王 俊，李 軍，劉躍生，劉 銳，趙海云，費(fèi) 楓，崔國(guó)林，賈 艷*，禹海杰*

（1.嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 嘉興 314036；2.河北工程大學(xué)，河北 邯鄲 056038）

腸炎沙門氏菌（SalmonellaEnteritidis，SE）是一種重要的食源性病原菌，感染宿主范圍廣泛。禽類是SE重要的儲(chǔ)存宿主[1]。近來，SE的流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果表明，SE是引起雞、鴨等禽類沙門氏菌病的主要血清型之一[2-3]。SE 感染成年禽類后主要定植于腸道，多呈隱性感染，持續(xù)向外排毒，污染禽肉及蛋產(chǎn)品[4]。國(guó)內(nèi)因SE污染禽類食品導(dǎo)致的食物中毒事件也被多次報(bào)道[5-6]。因此禽SE的血清學(xué)診斷具有重要意義。

目前，SE 的血清學(xué)檢測(cè)方法主要有ELISA 方法、試管凝集試驗(yàn)、玻片凝集試驗(yàn)等，其中ELISA 方法的敏感性高和特異性強(qiáng)。用于SE抗體檢測(cè)的ELISA方法大多基于菌體表面多糖和蛋白等抗原，例如Xia 等利用沙門氏菌O9 抗原建立競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法用于檢測(cè)腸炎、雞白痢等血清D 群沙門氏菌[7]。FliC 蛋白是SE 鞭毛的主要組分，其氨基酸序列劃分為D0、D1、D2 和D3區(qū)域，D0和D1區(qū)域在沙門氏菌屬內(nèi)高度保守，D2和D3 區(qū)域?yàn)楦咦儏^(qū)，同時(shí)也是刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答的主要區(qū)域[8]。Mirhosseini 等利用原核表達(dá)了FliC 蛋白，并以此建立的間接ELISA 方法能夠檢測(cè)BALB/c 小鼠血清抗體[9]。阻斷ELISA 方法通過制備的特異性抗體與血清抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原位點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究利用SE FliC蛋白高變區(qū)制備單克隆抗體（MAb），以此為基礎(chǔ)建立抗體阻斷ELISA方法（bELISA），為SE血清學(xué)調(diào)查提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SE CICC10467 株購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，其他菌株均保存于本實(shí)驗(yàn)室；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。6 周齡～8 周齡雌性BALB/c 小鼠購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（中國(guó)北京）；1 日齡雛鴨和14 周齡北京鴨購(gòu)自北京市某北京鴨養(yǎng)殖場(chǎng)。SE 陽性雞血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 主要試劑PEG1500、HT/HAT 培養(yǎng)基、SBA Clonotyping System-HRP、弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；Ni 和GST瓊脂糖凝膠，HRP 標(biāo)記山羊抗雞IgG 購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；rProtein A/G 瓊脂糖凝膠購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；其他化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；LB 和BPW 培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 購(gòu)自北京中衫金橋生物科技有限公司；禽SE 抗體檢測(cè)試劑盒（REF 99-08701）購(gòu)自美國(guó)IDEXX 公司。

1.3 MAb 的制備

1.3.1 SE FliC蛋白原核表達(dá)、純化和鑒定 參照Gen-Bank 中SE P125109 株（AM933172.1）、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 株（MF948286.1）、鴨沙門氏菌M-3471株（NZ_CP045458.1）、阿培依姆沙門氏菌1897 株（MK905544.1）的FliC蛋白氨基酸序列，利用Megalign軟件比對(duì)序列相似性。根據(jù)SE P125109 株fliC基因的高變區(qū)、pET-21b 和pGEX-2T 質(zhì)粒設(shè)計(jì)兩對(duì)引物（pET-21b：F1：GGGAATTCGAACGGGACTAACTCTG ATTCCG/R1： GGGCTCGAGCAGAATCTGCGCTTTAGAC A；pGEX-2T：F2：GCGGATCCAACGGGACTAACTC TGATTCCG/R2：GGGAATTCCCAGAATCTGCGCTTTAG ACA），分別擴(kuò)增目的基因片段。PCR 產(chǎn)物經(jīng)DNA 回收試劑盒回收純化，雙酶切后將其分別克隆于pET-21b 和pGEX-2T 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET21b-fliC和pGEX-2T-fliC，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組菌pET21b-fliC/DH5α 和pGEX-2T-fliC/DH5α，PCR 篩選陽性菌株，經(jīng)測(cè)序鑒定序列無誤后，將重組大腸桿菌pET21b-fliC/DH5α 和pGEX-2T-fliC/DH5α分別37 ℃培養(yǎng)至OD600nm約為0.6 時(shí)，加入終濃度0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)4 h。收集菌體，超聲破碎，4 ℃離心，取沉淀后分別以His 抗體和GST 抗體（1∶5 000）為一抗，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）為二抗，進(jìn)行western blot 分析。將重組His-FliC 蛋白和GST-FliC 經(jīng)Ni 瓊脂糖凝膠和GST 瓊脂糖凝膠純化， SDS-PAGE 分析純化效果后進(jìn)一步以SE 陽性雞血清（1∶200）為一抗，HRP 標(biāo)記山羊抗雞IgG 為二抗（1∶5 000），通過western blot 鑒定重組蛋白的抗原性，并利用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。

1.3.2 雜交瘤細(xì)胞株的制備 將經(jīng)GST 瓊脂糖凝膠純化的GST-FliC 重組蛋白與等劑量FCA 乳化后免疫6～8 周齡雌性BALB/c 小鼠，三周后用純化的GSTFliC 與等劑量FIA 乳化，進(jìn)行第二次免疫，間隔三周后進(jìn)行第三次免疫，方法和免疫劑量同第二次。第三次免疫后第7 d 經(jīng)眼靜脈叢采血，分離血清，以His-FliC 為包被抗原，待篩選雜交瘤細(xì)胞株上清原液為一抗，HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）為二抗，通過間接ELISA 方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。取三次免疫后血清抗體效價(jià)為1∶64 000 的小鼠脾臟，分離脾細(xì)胞并與SP2/0 細(xì)胞融合。采用上述間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。

1.3.3 小鼠腹水MAb 的制備、純化和鑒定 10 周齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL滅菌液體石蠟，致敏14 d 后，每只腹腔注射約5×105個(gè)雜交瘤細(xì)胞，7 d～15 d 采集腹水，短暫離心去除脂肪等雜質(zhì)，采用rProtein A/G 瓊脂糖凝膠親和層析法純化腹水，利用SDS-PAGE 分析MAb 純化效果。

利用SBA Clonotyping System-HRP 試劑盒對(duì)MAb的亞類鑒定。同時(shí)，分別將SE（H:g,m）、都柏林沙門氏菌（S.Dublin）（H:g,m）、雞白痢沙門氏菌（S. Pullorum）（H:-）、雞 傷 寒 沙 門 氏 菌（S. Gallinarium）（H:-）、鼠傷寒沙門氏菌（S. Typhimurium）（H:1,4,[5],12）、S. Rissen（H:f,g）、S. Senfternberg（H:g,[s],t）、S. Montevideo（H:g,m,s）菌株和大腸桿菌（E. coli）、銅綠假單胞桿菌（P. aeruginosa）、普通變形桿菌（P. vulgaris）、無乳鏈球菌（S. alactolyticus）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、鴨疫里默氏桿菌（R. anatipestifer）的過夜培養(yǎng)物稀釋至OD600nm約為1.0，取1 mL 菌液8 000 r/min 離心3 min 后，用100 μL 無菌去離子水重懸菌體，分別以篩選制備的MAb 為一抗（1∶5 000），HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）為二抗，通過western blot 分析鑒定MAb。

1.4 MAb 阻 斷ELISA 方 法 的 建立

1.4.1 MAb 阻斷ELⅠSA 方法最佳反應(yīng)條件的確定 以MAb 1D3 為阻斷抗體建立bELISA 方法，操作過程：每孔加入100 μL 包被液稀釋的His-FliC 重組蛋白，4 ℃過夜孵育后棄去抗原液，1×PBST 洗滌3次；每孔加入250 μL 封閉液，37 ℃封閉2 h 后棄去封閉液，洗滌同上；每孔加入100 μL 5%脫脂乳稀釋的待檢血清，2個(gè)陽性對(duì)照孔加入稀釋的陽性血清，2個(gè)陰性孔加入封閉液，37 ℃孵育1 h 后棄去液體，洗滌同上；每孔加入100 μL 5%脫脂乳稀釋的MAb，37 ℃孵育1 h后棄去液體，洗滌同上；每孔加入100 μL 5%脫脂乳稀釋的HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶5 000），37 ℃孵育1 h 后棄去液體，洗滌同上；每孔加入100 μL 混合均勻的TMB 底物溶液，室溫避光反應(yīng)15 min 后每孔加入50 μL 終止液；讀取OD450nm值。阻斷率（%）計(jì)算公式：（OD450nm空白對(duì)照-OD450nm待檢血清）/（OD450nm空白對(duì)照）×100%。采用棋盤滴定法，分別對(duì)His-FliC 重組蛋白包被濃度（2 倍倍比稀釋：1∶8 μg/mL～1∶0.5 μg/mL）、MAb 稀釋度（2 倍倍比稀釋：1∶1 000～1∶64 000）、包被條件（37 ℃2 h、37 ℃2 h+4 ℃12 h、4 ℃12 h）、封閉液類型（5%脫脂乳、5% BSA），待檢血清（5 份SE 陽性鴨血清、5 份陽性雞血清、5 份陰性鴨血清、5 份陰性雞血清，分別作1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320 稀釋），以確定最佳反應(yīng)條件。

1.4.2 陰陽性臨界值的確定 采用建立的bELISA 方法檢測(cè)239 份經(jīng)凝集試驗(yàn)檢測(cè)SE 抗體陰性的鴨血清樣品。計(jì)算239 份陰性血清阻斷率的平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），利用SPSS 25.0 對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，生成Q-Q 正態(tài)分布圖，以+3s作為陰陽性臨界值。當(dāng)樣品的阻斷率≥+3s時(shí)，判為陽性，當(dāng)樣品的阻斷率＜+2s時(shí)，則判為陰性，樣品阻斷率介于+3s和+2s之間判 為 可 疑。

1.5 特異性試驗(yàn)利用建立的bELISA 方法分別檢測(cè)SE、雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、阿培依姆沙門氏菌、大腸桿菌O78、阿尼蒂斯葡萄球菌、Ⅱ型鴨疫里默氏桿菌陽性血清，每份血清重復(fù)5 次，評(píng)估該方法的特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn)使用5%脫脂乳將經(jīng)western blot 確定為SE 陽性的鴨血清分別作1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640 稀釋，采用本研究建立的bELISA 方法與IDEEX 公司ELISA 試劑盒同時(shí)檢測(cè)，評(píng)估本實(shí)驗(yàn)建立的bELISA 方法的敏感性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：選取同批次包被酶標(biāo)板，利用建立的bELISA 方法檢測(cè)5 份SE 陽性鴨血清，每份樣品重復(fù)8 次，根據(jù)每份血清樣品阻斷率計(jì)算變異系數(shù)（CV）。批間重復(fù)試驗(yàn)：選擇分8 批次包被的酶標(biāo)板，檢測(cè)5 份SE 陽性鴨血清，根據(jù)每份血清樣品阻斷率計(jì)算變異系數(shù)（CV）。

1.8 符合率檢驗(yàn)將采集的北京地區(qū)5 個(gè)肉雞場(chǎng)的105 份雞血清和3 個(gè)鴨場(chǎng)的48 份鴨血清分別利用本實(shí)驗(yàn)建立的bELISA 方法和IDEXX 公司試劑盒檢測(cè)。以試劑盒檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算該方法的敏感性（真陽性/（真陽性+假陽性））、特異性（真陰性/（真陰性+假陰性））及二者的符合率（（真陽性+真陽性）/（真陽性+假陽性+真陰性+假陰性））。

1.9 bELISA 方法的初步應(yīng)用北京鴨雛鴨感染實(shí)驗(yàn)：將25只SE抗體陰性的7日齡北京鴨雛鴨隨機(jī)分成3 組，A 組：10 只雛鴨每只皮下注射0.5 mL（107cfu）SE；B 組：10 只雛鴨每只皮下注射0.5 mL（106cfu）SE；C 組：5 只皮下注射0.5 mL 無菌PBS，從感染后第2 d 開始，每2 d 采血，分離血清。感染死亡的雛鴨剖檢觀察并分離SE，同時(shí)采用OIE 推薦的微量試管凝集試驗(yàn)（MAT）[10]檢測(cè)各組鴨血清抗體水平。

北京鴨成年鴨感染實(shí)驗(yàn)：將20 只14 周齡SE 抗體陰性的北京鴨隨機(jī)分為2 組，A 組：15 只成年鴨每只皮下注射0.5 mL（109cfu）SE；B 組：5 只成年鴨每只皮下注射0.5 mL 無菌PBS。于感染后5 d、11 d、18 d 各組分別剖殺5 只觀察組織病變，分離病原，并采血分離血清，分別采用bELISA 和MAT[10]檢測(cè)抗體。

2 結(jié) 果

2.1 FliC 蛋白原核表達(dá)、純化和鑒定結(jié)果根據(jù)4個(gè)沙門氏菌血清型FliC 蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，截取腸炎沙門氏菌FliC 蛋白高變區(qū)（aa101～aa482）。PCR 擴(kuò)增高變區(qū)基因片段，分別克隆至pET21b 和pGEX2T 載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，經(jīng)測(cè)序鑒定序列正確后進(jìn)行IPTG 誘導(dǎo)，利用western blot 檢測(cè)。結(jié)果顯示分別在52 ku（His-FliC）和70 ku（GST-FliC）處出現(xiàn)特異性條帶（圖1A）。BCA 法測(cè)得蛋白濃度分別為0.6 mg/mL（His-FliC）和3.4 mg/mL（GST-FliC）。SDS-PAGE 分析純化效果顯示兩個(gè)重組蛋白均在目的蛋白大小處出現(xiàn)條帶，His-FliC的純化效果較好，呈單一目的條帶（圖1B）。Western blot結(jié)果顯示，兩個(gè)重組蛋白均能夠與SE陽性雞血清發(fā)生特異性反應(yīng)（圖1C），具有良好的反應(yīng)原性。根據(jù)以上結(jié)果，本研究將His-FliC 作為bELISA 方法中的包被抗原，GST-FliC作為免疫原免疫小鼠，制備MAb。

圖1 重組蛋白原核表達(dá)（A）、純化（B）和鑒定（C）Fig.1 Prokaryotic expression(A),purification(B)and identification(C)of the fusion proteins

2.2 MAb 的制備及鑒定結(jié)果選取血清抗體效價(jià)為1∶64 000 小鼠制備脾細(xì)胞，利用PEG1500 進(jìn)行細(xì)胞融合，間接ELISA 方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)過3次克隆純化篩選獲得1 株雜交瘤細(xì)胞命名為1D3，MAb 亞類為IgG1，輕鏈為κ 鏈。rProtein A/G 親和層析純化小鼠腹水，輕鏈和重鏈條帶較單一，表明純化效果較好（圖2A）。Western blot 結(jié)果顯示MAb 1D3可特異性識(shí)別g,m型沙門氏菌鞭毛，但不與鼠傷寒、雞白痢、雞傷寒、阿培依姆等沙門氏菌血清型和大腸桿菌、巴氏桿菌、鴨疫里默氏桿菌、腸球菌、單增李斯特氏菌等發(fā)生反應(yīng)（圖2B），表明MAb 1D3特異性強(qiáng)。

圖2 MAb純化的SDS-PAGE（A）和western blot鑒定（B）Fig.2 SDS-PAGE purification(A)and western blot identification(B)of MAb

2.3 bELISA 方法的建立

2.3.1 bELⅠSA 方法最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果 通過棋盤法優(yōu)化結(jié)果見表1。待檢血清稀釋度優(yōu)化結(jié)果顯示，血清稀釋度為1∶10時(shí)阻斷率在60%以上，稀釋度為1∶20時(shí)阻斷率在40%以上（圖3），因此選取1∶10作為待檢血清的稀釋度[11]。

表1 阻斷ELISA反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 Optimization of working condition of blocking ELISA

圖3 待檢鴨（A）和雞（B）血清稀釋度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of test duck(A)and chicken(B)sera dilution

2.3.2 陰陽性臨界值的確定 將239 份SE FliC 蛋白抗體陰性鴨血清樣品10 倍倍比稀釋后，采用建立的bELISA 方法檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)計(jì)算該方法的阻斷率。通過單樣本Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)，得P=0.2＞0.05，表明樣品數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布（圖4），因此用該數(shù)據(jù)代表陰性血清樣品具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算得到239 份樣品阻斷率的平均值為7.70%，標(biāo)準(zhǔn)差為0.0788，因此建立的bELISA 方法的陰陽性臨界值為7.70%+3×0.07587=30.46%，即樣品阻斷率大于等于30.46%判為陽性，阻斷率小于等于7.70%+2×0.07587=22.87%的樣品判為陰性，阻斷率介于30.46%和22.87%之間的血清樣品判為可疑進(jìn)行再次檢測(cè)，若仍小于30.46%則判為陰性。

圖4 陰性血清樣本正態(tài)分布分析Fig.4 The normal distribution analysis of negative serum samples

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果采用該bELISA 方法檢測(cè)大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌等非沙門氏菌陽性血清和鼠傷寒、雞白痢等沙門氏菌血清型陽性血清，結(jié)果顯示除SE陽性血清外，其他病原陽性血清檢測(cè)均為陰性，無交叉反應(yīng)（圖5）。表明本研究建立的bELISA特異性較強(qiáng)。

圖5 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Specificity test of the bELISA method

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果將陽性血清倍比稀釋后采用建立的bELISA 方法和IDEXX 試劑盒方法同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果顯示二者檢測(cè)陽性血清最大稀釋倍數(shù)均為1∶320（圖6）。表明本研究建立的bELISA 方法敏感性較高。

圖6 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Sensitivity analysis of the bELISA method

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果批內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出變異系數(shù)為0.66%～1.81%，批間重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出變異系數(shù)為1.06%～6.25%，均小于10%（表2），表明該bELISA 方法重復(fù)性良好。

表2 bELISA重復(fù)性試驗(yàn)（n=8）Table 2 The repeatability test of the bELISA(n=8)

2.7 符合率檢驗(yàn)結(jié)果利用建立的bELISA 方法檢測(cè)105 份雞血清，結(jié)果顯示35 份血清陽性，70 份陰性；檢測(cè)48 份鴨血清，結(jié)果顯示17 份血清陽性，31份陰性。IDEXX 試劑盒檢測(cè)105 份雞血清，結(jié)果顯示38 份血清陽性，67 份血清陰性，48 份鴨血清包括18 份陽性和30 份陰性。根據(jù)以上結(jié)果計(jì)算bELISA方法的特異性為98.97%、敏感性91.07%，兩種方法符合率為96.30%（表3）。表明該bELISA 方法具有較高的特異性和敏感性，可用于臨床檢測(cè)。

表3 bELISA和IDEXX試劑盒方法比較Table 3 Comparative result of the bELISA and IDEXX kit

2.8 人工感染北京鴨血清抗體檢測(cè)7日齡北京鴨分別皮下注射感染SE 107cfu/只和106cfu/只，觀察臨床癥狀并檢測(cè)血清抗體，結(jié)果顯示，107cfu/只感染SE后7 d內(nèi)死亡7只，4 d時(shí)1只出現(xiàn)抗體反應(yīng)，8 d時(shí)3只均產(chǎn)生抗體，2周左右平均抗體滴度達(dá)到峰值（圖7A）；106cfu/只感染SE 北京雛鴨5 d 死亡1 只，6 d 時(shí)3 只出現(xiàn)抗體反應(yīng)，2周左右平均抗體滴度達(dá)到峰值（圖7B），共4 只鴨子產(chǎn)生抗體反應(yīng)。107cfu/只感染鴨子產(chǎn)生的抗體水平（1∶160）高于106cfu/只（1∶20）。MAT 檢測(cè)各組鴨血清抗體動(dòng)態(tài)變化，呈現(xiàn)與bELISA相同的變化趨勢(shì)。死亡鴨子剖檢觀察肝臟和脾臟腫大，肝臟細(xì)菌培養(yǎng)均分離獲得SE。

圖7 107 cfu/只（A）和106 cfu/只（B）SE感染后北京雛鴨血清抗體動(dòng)態(tài)變化Fig.7 Antibody dynamic changes of Peking ducklings after 107 cfu(A)and 106 cfu(B)Salmonella Enteritidis infection

成年鴨感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，109cfu/只皮下注射5 d后能夠檢測(cè)到抗體反應(yīng)，平均抗體滴度約為1∶20；感染后11 d bELISA 和MAT 測(cè)定平均抗體滴度均達(dá)到峰值，約為1∶120；感染后18 d平均抗體滴度下降至1∶60（圖8A）。感染后5 d 剖檢可見肝臟出現(xiàn)壞死點(diǎn)（2/5）（圖8B），肝臟組織病原分離結(jié)果顯示5只均攜帶SE。

圖8 SE感染后北京鴨血清抗體動(dòng)態(tài)變化（A）和病理變化（B）Fig.8 Antibody dynamic changes(A)and liver pathology(B)of Peking ducks after 109 cfu Salmonella Enteritidis infection

上述結(jié)果表明本研究建立的bELISA 方法可用于臨床SE 檢測(cè)及抗體分析。

3 討 論

SE和雞白痢沙門氏菌攜帶相同的菌體抗原，傳統(tǒng)的玻片凝集試驗(yàn)無法區(qū)分兩種血清型的陽性血清。本研究基于SE FliC蛋白制備MAb，建立SE bELISA方法用于檢測(cè)禽類血清抗體，該檢測(cè)方法適用于雞和鴨等禽類血清樣品檢測(cè)，且具有較強(qiáng)的特異性。

為避免檢測(cè)方法出現(xiàn)交叉反應(yīng)，本研究截取SE FliC 蛋白的高變區(qū)。進(jìn)一步分析SE 血清型菌株之間的序列相似性，根據(jù)GenBank 中1949 年至2020 年共25株SEfliC基因序列比對(duì)結(jié)果顯示FliC蛋白氨基酸序列完全一致，表明SEfliC基因高度保守。因此本研究分別原核表達(dá)帶有不同標(biāo)簽的融合蛋白His-FliC 和GST-FliC，用于小鼠免疫和篩選，以排除亞克隆篩選時(shí)出現(xiàn)針對(duì)標(biāo)簽蛋白的假陽性雜交瘤細(xì)胞株。

SE 能夠感染多種禽類，同時(shí)也是感染鴨子的優(yōu)勢(shì)血清型之一[12]。目前除用于雞SE 血清抗體的間接ELISA 外，市場(chǎng)上還沒有針對(duì)鴨血清抗體檢測(cè)的方法，基于MAb 的bELISA 方法相對(duì)于間接ELISA 方法穩(wěn)定性好、特異性更強(qiáng)、檢測(cè)范圍更廣。本研究建立的bELISA 方法能夠同時(shí)用于雞和鴨血清的SE 抗體檢測(cè)，擴(kuò)大了血清學(xué)調(diào)查范圍，為臨床SE 感染的防控提供技術(shù)手段。目前尚無用于沙門氏菌血清抗體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，為了評(píng)估本研究建立的bELISA方法，選取IDEXX 公司檢測(cè)試劑盒作為參照，分別檢測(cè)來自養(yǎng)殖場(chǎng)的105 份雞血清和48 份鴨血清，結(jié)果顯示其具有較高的特異性和敏感性，證明該方法可用于雞和鴨血清SE 抗體檢測(cè)。檢測(cè)雞血清得出總的SE 血清抗體陽性率約為33.33%，每個(gè)雞場(chǎng)的平均陽性率約為27%，由于檢測(cè)血清均為玻片凝集初篩陽性血清，因此陽性率較高，但是可以反映這5 個(gè)雞場(chǎng)存在SE 感染，此結(jié)果也符合這些雞場(chǎng)SE 的病原分離結(jié)果[3]。

為了進(jìn)一步分析bELISA 方法的可行性，本研究采用107cfu/只和106cfu/只兩個(gè)劑量的SE 感染北京鴨雛鴨，感染后兩個(gè)劑量均能夠引起雛鴨部分死亡，并且感染鴨肝臟可再次分離到SE。利用本實(shí)驗(yàn)建立的bELISA方法進(jìn)行血清抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示106cfu/只感染劑量?jī)H引起部分（4/9）雛鴨產(chǎn)生抗體反應(yīng)。研究表明SE 感染能夠?qū)е缕⑴KB 細(xì)胞數(shù)量下降，從而抑制抗體產(chǎn)生[13]。Zhang 等通過SE 口服感染12 周齡紹興鴨，當(dāng)感染劑量達(dá)到1011cfu/只才能產(chǎn)生抗體應(yīng)答反應(yīng)，且感染劑量達(dá)到1011cfu/只時(shí)仍有71.8%的鴨子器官無病變，且組織分離不到SE，表明紹興鴨對(duì)SE具有一定抗性[14]。結(jié)合本研究檢測(cè)結(jié)果推測(cè)北京鴨個(gè)體差異導(dǎo)致了抗體反應(yīng)的參差不齊。

綜上，本研究首次建立的SE bELISA 方法具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、敏感性高的特點(diǎn)，能夠用于禽SE 感染的血清學(xué)調(diào)查及抗體檢測(cè)，為SE 感染監(jiān)測(cè)提供快速有效的手段。