孫 偉，劉杉杉*，周 佳，王世達(dá)，王靖飛，董彥強(qiáng)

（1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動物病原與病理形態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊，黑龍江 哈爾濱 150069；3.阿壩職業(yè)學(xué)院，四川 阿壩藏族羌族自治州 623200）

豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一種DNA 病毒，屬于皰疹病毒科，α 皰疹病毒亞科成員，是引起偽狂犬?。≒seudorabies，PR）的病原體[1]。PRV 可感染多種哺乳動物，主要包括反芻動物、草食動物和嚙齒動物。研究發(fā)現(xiàn)，在基因水平上，人可能是PRV 的潛在宿主[2]，而豬是PRV 的唯一自然宿主，PRV 感染后臨床癥狀與豬群年齡密切相關(guān)[3]。近年來PRV 給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

在病毒感染過程中，病毒相關(guān)基因表達(dá)和先天抗病毒反應(yīng)體系的激活可導(dǎo)致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和能量代謝的有毒副產(chǎn)物增加[4-5]。ROS 和體內(nèi)超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）過氧化氫酶系統(tǒng)（Catalase，CAT）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和谷胱甘肽過氧化物酶體系（Glutathione peroxidase，GHS-Px）等抗氧化酶之間的不平衡會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，出現(xiàn)細(xì)胞死亡，從而引起組織和器官損傷，在此機(jī)制中線粒體對細(xì)胞凋亡信號通路的激活起重要作用[6]。線粒體是真核細(xì)胞中物質(zhì)代謝和能量代謝的主要細(xì)胞器，當(dāng)線粒體呼吸受到抑制甚至中斷后，線粒體產(chǎn)生的ROS 可直接導(dǎo)致線粒體損傷并引起細(xì)胞受損，甚至死亡[7]。ROS 和由此產(chǎn)生的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的改變成為細(xì)胞凋亡的誘因之一。現(xiàn)已證實(shí)，線粒體在細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用[8]。

研究表明，與PRV 同屬成員人單純皰疹病毒1型（Herpes simplex virus 1，HSV-1）可通過促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞ROS 生成，造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷[9]。肝臟是PRV作用的靶器官之一，其富含線粒體，PRV 對肝臟線粒體氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響尚未見報道。因此，本研究以小鼠為模型，研究PRV 對肝臟線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)因子及肝細(xì)胞凋亡的影響，為PRV 致病機(jī)理相關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料PRV-HLJ 株（MK080279.1）由中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所動物病原與病理形態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊提供，并由本實(shí)驗(yàn)室保存。6 周齡SPF級BALB/c 小鼠，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司。ROS 檢測試劑盒（88-5930-74）購自美國Thermo Fisher 公司；線粒體提取試劑盒（M0020）購自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位MitoScreen 檢測試劑盒（JC-1，551203）購自美國BD公司；2×SYBR Green PCR Mastermix（RR820A）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）購自TaKaRa 公司；組織RNA提取試劑盒（B518621）購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；T-SOD（A001-1-2）、丙二醛（Malondialdehyde， MDA）（A003-1）、GSH（A006-2）、GSH-Px（A005）和CAT（A007-1）等檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計將36 只BALB/c 小鼠隨機(jī)分成4 組（對照組18 只，3 組各時段感染組各6 只），實(shí)驗(yàn)組每只小鼠經(jīng)皮下接種200 μL（1×103TCID50/100 μL）PRV，對照組小鼠注射等量PBS 溶液。分別于感染后48 h、72 h 和96 h 迫殺對應(yīng)組小鼠，取其肝臟組織用于后續(xù)試驗(yàn)。每個時間點(diǎn)于對照組中隨機(jī)迫殺6 只小鼠取其肝臟組織，作為相應(yīng)對照。

1.3 各組小鼠肝臟線粒體ROS 水平檢測取各時間點(diǎn)各組小鼠100 mg～200 mg新鮮肝臟組織，利用線粒體提取試劑盒提取小鼠肝臟線粒體，分別吸取300 μL，利用ROS檢測試劑盒檢測各組小鼠肝臟線粒體ROS水平。

1.4 PRV 對線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)因子影響的檢測采集1.2 中各組小鼠各時間點(diǎn)肝臟組織100 mg 加入到1 mL 預(yù)冷的PBS 溶液中，采用機(jī)械研磨法制備成10%的組織勻漿，2 500 r/min 離心10 min 后，取上清液，采用相應(yīng)試劑盒檢測細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)因子MDA、SOD、GSH、GSH-Px、CAT 變化。

1.5 PRV 對線粒體膜電位影響的檢測吸取100 μL 1.3中各組小鼠各時間點(diǎn)提取的線粒體懸液，加500 μL JC-1 染色液，采用線粒體膜電位MitoScreen 檢測試劑盒測定線粒體膜電位變化，所得結(jié)果采用Kaluza2.1 軟件分析。

1.6 PRV 對氧化應(yīng)激相關(guān)酶轉(zhuǎn)錄水平影響的檢測提取1.4 各時間點(diǎn)各組小鼠肝臟勻漿總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模板，以β-actin 為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR 方法（qRT-PCR）分別檢測抗氧化物酶CAT、GSH-Px和SOD基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。qRTPCR 引物序列分別為CAT： F5'-AGGTGTTGAACGAG GAGGAGAGG-3'/R5'-AGCGTTGTACTTGTCCAGAAGA GC-3'；GSH-Px：F5'-CACAGTCCACCGTGTATGCCTT C-3'/R5'-ACCGAGCACCACCAGTCCAC-3'；SOD：F5'-ACGCCACCGAGGAGAAGTACC-3'/R5'-GCTTGATAGC CTCCAGCAACTCTC-3'。擴(kuò)增反應(yīng)體系為10 μL：2×SYBR Green 染料5 μL，各基因上下游引物0.4 μL，模板1 μL，RNAase Free 補(bǔ)加到10 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃30 s；95 ℃5 s、60 ℃30 s，40 個循環(huán)。

1.7 PRV 對肝細(xì)胞凋亡影響的檢測取1.2 中各時間點(diǎn)各組小鼠新鮮的肝臟組織，剪成1 mm3小塊，采用機(jī)械研磨法制備組織勻漿，經(jīng)300 目濾網(wǎng)過濾后，離心、重懸制成肝細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，利用Annexin-V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測PRV 對小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響。

1.8 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件中的oneway ANOVA 模塊進(jìn)行組間多重比較分析。最終結(jié)果以“±s”的形式表示。與對照組比較，*P＜0.05 表示差異顯著，**P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 PRV 對線粒體ROS 水平的影響分別于PRV感染小鼠后48 h、72 h 和96 h 采集肝臟組織，利用試劑盒檢測線粒體ROS 的生成情況，結(jié)果顯示，與對照組相比較，隨著感染時間的延長，線粒體中ROS 生成水平從均值6.01%逐漸增加至26.18%，差異極顯著（P＜0.01），并呈現(xiàn)時間依賴性（圖1）。表明PRV具有促進(jìn)潛在的誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激的作用。

圖1 PRV感染后對線粒體ROS生成的影響Fig.1 Effect of PRV infection on ROS production in mitochondria

2.2 PRV 感染對線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響利用相應(yīng)的檢測試劑盒檢測PRV 感染后各時間點(diǎn)各組小鼠線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)因子的變化情況，結(jié)果顯示，與對照組相比較，PRV極顯著促進(jìn)肝臟線粒體MDA 生成，隨著時間的延長，從1.12 nmol/mg prot升高至1.84 nmol/mg prot，差異極顯著（P＜0.01）；但肝臟線粒體中的SOD、CAT、GSH 和GHS-Px 水平均隨著感染時間的延長呈明顯下降趨勢，分別下降至58.43 U/mg prot、32.81 U/mg prot、2 047.06 μmol/g prot和409.08 μmol/g prot，與對照組比較差異極顯著（P＜0.01，圖2）。進(jìn)一步表明，PRV 可通過影響氧化應(yīng)激相關(guān)因子生成而促進(jìn)肝臟線粒體氧化應(yīng)激產(chǎn)生。

圖2 PRV感染對線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響Fig.2 Effect of PRV infection on mitochondrial oxidative stress related factors

2.3 PRV 對線粒體膜電位的影響采用線粒體膜電位MitoScreen 檢測試劑盒檢測各時間點(diǎn)小鼠線粒體膜電位的變化，結(jié)果顯示，與對照組相比較，PRV 感染小鼠肝臟線粒體膜電位平均值從2.60%逐漸增加至75.85%，差異極顯著（P＜0.01，圖3），且隨著感染時間的延長，線粒體去極化程度逐漸增強(qiáng)。表明PRV 感染可損壞線粒體正常膜電位。

圖3 PRV感染對線粒體膜電位的檢測結(jié)果Fig.3 Detection of mitochondrial membrane potential inPRV infected hepatocytes

2.4 PRV 感染對線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平的影響利用qRT-PCR 檢測各抗氧化物酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟線粒體中抗氧化物酶GHS-Px、CAT和SOD基因在轉(zhuǎn)錄水平上也呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，相對轉(zhuǎn)錄水平分別下降至0.43、0.44 和0.19，差異極顯著（P＜0.01，圖4）。進(jìn)一步表明，PRV 感染打破小鼠肝臟線粒體氧化/抗氧化系統(tǒng)平衡，誘導(dǎo)ROS 和MDA 生成，引起氧化應(yīng)激，并隨著感染時間的延長，氧化應(yīng)激程度逐漸增強(qiáng)。

圖4 PRV感染對氧化應(yīng)激相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.4 Effect of PRV infection on the transcriptional of oxidative stress related enzymes

2.5 PRV 對肝臟細(xì)胞凋亡的影響利用Annexin-V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測各組小鼠肝細(xì)胞凋亡的變化，結(jié)果顯示，與對照組比較，PRV 感染48 h 時，凋亡肝細(xì)胞中早期凋亡細(xì)胞從1.53%增加到7.21%，極顯著增加（P＜0.01），晚期凋亡細(xì)胞從5.01%增加到9.33%，差異顯著（P＜0.05，圖5），且隨著感染時間的延長，PRV 感染96 h時早、晚期凋亡的肝臟細(xì)胞分別增加至19.83%和15.24%，差異極顯著（P＜0.01）。表明PRV 可誘導(dǎo)小鼠肝臟細(xì)胞凋亡。

圖5 PRV感染后對肝細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of PRV infection on the percentage of apoptotic hepatocytes

3 討 論

PR 是一種烈性的接觸性傳染病，臨床癥狀主要以神經(jīng)癥狀、繁殖障礙為主。PRV 可造成腦、肝臟、脾臟、腎臟等實(shí)質(zhì)性器官出現(xiàn)炎癥以及壞死等病理變化，不同病毒株對臟器的損傷程度有所差異[3]。小鼠是研究PRV 常見的實(shí)驗(yàn)動物，當(dāng)PRV 感染小鼠時，PRV 進(jìn)入外周神經(jīng)元并傳播到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致腦損傷，出現(xiàn)與新生仔豬相似的臨床癥狀[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取小鼠作為PRV 動物感染模型進(jìn)行試驗(yàn)。

肝臟是PRV 作用的主要實(shí)質(zhì)器官之一，PRV 感染后肝臟主要病變?yōu)槌霈F(xiàn)微小的白色凝固性或溶解性壞死灶[10]。研究表明，PRV 激活p38 MAPK 和JNK/SAPK 信號通路，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）基因表達(dá)，并促進(jìn)TNF-α 分泌，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PRV 感染PK15 細(xì)胞后，ROS大量生成，引起DNA 損傷，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。肝臟是線粒體豐富的實(shí)質(zhì)器官，線粒體是ROS 產(chǎn)生的主要來源，同時也易受到ROS 的損傷。ROS 具有促進(jìn)脂質(zhì)過氧化生成的作用，其中MDA 是重要標(biāo)志物之一[13]。氧化劑和抗氧化物之間的失衡所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，是多種病毒感染性疾病的重要特征[14]。研究表明，HSV-1可導(dǎo)致GSH消耗，增加ROS和脂質(zhì)過氧化水平。在細(xì)胞和動物模型上均發(fā)現(xiàn)PRV同屬成員HSV-1 可通過氧化應(yīng)激引起宿主損傷[15]。本實(shí)驗(yàn)將PRV經(jīng)皮下接種小鼠后發(fā)現(xiàn)，PRV可促進(jìn)小鼠肝臟線粒體ROS 和MDA 的生成，降低非酶物質(zhì)GSH 的生成，同時下調(diào)抗氧化酶CAT、SOD、GSH-Px基因轉(zhuǎn)錄水平，表明PRV 可打破肝細(xì)胞氧化因子和抗氧化因子之間的平衡，誘導(dǎo)肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激。

研究表明，ROS 過度生成可激活線粒體依賴的細(xì)胞凋亡信號通路，促進(jìn)細(xì)胞色素C 釋放，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，引起細(xì)胞呼吸功能受損，造成能量代謝失衡，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。細(xì)胞凋亡與線粒體膜電位改變有必然的聯(lián)系，線粒體膜電位下降是細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的重要標(biāo)志性事件[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PRV 感染小鼠后其肝臟線粒體膜電位去極化程度增加，隨著感染時間的延長線粒體膜電位下降趨勢顯著；同時也發(fā)現(xiàn)早晚期凋亡的肝細(xì)胞比例顯著增加，這與線粒體膜電位以及抗氧化應(yīng)激因子降低的結(jié)果基本一致。

PRV 感染導(dǎo)致氧化應(yīng)激和DNA 損傷，從而影響促凋亡信號分子以及細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子表達(dá)[12]。氧化應(yīng)激與病毒感染導(dǎo)致的包括細(xì)胞凋亡在內(nèi)的多種細(xì)胞死亡過程有關(guān)。乙型肝炎病毒（HCV）可通過X 蛋白（HBX）C-端與線粒體結(jié)合，造成線粒體DNA 損傷，同時過表達(dá)SIRT-1 基因，促進(jìn)ROS 生成，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激生成[18-19]。丙型肝炎病毒（HBV）引起宿主細(xì)胞線粒體損傷和氧化應(yīng)激，受損傷線粒體通過細(xì)胞自噬依賴的途徑方式被清除[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，PRV-HLJ 株可引起小鼠肝臟線粒體氧化應(yīng)激，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡以及線粒體膜電位降低。胡薇等發(fā)現(xiàn)，PRV Bartha 株在促進(jìn)小鼠腦組織促炎性細(xì)胞因子生成的同時，上調(diào)表達(dá)LMP2、LMP7 和LMP10 等免疫相關(guān)的蛋白酶亞基[21]。PRV GXLB-2013 株感染小鼠后，腦、脾臟和肺臟均出現(xiàn)了炎性反應(yīng)，并促進(jìn)免疫器官指數(shù)、ROS 和NO 水平升高，活化COX-2和iNOS 因子，促進(jìn)IL-1β 等在主要促炎性細(xì)胞因子生成[4]。由此表明，PRV 引起免疫反應(yīng)與機(jī)體組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)存在一定的聯(lián)系，而具體機(jī)制尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。

有關(guān)PRV 致病機(jī)理的研究尚未完全明確，而線粒體在受到病毒攻擊后導(dǎo)致ROS 過度生成引起的氧化應(yīng)激，這與PRV 感染后機(jī)體組織損傷密切相關(guān)。本研究以小鼠為模型動物，從PRV 對肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)因子及細(xì)胞凋亡的影響為切入點(diǎn)，首次證實(shí)PRV 感染可導(dǎo)致宿主肝臟線粒體氧化應(yīng)激，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。本研究對進(jìn)一步探究PRV 致肝臟損傷及其致病機(jī)理提供一定的科學(xué)數(shù)據(jù)。