羅 丹，劉 芮，高玉龍，李 凱，劉長軍，祁小樂，崔紅玉，張艷萍，潘 青，高 立*，王笑梅,2*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069；2.江蘇省動物重要疫病與人畜共患病協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009）

2006 年在我國首次發(fā)現(xiàn)鴨脾壞死病（Duck spleen necrosis disease，DSND），該病是由新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）引起的一種以鴨脾臟表面出血或壞死為病變特征的疾病[1-3]。自2017 年以來，DSND 在山東、江蘇和河南等地區(qū)的養(yǎng)鴨場中時有暴發(fā)，有研究表明其致病性與先前報道的DSND 不同，呈不斷變異和增強態(tài)勢[4-6]。NDRV主要感染30 日齡以內(nèi)的雛鴨，脾臟為其主要靶器官，感染日齡愈小，發(fā)病率和死亡率愈高。目前，該病已廣泛存在于我國水禽飼養(yǎng)地區(qū)，給水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重經(jīng)濟損失[7-12]。

然而，目前尚無商業(yè)疫苗用于新型鴨呼腸孤病毒病的防控。隨著NDRV 感染宿主范圍和地理位置的不斷擴大，NDRV 疫苗的研發(fā)愈發(fā)重要，而動物感染模型是評價疫苗效果的重要工具[13-18]，但相關(guān)研究尚未見報道。本實驗室前期流行病學調(diào)查和致病性研究表明，2019 年分離的以脾臟腫脹壞死為特征的SD19/6201 株為NDRV 流行代表株[7-8]，因此本研究選用該病毒株建立了NDRV 的14 日齡和21 日齡雛鴨感染模型，確定了感染劑量、剖檢時間及發(fā)病指標，為NDRV 疫苗免疫效果評價提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料NDRV SD19/6201 株（MT829205～MT829214）由本實驗室保存。SPF 麻鴨購自國家禽類實驗動物資源庫，飼養(yǎng)于負壓隔離器中，且本研究中涉及的所有動物實驗均已獲得黑龍江省動物實驗倫理委員會批準，并按照科學技術(shù)部的《實驗動物指南》以及動物道德準則和批準的規(guī)程操作。

TRIzol、Premix ExTaq（Probe qPCR）均購自寶生物工程（大連）有限公司；M-MLV Reverse Transcriptase 購自Invitrogen 公司。

1.2 NDRV 動物感染試驗將120 只1 日齡SPF 雛鴨隨機分成6 組（1～4 組為感染組、5～6 組為對照組），每組20 只，飼養(yǎng)于負壓隔離器中。將SPF 雛鴨飼養(yǎng)至14 日齡時，組1 和組2 分別按105.0ELD50/0.1 mL/只和106.0ELD50/0.1 mL/只劑量經(jīng)腿部肌肉接種NDRV SD19/6201 株，組5 對照組經(jīng)腿部肌肉接種0.1 mL PBS；將SPF雛鴨飼養(yǎng)至21日齡時，組3和組4分別按105.0ELD50/0.1 mL/只、106.0ELD50/0.1 mL/只劑量經(jīng)腿部肌肉接種NDRV SD19/6201 株，組6 對照組經(jīng)腿部肌肉接種0.1 mL PBS。采用隔離器飼養(yǎng)，保證充足的飲水、采食和光照。

1.3 NDRV 感染SPF 鴨臨床癥狀及剖檢變化1.2中SPF 雛鴨感染后每天早晚各觀察一次，記錄發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察7 d。分別在感染后第5 d（5 dpi）、7 dpi 自各組中隨機選取10 只雛鴨，頸靜脈放血迫殺后剖檢并觀察脾臟有無腫脹、出血點（斑）或黃白色壞死灶等病理變化。

1.4 NDRV 感染SPF 鴨脾臟組織病理學觀察將分別于感染后第5 d、7 d 采集的各組SPF 雛鴨的脾臟組織一部分按常規(guī)方法固定于福爾馬林溶液，制作病理切片，進行組織病理學觀察分析。另一部分-20 ℃保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)病毒載量的檢測。

1.5 各組鴨脾臟指數(shù)的測定在5 dpi、7 dpi 分別取6 組各其余10 只，稱重后放血剖殺，采集脾臟稱重，計算脾臟比重和脾臟指數(shù)（脾臟比重=脾臟重/體重，脾臟指數(shù)=感染組脾臟比重/對照組脾臟比重）。試驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用GraphPad Prism 8 雙因素方差分析方法（Two-way-ANOVA）進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

1.6 各組鴨脾臟病毒載量檢測取1.4 中采集的各組雛鴨脾臟組織各1 g，研磨破碎后采用TRIzol 試劑進行病毒RNA 提取，利用M-MLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，采用文獻[19]中NDRV 熒光定量引物和探針，參照文獻[20]中TaqMan 熒光定量RT-PCR 方法對各組雛鴨脾臟中的病毒載量進行測定，每個樣品重復3次，并對其進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié) 果

2.1 NDRV 感染SPF 鴨臨床癥狀及剖檢變化將NDRV SD19/6201 株分別感染SPF 雛鴨后觀察雛鴨臨床癥狀及剖檢變化。結(jié)果顯示，感染組雛鴨均表現(xiàn)為喜臥、精神稍有沉郁等臨床癥狀，無死亡，對照組無明顯異常。剖檢觀察可見，各感染組發(fā)病鴨脾臟出現(xiàn)腫大、表面有出血斑或壞死灶等特征性病變，而其他臟器和對照組各臟器均無明顯眼觀病變（圖1）。將脾臟出血或壞死等特征性病變作為NDRV 感染雛鴨的發(fā)病指標，各組發(fā)病比率統(tǒng)計見表1。

表1 NDRV感染鴨的發(fā)病率統(tǒng)計Table 1 Morbidity of animals infected with NDRV

14 日齡感染雛鴨，5 dpi 時低劑量感染組雛鴨剖檢病變以脾臟出血點/斑為主，脾臟病變比率為70%（圖1A）；高劑量感染組所有雛鴨脾臟均出現(xiàn)黃白色壞死灶，脾臟病變比率為100%。7 dpi 時雛鴨脾臟病變更加嚴重，甚至個別脾臟完全壞死，低高劑量組脾臟的病變比率分別為80%和90%。

與14 日齡雛鴨相比，21 日齡雛鴨感染后脾臟剖檢病變較輕（圖1），低劑量感染組雛鴨在5 dpi 和7 dpi 脾臟出現(xiàn)腫大、出血或壞死的比率明顯低于相同劑量的14 日齡雛鴨感染組；高劑量感染組雛鴨在5 dpi 和7 dpi 脾臟出現(xiàn)出血、壞死的比率均為80%，但7 dpi 脾臟黃白色壞死灶病變較5 dpi 更明顯。各對照組雛鴨未見異常，剖檢脾臟無任何病變（圖1B）。

圖1 NDRV感染雛鴨的脾臟剖檢病變Fig.1 Spleen lesion of ducklings infected with NDRV

以上結(jié)果表明，NDRV 感染引起的脾臟病變程度與感染鴨日齡呈負相關(guān)，與21 日齡雛鴨感染組相比，14 日齡雛鴨對NDRV 更易感，表現(xiàn)為感染雛鴨脾臟發(fā)病率更高，脾臟眼觀病變更嚴重。

2.2 NDRV 感染SPF 鴨脾臟組織病理學觀察在5 dpi、7 dpi 采集各組SPF 鴨的脾臟組織，制作病理切片后觀察組織病變，結(jié)果顯示感染組鴨均可見脾臟紅白髓界限不清，淋巴細胞數(shù)量減少，異嗜細胞浸潤，呈局灶性壞死等。其中在7 dpi 時，高劑量感染組14 日齡雛鴨脾臟局部出現(xiàn)大面積壞死，伴隨蛋白樣滲出，巨噬細胞增生（圖2B、圖2C），21 日齡雛鴨脾臟組織內(nèi)淋巴細胞大量減少，脾臟紅髓可見異嗜細胞增生。對照組鴨脾臟組織正常。上述結(jié)果顯示，與14 日齡雛鴨感染組相比，21 日齡雛鴨感染組脾臟組織病變更輕（圖2E、圖2F），這與剖檢病變一致。表明以脾臟剖檢病變作為NDRV 感染模型發(fā)病指標具有科學性。

圖2 高劑量NDRV感染雛鴨脾臟病理組織切片觀察結(jié)果（標尺為100 μm）Fig.2 Results of histopathological section in spleen of the high dose NDRV infected ducklings(Scale is 100 μm)

2.3 各組鴨脾臟指數(shù)的測定結(jié)果各組鴨脾臟指數(shù)的測定結(jié)果顯示，14 日齡和21 日齡感染雛鴨在5 dpi 脾臟指數(shù)顯著或者極顯著高于對照組（P＜0.05 或P＜0.001；圖3A），在7 dpi 14 日齡雛鴨感染組脾臟指數(shù)與對照組脾臟指數(shù)無明顯差異，但脾臟壞死癥狀并未恢復（圖1A）；在5 dpi 和7 dpi 時21 日齡感染雛鴨脾臟指數(shù)均顯著或者極顯著高于對照組（P＜0.05，P＜0.01 或P＜0.001；圖3B），但脾臟腫脹程度7 dpi 時較5 dpi 減輕。以上結(jié)果表明，NDRV 可引起感染雛鴨脾臟腫大，隨著感染時間的推移脾臟腫大程度變輕，但其壞死癥狀并未恢復。

圖3 NDRV感染后不同時間鴨的脾臟指數(shù)Fig.3 Index of spleen at different time points after NDRV infection

2.4 各組鴨脾臟病毒載量檢測結(jié)果利用熒光定量PCR 檢測方法對靶器官脾臟進行病毒載量的檢測，結(jié)果顯示，在5 dpi 即可在各組感染雛鴨脾臟中檢測到大量病毒，且高劑量感染組雛鴨脾臟中病毒載量高于低劑量感染組雛鴨；在5 dpi 時14 日齡雛鴨（低日齡）各劑量感染組病毒載量明顯高于21 日齡雛鴨（高日齡）各劑量感染組；在7 dpi，除21 日齡高劑量感染組雛鴨脾臟中病毒載量稍高于5 dpi 外，其余各劑量感染組脾臟病毒載量均明顯低于5 dpi（圖4）。

圖4 NDRV感染雛鴨脾臟病毒載量的檢測Fig.4 Detection of viral loads in spleen of the NDRV infected ducklings

以上結(jié)果顯示，NDRV 在低日齡雛鴨脾臟中復制滴度明顯高于高日齡雛鴨，表明NDRV 在低日齡雛鴨脾臟中的復制能力更強，這可能是造成NDRV在不同日齡雛鴨上致病性差異的原因，即隨著雛鴨日齡的增大而對該病原易感性降低，抵抗力增強。

2.5 NDRV 動物感染模型評價指標的確定通過以不同劑量NDRV 感染不同日齡雛鴨，以雛鴨脾臟特征性出血或壞死作為NDRV 感染的發(fā)病指標，統(tǒng)計其發(fā)病率，確定了NDRV 對14 日齡雛鴨的最佳感染劑量為105.0ELD50/0.1 mL，對21 日齡雛鴨的最佳感染劑量為106.0ELD50/0.1 mL，最佳迫殺時間均為7 dpi，此時脾臟黃白色壞死灶明顯，脾臟病變比率可達80%（8/10）。

3 討 論

NDRV 感染是嚴重危害我國水禽業(yè)健康發(fā)展的重要傳染病之一。近年來，針對該病原的疫苗研發(fā)是目前的關(guān)注點，但如何對相關(guān)疫苗效果進行評價，一直是限制該病疫苗研發(fā)的瓶頸，而NDRV 動物感染模型的建立是評價疫苗效果的關(guān)鍵。本實驗室前期分離獲得9 株NDRV，對其主要保護性抗原基因σC 的遺傳進化分析表明，NDRV SD19/6201 株為當前流行代表株[7-8]。因此本研究以該病毒株建立動物感染模型具有普適性。

NDRV 對雛鴨的致病與其日齡呈負相關(guān)，即雛鴨感染日齡越大，病毒對其致病性越弱[21]?；谠摬≡攸c，應(yīng)盡量選擇小日齡雛鴨進行動物感染試驗。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，NDRV 感染1 日齡雛鴨后的10 d～14 d 為抗體高水平期，之后抗體水平開始下降[8]。李靜等將NDRV-SDYC 株作為疫苗株，制備油乳劑滅活疫苗免疫1 日齡雛鴨后5 d 開始產(chǎn)生抗體，14 d 和21 d 為抗體高水平期[22]，這與本實驗室前期研究結(jié)果基本一致。NDRV 主要侵害30 日齡以內(nèi)的雛鴨，為了使其高峰抗體水平可覆蓋整個易感期，所以常在1 日齡或7 日齡免疫NDRV 候選疫苗，免疫后14 d 或21 d 抗體水平較高，此時進行攻毒保護試驗，評價疫苗免疫效果較合理。因此，本研究以不同劑量NDRV SD19/6201 株感染14 日齡和21 日齡雛鴨，建立了NDRV 對14 日齡和21 日齡雛鴨的感染模型。

有研究報道湖北地區(qū)的鴨呼腸孤病毒感染主要以脾臟和法氏囊壞死為主要特征[23]；廣西、山東、廣東及江蘇等地的NDRV 分離株主要引起雛鴨脾臟腫大和壞死[24]。由于靶器官脾臟是NDRV 檢測和分離的首選臟器[25-26]，因此，雛鴨脾臟的病理變化是該病原感染模型建立的主要依據(jù)，雛鴨脾臟出血或壞死的特征性病變可作為NDRV 感染雛鴨的發(fā)病指標。本實驗室前期在1 日齡雛鴨上開展了NDRV 的動物感染試驗，分別在1 dpi、3 dpi、5 dpi、7 dpi、10 dpi、14 dpi 對雛鴨進行剖檢觀察可見，在1 dpi～3 dpi 雛鴨脾臟病變以出血、腫脹為主，病變輕微；在5 dpi～10 dpi 雛鴨脾臟病變最嚴重，特別是在7 dpi和10 dpi，脾臟病變以黃白色壞死點、斑為主；在14 dpi 雛鴨脾臟壞死斑病變有所恢復，病變較輕微[8]。鑒于上述實驗結(jié)果，在本研究選擇5 dpi 和7 dpi 2 個迫殺時間點進行觀察，最終確定了最佳迫殺時間為7 dpi，各感染組脾臟病變以黃白色壞死灶為主，能夠保證發(fā)病率統(tǒng)計的準確性。與SD19/6201 株感染21日齡雛鴨相比，病毒感染14 日齡雛鴨脾臟出現(xiàn)出血或壞死的比率更高、病變更明顯，且脾臟病理變化更嚴重。提示14 日齡雛鴨對NDRV 更易感。Li 等人將NDRV 接種21 日齡櫻桃谷鴨的致病性試驗結(jié)果顯示，21 日齡櫻桃谷鴨對NDRV 有很強的抵抗力[27]。本研究中21 日齡雛麻鴨對NDRV 的感染也呈現(xiàn)出一定的抵抗力，但106.0ELD50/0.1 mL/只的高接種劑量也能引起21 日齡雛麻鴨脾臟出現(xiàn)80%的病變比率，這可能與不同NDRV 分離株的致病力和被感染鴨的品種有關(guān)。本研究初期也曾嘗試建立6 周齡麻鴨的NDRV 感染模型，但該日齡麻鴨感染NDRV 后無任何臨床癥狀，各器官特別是靶器官脾臟也無任何剖檢變化，進一步體現(xiàn)了該病原與鴨日齡呈負相關(guān)的致病特點，隨著鴨子日齡的增大對該病原的易感性明顯降低，抵抗力明顯增強。

綜上，結(jié)合NDRV 的致病特點，本研究確定了NDRV 對14 日齡雛鴨的最佳感染劑量為105.0ELD50/0.1 mL/只，21 日齡雛鴨最佳感染劑量為106.0ELD50/0.1 mL/只，最佳迫殺時間均為7 dpi，以脾臟出血、壞死為發(fā)病指標，病變率為80%（8/10）。本研究首次建立了NDRV 對不同日齡雛鴨的動物感染模型，該感染模型評價指標直觀，可操作性強，也便于基層推廣應(yīng)用，為DSND 相關(guān)疫苗質(zhì)量標準的研究提供重要依據(jù)。