李興健，孫蓉蓉，張 燦，劉文華，鄒 玲，任慧英

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109）

近年來，養(yǎng)殖業(yè)對(duì)抗生素過度依賴造成了抗生素的濫用，導(dǎo)致多重耐藥性細(xì)菌的相繼出現(xiàn)，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到行業(yè)的健康發(fā)展甚至人類健康。噬菌體作為細(xì)菌的天敵，可特異性殺菌，且其殺菌作用迅速、不受細(xì)菌耐藥性的限制、無毒副作用，受到醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床的普遍重視[1]。因此探究噬菌體感染細(xì)菌的機(jī)制，研制新型抗菌類藥物刻不容緩。

根據(jù)形態(tài)可以將噬菌體分為3 大類：有尾噬菌體、絲狀噬菌體和無尾噬菌體，其中有尾噬菌體占比96%[2]。根據(jù)噬菌體尾部結(jié)構(gòu)的不同，又可以將有尾噬菌體分為長(zhǎng)尾噬菌體、短尾噬菌體和肌尾噬菌體3 個(gè)科。不同噬菌體對(duì)同種宿主菌的吸附機(jī)制不同，同一噬菌體對(duì)同種細(xì)菌不同菌株的吸附機(jī)制也可能存在差異[3]。噬菌體尾部蛋白包括尾絲蛋白、尾刺蛋白、尾纖維蛋白等，負(fù)責(zé)對(duì)宿主細(xì)胞的識(shí)別和吸附[4]，與噬菌體的吸附機(jī)制有關(guān)。

短尾噬菌體包括P22 類噬菌體、T7 類噬菌體和N4 類噬菌體等[5]，本實(shí)驗(yàn)室分離的大腸桿菌短尾噬菌體Bp4 為N4 類噬菌體，經(jīng)基因組注釋發(fā)現(xiàn)其含有3 個(gè)尾部蛋白，即gp10（假定尾部蛋白）、gp11（尾絲蛋白）和gp13（尾刺蛋白），這3 個(gè)蛋白主要功能是負(fù)責(zé)對(duì)宿主受體的識(shí)別與吸附。但一般N4 類短尾噬菌體中無gp11和gp13基因[6]。研究結(jié)果顯示， N4 類噬菌體中的gp65 是識(shí)別宿主菌受體所必需的，但在Bp4 中卻未發(fā)現(xiàn)該類似基因[7]。這些結(jié)果顯示噬菌體Bp4 和N4 類短尾噬菌體的尾部蛋白基因不同，表明噬菌體Bp4 具有與N4 類噬菌體不同的吸附機(jī)制，因此，明確該噬菌體在識(shí)別宿主菌過程中的主要吸附蛋白對(duì)研究噬菌體的裂解機(jī)制及改造噬菌體有重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)室前期分離的多價(jià)噬菌體Bp4 為禽致病性大腸桿菌（APEC）的N4 類噬菌體，對(duì)該類細(xì)菌的裂解率達(dá)35%，可裂解O78、O88及O15等多種血清型的大腸桿菌[7]，但其識(shí)別宿主受體的機(jī)制尚不明確。因此，本研究對(duì)噬菌體Bp4 的3 個(gè)尾部蛋白gp10、gp11 和gp13 進(jìn)行相關(guān)研究，以明確Bp4 在宿主識(shí)別過程中起關(guān)鍵作用的尾部蛋白，為進(jìn)一步研究噬菌體感染宿主的機(jī)制及拓寬噬菌體的宿主譜奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料噬菌體Bp4 及其宿主菌O78血清型大腸桿菌由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)研究室分離鑒定并保存。大腸桿菌BL21（DE3）菌株、原核重組表達(dá)載體pcoldTF 均由本實(shí)驗(yàn)室保存；未經(jīng)免疫的家兔陰性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。

瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；DAB 試劑盒購(gòu)自Biosharp 公司；牛血清白蛋白（BSA）、低分子量蛋白Marker 購(gòu)自Solarbio 公司；T4 DNA Ligase、DL2000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶NdeI 與EcoR I、HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG（HRP-IgG）、鼠His 標(biāo)簽單克隆抗體（MAb）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 尾部蛋白基因gp10、gp11、gp13的PCR 擴(kuò)增按照文獻(xiàn)[8]，利用O78血清型大腸桿菌為宿主菌進(jìn)行噬菌體Bp4 的增殖。參照GenBank 中噬菌體Bp4的全基因組序列（KJ135004.2），利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)分別針對(duì)尾部蛋白基因gp10、gp11、gp13的引物，并在其兩端分別加入酶切位點(diǎn)NdeI和EcoR I（下劃線表示）（表1）。

表1 噬菌體Bp4尾部蛋白基因的擴(kuò)增引物Table 1 Primers of tail proteins of phage Bp4

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定及重組蛋白gp10、gp11、gp13 的表達(dá)以噬菌體Bp4 增殖液為模板，采用表1 中的相應(yīng)引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增Bp4 尾部蛋白基因。擴(kuò)增程序：94 ℃5 min；94 ℃1 min、55 ℃1 min、72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物回收與純化后分別克隆至經(jīng)NdeI 和EcoR I 雙酶切的表達(dá)載體pcoldTF 中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pcoldTF-gp10、pcoldTF-gp11、pcoldTF-gp13，并分別經(jīng)NdeI/EcoR I 雙酶切和測(cè)序鑒定。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在含1%Amp的LB中培養(yǎng)至OD600nm約為0.6～0.8 時(shí)加入終濃度為0.01 mol/L的IPTG 誘導(dǎo)12 h，取上清經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)后，以His 標(biāo)簽MAb（1∶1 500）為一抗，以羊抗鼠HRP-IgG（1∶3 000）為二抗，經(jīng)western blot 鑒定各重組蛋白的表達(dá)，并設(shè)誘導(dǎo)后含空質(zhì)粒的重組菌作為陽性對(duì)照。獲得的重組蛋白分別命名為rgp10、rgp11 及rgp13。將各重組蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)并經(jīng)His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化后，采用BCA 試劑盒分別測(cè)定各重組蛋白的含量。

1.4 各蛋白兔多克隆抗體的制備與效價(jià)的檢測(cè)調(diào)整各重組蛋白濃度均為1.0 mg/mL，以201 油性佐劑與各重組蛋白混勻乳化后， 免疫家兔，2 mL/只。共免疫4 次，每次間隔一周。4 免后1 周采集各組家兔血清，采用瓊脂免疫雙向擴(kuò)散試驗(yàn)[9]測(cè)定針對(duì)gp10、gp11、gp13 的抗體效價(jià)，選擇效價(jià)達(dá)1∶4 以上的抗血清用于后續(xù)試驗(yàn)。將制備的gp10、gp11、gp13 的兔多克隆抗體分別命名為anti-gp10、antigp11 和anti-gp13。

1.5 尾部蛋白競(jìng)爭(zhēng)吸附試驗(yàn)檢測(cè)噬菌體Bp4 吸附宿主菌的關(guān)鍵蛋白利用雙層平板法[6]，將200 μL O78型大腸桿菌懸液（8×109cfu/mL）分別與200 μL 濃度為1.0 mg/mL 純化的rgp10、rgp11 與rgp13 混合，對(duì)照組加入200 μL LB 肉湯，37 ℃孵育10 min 后，加入100 μL 9×1010pfu/mL的噬菌體Bp4增殖液，37 ℃孵育5 min，將其與5 mL 的上層培養(yǎng)基混合并吹打均勻，倒在事先鋪好并已凝固的下層培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)12 h 后檢測(cè)并計(jì)算各組噬菌斑的數(shù)量，按照公式：噬菌體相對(duì)吸附率=實(shí)驗(yàn)組噬菌斑數(shù)/對(duì)照組噬菌斑數(shù)×100%，計(jì)算噬菌體對(duì)大腸桿菌的相對(duì)吸附率。利用GraphPad Prism 6 軟件作圖，分析噬菌體Bp4 吸附宿主菌的關(guān)鍵蛋白。

1.6 尾部蛋白抗體阻斷吸附試驗(yàn)檢測(cè)噬菌體Bp4 吸附宿主菌的關(guān)鍵蛋白取100 μL 9×1010pfu/mL 的噬菌體增殖液分別與100 μL 不同尾部蛋白的抗血清（anti-gp10、anti-gp11、anti-gp13）37 ℃孵育5 min，以阻斷噬菌體對(duì)大腸桿菌的吸附。再加入200 μL 8×109cfu/mL 大腸桿菌菌增殖液，37 ℃作用5 min，以未免疫家兔的陰性血清為對(duì)照，參照1.5 中雙層平板法檢測(cè)計(jì)算，并分析噬菌體Bp4 吸附宿主菌的關(guān)鍵蛋白。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析1.5、1.6 試驗(yàn)中兩組間的差異性通過Student's t-test 檢驗(yàn)，P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定及重組蛋白的表達(dá)鑒定結(jié)果以噬菌體Bp4 的基因組為模板，PCR 擴(kuò)增其尾部基因gp10、gp11及gp13，分別克隆至pcoldTF 載體中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pcoldTFgp10、pcoldTF-gp11 及pcoldTF-gp13。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定結(jié)果顯示，分別出現(xiàn)711 bp、1 803 bp、2 115 bp 的目的條帶及5 733 bp 的載體條帶（圖1）。測(cè)序結(jié)果均與預(yù)期一致，表明正確構(gòu)建了上述3 種尾部蛋白基因重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組菌pcoldTFgp10/BL21、pcoldTF-gp11/BL21 和pcoldTF-gp13/BL21經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后，以鼠His 標(biāo)簽MAb 為一抗，羊抗鼠HRP-IgG 為二抗，經(jīng)western blot 鑒定結(jié)果顯示，上述重組菌分別在79 ku、117 ku和126 ku處出現(xiàn)與預(yù)期大小相一致的特異性條帶（圖2A、圖2B），表明rgp10、rgp11 及rgp13 在大腸桿菌中獲得了表達(dá)。通過BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)得純化蛋白的濃度均為3 mg/mL。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pcoldTF-gp10（A）、pcoldTF-gp11（B）及pcoldTF-gp13（C）的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Double enzyme digestion results of pcoldTF-gp10(A),pcoldTF-gp11(B)and pcoldTF-gp13 recombinat plasmids(C)

圖2 重組蛋白的western blot鑒定（A、B）結(jié)果Fig.2 Western blot detection of recombinant protein(A,B)

2.2 各重組蛋白兔多克隆抗體的制備與效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果將各重組蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)并純化后，將各重組蛋白免疫小鼠4 次后采血，采用瓊脂免疫雙向擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)各重組蛋白的效價(jià)。結(jié)果顯示，獲得的各重組蛋白兔抗血清anti-gp10、anti-gp11 和antigp13 的效價(jià)分別為1∶4、1∶8、1∶8，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 噬菌體尾部蛋白競(jìng)爭(zhēng)吸附試驗(yàn)結(jié)果將O78型大腸桿菌分別與rgp10、rgp11 和rgp13 孵育10 min后，加入噬菌體Bp4 增殖液吸附5 min 后，經(jīng)雙層平板法檢測(cè)并計(jì)數(shù)各組噬菌斑的數(shù)量，計(jì)算噬菌體對(duì)大腸桿菌的相對(duì)吸附率。結(jié)果顯示，尾刺蛋白rgp13組中噬菌體對(duì)大腸桿菌的相對(duì)吸附率為0，與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01）。而尾部蛋白rgp10 組和尾絲蛋白rgp11 組中噬菌體對(duì)大腸桿菌的相對(duì)吸附率均為100%，均與對(duì)照組無差異（圖3）。rgp13 在體外能夠完全抑制噬菌體Bp4 對(duì)宿主菌的吸附，而rgp10、rgp11 不能抑制噬菌體Bp4 對(duì)宿主菌的吸附，表明rgp13 是噬菌體Bp4 吸附宿主菌受體的關(guān)鍵尾部蛋白。

圖3 各重組尾部蛋白對(duì)噬菌體Bp4的相對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effect of recombinat tail proteins on the relative adsorption rate of phage Bp4

2.4 噬菌體尾部蛋白抗體阻斷吸附試驗(yàn)結(jié)果分別利用制備的各重組蛋白抗血清與噬菌體Bp4 相互作用5 min 后，加入O78型大腸桿菌宿主菌吸附5 min，利用雙層平板法檢測(cè)并對(duì)各組噬菌斑計(jì)數(shù)，計(jì)算噬菌體對(duì)大腸桿菌的相對(duì)吸附率。結(jié)果顯示，antigp11、anti-gp13組中的噬菌體對(duì)大腸桿菌的相對(duì)吸附率均為0，且與對(duì)照組相比差異均極顯著（P＜0.01）。而anti-gp10 組與對(duì)照組一樣，其中的噬菌體對(duì)宿主菌的相對(duì)吸附率均為100%，即anti-gp10 不能夠競(jìng)爭(zhēng)噬菌體Bp4 對(duì)宿主菌的吸附（圖4）?？梢娢步z蛋白抗血清anti-gp11 和尾刺蛋白抗血清anti-gp13 在體外均能夠完全競(jìng)爭(zhēng)噬菌體Bp4 對(duì)宿主菌的吸附。這兩種抗體與噬菌體尾部蛋白的特異性結(jié)合，使噬菌體尾部蛋白無法識(shí)別并結(jié)合受體，阻斷了噬菌體對(duì)宿主菌的吸附，而尾部蛋白anti-gp10 則無該阻斷作用。進(jìn)一步表明尾刺蛋白gp13 是噬菌體Bp4 識(shí)別宿主菌的關(guān)鍵蛋白，而尾絲蛋白gp11 是影響噬菌體Bp4 識(shí)別宿主菌的重要蛋白。

圖4 各尾部蛋白的多克隆抗體對(duì)噬菌體相對(duì)吸附率的影響Fig.4 Effects of polycloned antibodies against tail protein gp10，gp11 and gp13 on the relative adsorption rate of phage Bp4

3 討 論

噬菌體在對(duì)抗耐藥菌感染中發(fā)揮越來越重要的作用。有尾噬菌體通過尾部蛋白與細(xì)菌表面受體的作用，引發(fā)噬菌體的感染及裂解過程[10]。噬菌體受體的特異性識(shí)別限制了噬菌體的裂解譜，目前主要利用噬菌體雞尾酒擴(kuò)大噬菌體制劑的裂解譜，以增強(qiáng)噬菌體臨床應(yīng)用的有效性[11]。通過噬菌體與宿主菌的相互作用研究，明確決定噬菌體感染細(xì)菌的主要尾部蛋白，將有利于改造噬菌體從而擴(kuò)展其的宿主譜。本研究所用的噬菌體Bp4 為短尾噬菌體，屬N4 類雙鏈DNA 噬菌體，前期通過全基因組測(cè)序預(yù)測(cè)到其有3 個(gè)尾部蛋白，分別是假定尾部蛋白rgp10、尾絲蛋白rgp11 及尾刺蛋白rgp13，通過對(duì)噬菌體Bp4 這3 個(gè)尾部蛋白的研究，可以明確它們?cè)谑删wBp4 吸附過程中的作用[12]。

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得可溶性表達(dá)的噬菌體尾部蛋白rgp10、rgp11 和rgp13，純化后，一方面用于尾部蛋白競(jìng)爭(zhēng)吸附試驗(yàn)，檢測(cè)噬菌體Bp4 吸附宿主菌的關(guān)鍵蛋白；另一方面將這3 種蛋白分別免疫家兔得到各蛋白的抗血清（多克隆抗體），用于尾部蛋白抗體阻斷吸附試驗(yàn)中阻斷噬菌體尾部蛋白與細(xì)菌的吸附[14]，進(jìn)一步確定噬菌體Bp4 吸附宿主菌的關(guān)鍵蛋白。根據(jù)噬菌體Bp4 的尾部結(jié)構(gòu)及上述兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果可知，宿主菌的受體與尾絲蛋白rgp13結(jié)合后，阻斷了噬菌體對(duì)細(xì)菌的吸附，使噬菌體Bp4 無法與宿主菌結(jié)合；噬菌體Bp4 尾絲蛋白rgp11和尾刺蛋白rgp13 由于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合了制備的多克隆抗體（anti-gp11、anti-gp13），造成這兩種尾部蛋白無法結(jié)合細(xì)菌受體，從而阻斷了噬菌體Bp4 對(duì)宿主菌的吸附。而尾部蛋白rgp10 卻不能影響噬菌體與宿主菌的結(jié)合，anti-gp10 也不能阻斷噬菌體對(duì)宿主菌的吸附。這表明尾刺蛋白gp13 是噬菌體Bp4 關(guān)鍵的受體識(shí)別蛋白，尾絲蛋白gp11 是影響噬菌體與細(xì)菌結(jié)合的重要蛋白。綜上所述，本研究確定了該噬菌體在與細(xì)菌結(jié)合的過程中，主要是由其尾刺蛋白gp13 識(shí)別吸附細(xì)菌受體。

不同類型噬菌體的感染機(jī)制不同，如本實(shí)驗(yàn)室前期分離保存的大腸桿菌肌尾噬菌體Bp7 為T4 類噬菌體，尾絲蛋白gp38 為其長(zhǎng)尾絲末端的吸附蛋白，在噬菌體吸附宿主中發(fā)揮關(guān)鍵作用。而本研究證實(shí)尾刺蛋白gp13 是短尾噬菌體Bp4 吸附宿主的關(guān)鍵蛋白?？梢?，Bp4 和Bp7 雖均為大腸桿菌的噬菌體，其裂解譜有交叉，但各自也有許多特異的宿主菌。解析噬菌體的主要吸附蛋白及其關(guān)鍵位點(diǎn)和功能，將有助于改造噬菌體，擴(kuò)大噬菌體的宿主譜。本研究在一定程度上彌補(bǔ)了大腸桿菌噬菌體對(duì)宿主菌裂解機(jī)制的空缺，并為噬菌體的臨床治療奠定基礎(chǔ)。