和強(qiáng)光組絨毛高度顯著低于黑暗組(P<0.05)，弱光組與黑暗組間無顯著差異(P>0.05)；黑暗組肌層高度顯著低于另外3組(P<0.05)。

2.2 不同強(qiáng)度LED綠光照明對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期法氏囊發(fā)育的影響

觀察各組雞胚法氏囊組織切片(圖4)，并對(duì)其濾泡大小進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在16胚齡時(shí)，弱光組法氏囊濾泡的平均面積顯著性大于其余3組(P<0.05)，中光組和強(qiáng)光組略大于黑暗組，差異不顯著(P>0.05)(表2)；到了18胚齡，弱光組法氏囊濾泡平均面積仍然顯著性大于中光組和黑暗組(P<0.05)，此時(shí)強(qiáng)光組法氏囊濾泡平均面積顯著性小于中光組和黑暗組(P<0.05)；在20胚齡時(shí)，3個(gè)光照組法氏囊濾泡平均面積均顯著性大于黑暗組(P<0.05)。

圖3 不同光照度LED綠光孵化下壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期回腸顯微結(jié)構(gòu)

表1 不同光照度LED綠光對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期小腸絨毛和肌層發(fā)育的影響 μm

圖4 不同光照度LED綠光孵化下壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期法氏囊顯微結(jié)構(gòu)

表2 不同光照度LED綠光對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞法氏囊濾泡平均面積的影響 μm 2

3 討 論

3.1 不同光照度LED綠光對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期小腸發(fā)育的影響

在種蛋孵化過程中，第15～20胚齡期是小腸消化吸收與免疫功能快速發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期[11]。本次試驗(yàn)以壩上長(zhǎng)尾雞為研究對(duì)象，研究該階段綠光照明對(duì)小腸發(fā)育的影響，結(jié)果表明，弱光組(30～80 lx)雞胚小腸各段的絨毛高度及肌層厚度顯著高于黑暗組，表明該光照條件利于壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期小腸的發(fā)育。這與謝電等[4]研究綠光對(duì)AA肉雛雞腸道發(fā)育中的結(jié)果一致。在雞胚發(fā)育過程中，15胚齡時(shí)小腸腸壁的粘膜層、粘膜下層、肌層及漿膜結(jié)構(gòu)已初步形成，此時(shí)粘膜層向內(nèi)突起形成絨毛結(jié)構(gòu)，絨毛上皮主要由柱狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞尚不具備吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力；直至18胚齡，絨毛已增高至小腸壁厚度的一半，細(xì)胞功能日益完善[11]；到20胚齡時(shí)，小腸絨毛呈現(xiàn)長(zhǎng)葉狀，其柱狀細(xì)胞已經(jīng)完全成熟、具有選擇性吸收的能力，杯狀細(xì)胞分泌的粘液，一方面促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，另一方面與柱狀細(xì)胞分泌的糖蛋白結(jié)合進(jìn)而形成腸道粘膜上皮表面的保護(hù)層，成為抵御潛在致病原的物理屏障[12，13]。30～80 lx光照度下雞胚小腸絨毛高度顯著提高，意味著其上皮中柱狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)量也隨之上升，有利于增強(qiáng)孵化后雛雞的營(yíng)養(yǎng)吸收能力，提高其生長(zhǎng)能力；另外，小腸絨毛上皮間存在淋巴細(xì)胞，可以抵御腸道病原微生物的侵襲從而保護(hù)機(jī)體。小腸肌層由平滑肌構(gòu)成，受植物性神經(jīng)調(diào)控而進(jìn)行有節(jié)律的收縮，肌層增厚，其收縮力提高，加快小腸壁的蠕動(dòng)，從而加快腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入到循環(huán)系統(tǒng)。適宜強(qiáng)度的綠光照明可通過促進(jìn)雞胚的小腸發(fā)育提高營(yíng)養(yǎng)吸收能力，從而促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育。

3.2 不同光照度LED綠光對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期法氏囊發(fā)育的影響

法氏囊是禽類特有的中樞免疫器官，是B淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟的場(chǎng)所，同時(shí)其還與盲腸扁桃體、PP結(jié)等共同構(gòu)成腸道粘膜相關(guān)淋巴組織，構(gòu)成機(jī)體免疫的第一道屏障[14]。禽法氏囊的發(fā)生是一個(gè)較為復(fù)雜的過程，4～5胚齡時(shí)即產(chǎn)生法氏囊原基[15]，直至第15～16胚齡才形成大小不一的淋巴濾泡，在18胚齡時(shí)法氏囊基本形成，隨著胚齡的增加，法氏囊淋巴濾泡之間界限清晰，面積明顯增大[16]。本試驗(yàn)條件下，在20胚齡時(shí)，各光照組壩上長(zhǎng)尾雞的法氏囊濾泡平均面積均顯著大于黑暗組。與黑暗組相比，弱光組、中光組和強(qiáng)光組雞胚法氏囊濾泡平均面積分別增長(zhǎng)了49.43%，33.60%，27.66%。這表明在胚胎發(fā)育過程中，綠光照射可以促進(jìn)雞胚法氏囊的發(fā)育，器官形態(tài)可影響功能變化，由此推測(cè)綠光可通過增大法氏囊的濾泡面積從而提高其免疫功能，最終促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)中，孵化期使用綠光照明種蛋對(duì)于壩上長(zhǎng)尾雞胚胎期小腸各段和法氏囊的發(fā)育產(chǎn)生了一定影響，其中使用30～80 lx的綠光照明可促進(jìn)小腸絨毛發(fā)育、肌層增厚，法氏囊濾泡增大，而光照度過高對(duì)于腸道的發(fā)育則有一定的抑制作用。