劉 暢，張雪佳，王利麗，白和平，王 苗，李 浩，劉勃興，史秋梅，吳同壘，張志強(qiáng)

（河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066004）

沙門菌（Salmonella）為革蘭氏陰性腸道致病桿菌，常通過污染飲食引起人畜急性和慢性感染，臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、傷寒、甚至敗血癥[1-2]。沙門菌主要通過消化道感染，在回腸遠(yuǎn)端經(jīng)上皮細(xì)胞侵染黏膜下層的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等具有吞噬活性的細(xì)胞，完成增殖并造成感染擴(kuò)散。沙門菌感染的重要前提在于其能夠抵御消化道極端pH 環(huán)境的殺傷、宿主細(xì)胞的活性氧殺傷以及機(jī)體極端的營(yíng)養(yǎng)缺乏等環(huán)境應(yīng)激[3]，因此抗應(yīng)激能力與沙門菌的致病性密切相關(guān)。沙門菌有多個(gè)毒力因子被證實(shí)與環(huán)境應(yīng)激相關(guān)，其中yihE 是腸桿菌科細(xì)菌的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶[4]。在對(duì)大腸桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)yihE 能夠調(diào)控MazEF 毒素-抗毒素來保護(hù)細(xì)菌免受內(nèi)環(huán)境微生物的侵襲，yihE 蛋白和細(xì)菌內(nèi)部的活性氧（ROS）級(jí)聯(lián)介導(dǎo)大腸桿菌耐受活性氧應(yīng)激，yihE基因的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌程序性死亡（PCD）[5]；yihE 蛋白受到細(xì)菌內(nèi)部雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)（CPX）的部分調(diào)節(jié)，該系統(tǒng)和MazEF 毒素、超氧化物一起對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生保護(hù)或者破壞作用，yihE 蛋白在其中起主要的調(diào)節(jié)作用[6-10]。

有研究利用DNA array 方法研究yihE 功能，發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠調(diào)控沙門菌多達(dá)100 多種蛋白的表達(dá)，表明該蛋白是沙門菌重要的功能調(diào)控蛋白[4,8]?；趛ihE 在抗環(huán)境應(yīng)激和蛋白表達(dá)調(diào)控上的重要作用，推測(cè)該蛋白可能與沙門菌的致病過程密切相關(guān)，因此本研究通過構(gòu)建腸炎沙門菌yihE基因缺失株和回補(bǔ)菌株分析yihE 對(duì)沙門菌的生物學(xué)特性的作用，為沙門菌致病機(jī)制的研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及主要試劑質(zhì)粒pKD3、pKD46、pCP20 由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)康元環(huán)教授惠贈(zèng)；腸炎沙門菌參考菌株C50336購(gòu)自中國(guó)菌種保藏中心，由本研究室保存；pBR322質(zhì)粒由揚(yáng)州大學(xué)朱國(guó)強(qiáng)教授惠贈(zèng)。

ID32E 試紙條為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品。細(xì)菌RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶及T4 連接酶均購(gòu)自NEB 公司；剛果紅、考馬斯亮藍(lán)、熒光增白劑、瓊脂糖DNA 回收試劑盒均購(gòu)自Tiangen 公司。

1.2λ-Red 同源重組引物的設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI 中登錄的腸炎沙門菌基因組序列（CP023475.1）設(shè)計(jì)引物（表1），P1/P2 用于擴(kuò)增打靶片段，由兩部分組成，5' 端加下劃線的部分與待敲除基因序列同源，3' 端未加下劃線部分與氯霉素抗性基因cat 兩側(cè)序列互補(bǔ)， P3/P4 引物位于yihE基因開放閱讀框外側(cè)，用于缺失株的鑒定。所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 PCR引物信息Table 1 PCR primer information

1.3 沙門菌C50336△yihE基因缺失株、回補(bǔ)株的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[11]，利用λ-Red 同源重組方法對(duì)yihE基因進(jìn)行敲除。首先將pKD46 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入C50336后用（P1/P2）引物擴(kuò)增pKD3質(zhì)粒，將擴(kuò)增產(chǎn)物電轉(zhuǎn)入含pKD46 質(zhì)粒的C50336，獲得了含Cat 基因的缺失株，然后將pCP20 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入含Cat 基因的菌株中，以消除Cat 基因，獲得了含pCP20 質(zhì)粒的缺失株。然后將含pCP20 質(zhì)粒的缺失株在42 ℃水浴5 h～6 h 后獲得在LB 平板上生長(zhǎng)，而不在含氨芐抗性的LB 板上生長(zhǎng)的菌株，則為yihE基因缺失菌株C50336 ΔyihE（KO），對(duì)該菌株利用PCR 方法（P3/P4）鑒定。

利用煮沸裂解法提取C50336 的基因組作為模板，采用（P5/P6）引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物與pBR322 質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切并連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，即獲得含pBR322-yihE質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定的陽性重組子由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證無移碼錯(cuò)位突變后，提取pBR322-yihE質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化至C50336ΔyihE菌株中，利用（P3/P4）引物進(jìn)行PCR鑒定無誤后即獲得yihE基因回補(bǔ)株C50336ΔyihE/pBR322-yihE（RS）。

1.4 各菌株生長(zhǎng)特性的檢測(cè)參考文獻(xiàn)[12]，將C50336 菌株（WT）、KO 菌株、RS 菌株分別接種至LB、LBA液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)過夜。次日將各菌株稀釋至同一OD600nm值后，分別按1∶100 分別在LB、M9 液體培養(yǎng)基37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔1 h吸取菌液，測(cè)定其OD600nm值，繪制其生長(zhǎng)曲線，分析各菌株生長(zhǎng)特性。

1.5 各菌株運(yùn)動(dòng)能力的檢測(cè)參照文獻(xiàn)[13]方法，分別將WT、KO、RS 菌株接種至LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日各取5 μL 菌液，穿刺接種半固體培養(yǎng)基平板的中心部位，避免劇烈晃動(dòng)，37 ℃正置培養(yǎng)6 h 后，測(cè)量各菌株的運(yùn)動(dòng)直徑，分析其運(yùn)動(dòng)能力，并重復(fù)試驗(yàn)3 次。

1.6 各菌株抗環(huán)境應(yīng)激能力的檢測(cè)參考文獻(xiàn)[14]，將WT、KO、RS 菌株分別在LB、LBA 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600nm值為1 時(shí)，按1∶100 的比例轉(zhuǎn)接到具有酸性應(yīng)激（pH4.0）、堿性應(yīng)激（pH10.0）、氧化應(yīng)激（10 mmoL/L H2O2）、熱應(yīng)激（42 ℃）、鐵饑餓條件（200 μmmoL/L 2.2-聯(lián)砒啶）、硝化應(yīng)激（50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L NaNO2）的條件下培養(yǎng)1 h，之后對(duì)其稀釋、滴板計(jì)數(shù)，計(jì)算各菌株生存率，分析各菌株抗環(huán)境應(yīng)激能力。

1.7 各菌株生化特性的檢測(cè)分別將WT、KO、RS菌株接種至LB、LBA 液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜后PBS 洗滌兩次，以每孔50 μL 加入ID32E 試紙條孔中，并在另外7 個(gè)孔內(nèi)加入一滴礦物油，于濕盒內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h，在0.0 孔滴加JAMES 試劑，檢測(cè)各菌株的吲哚反應(yīng)。

1.8 各菌株生物被膜（BF）形成能力及其組分變化的檢測(cè)參照文獻(xiàn)[15]，通過試管法和96 孔板微量法（OD570nm）分別檢測(cè)WT、KO、RS 菌株的BF 形成能力。同時(shí)為了分析各菌株BF 的成分變化，將各菌株接種至剛果紅（160 mg/L 剛果紅、10 mg/L 考馬斯亮藍(lán)）培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h，通過觀察菌落狀態(tài)和顏色來分析BF 的形成能力；另外參照文獻(xiàn)[16]，將各菌株分別接種于含有熒光增白劑（200 mg/L）的培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h，在366 nm 的紫外線下比較菌落熒光強(qiáng)弱，分析各菌落BF 纖維素的含量。

1.9 各菌株耐藥性檢測(cè)參照CLSI 試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，利用K-B 紙片法檢測(cè)WT、KO、RS 菌株對(duì)各抗生素的敏感性。

1.10 各菌株毒力因子的檢測(cè)利用細(xì)菌RNA 提取試劑盒提取WT、KO 菌株的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模板，參照文獻(xiàn)[23,24,25]，利用RT-qPCR方法檢測(cè)各菌株毒力基因invH、pipB、hflk、sopB、orf245、sipB、ompB、mrrl、rpos、ssrA、ssaV、qbcsa、sodC、tatA、rfbH、spvB、prot6E、fimD、mgtC、qcsgd、qcsga、sipA、flgG、XthA的轉(zhuǎn)錄水平。

1.11yihE基因缺失株致病力試驗(yàn)將55 只BALB/c小鼠隨機(jī)均分為11 組，每組5 只，其中1～5 組為WT菌株感染組，6～10 組為KO 菌株感染組，第11 組為對(duì)照組。將37 ℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜的各菌株用等量的無菌PBS 洗滌后3 500 r/min 離心5 min，棄上清，PBS 洗滌3 次，平板計(jì)數(shù)，調(diào)整為同一濃度后梯度稀釋，各稀釋度按分組以200 μL/只感染，對(duì)照組小鼠注射等量的無菌PBS，記錄14 d 實(shí)驗(yàn)組小鼠存活數(shù)量，無菌摘除死亡小鼠的肝臟和脾臟，分別在SS 固體平板劃線驗(yàn)證，參照文獻(xiàn)[17]，利用寇氏法計(jì)算WT、KO 菌株的半數(shù)致死量（LD50），分析各菌株致病力。

1.12 突變后的yihE 的活性檢測(cè)有研究結(jié)果顯示，yihE 蛋白217 位天冬氨酸是其關(guān)鍵的活性位點(diǎn)，突變?cè)撐稽c(diǎn)的氨基酸有可能導(dǎo)致該蛋白酶失活[4]。因此本研究采用水煮法以腸炎沙門菌C50336 全基因?yàn)槟０?，分別利用P5/P7，P6/P8引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物后各取1 μL 為模板，采用引物P5/P6 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收后與pET-28a 16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化E. coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證基因突變后，按常規(guī)方法誘導(dǎo)表達(dá)突變蛋白yihEA217G。將表達(dá)后的蛋白進(jìn)行Ni柱純化、透析后，利用蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白激酶活性的檢測(cè)。同時(shí)采用引物P5/P6 PCR 擴(kuò)增C50336 菌株yihE基因，按上述方法鑒定并表達(dá)yihE 后作為陽性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 腸炎沙門菌C50336△yihE、 C50336△yihE/pBR322-yihE的構(gòu)建利用同源重組的方法將腸炎沙門菌C50336 中的yihE基因缺失，獲得基因缺失株C50336ΔyihE和基因回補(bǔ)株C50336ΔyihE/pBR322-yihE。各菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果顯示，野生株、基因缺失株和回補(bǔ)株擴(kuò)增片段分別約為1 700 bp、1 100 bp 和1 700 bp，與預(yù)期一致（圖1），表明已正確構(gòu)建腸炎沙門菌缺失株C50336ΔyihE和回補(bǔ)株C50336ΔyihE/pBR322-yihE。

圖1 腸炎沙門菌C50336ΔyihE及其回補(bǔ)株的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of Salmonella enteritidis C50336 yihE gene deletion strain and complementary strain

2.2 各菌株生長(zhǎng)特性的檢測(cè)將WT、KO、RS 菌株分別在LB、M9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后檢測(cè)OD600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，3株菌在LB（圖2A）、M9（圖2B）液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度均無明顯差異。表明yihE的缺失對(duì)腸炎沙門菌的生長(zhǎng)速率無影響。

圖2 各菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果Fig.2 Test results of growth curves of strains to be tested

2.3 各菌株運(yùn)動(dòng)能力的檢測(cè)將WT、KO、RS 菌株通過分別接種半固體培養(yǎng)基檢測(cè)其運(yùn)動(dòng)能力，結(jié)果顯示，WT、KO、RS 菌株的運(yùn)動(dòng)直徑分別為1.8±0.2 cm、1.6±0.2 cm、2.2±0.2 cm，各菌株之間差異不顯著（圖3）。表明yihE基因缺失不影響腸炎沙門菌的運(yùn)動(dòng)能力。

圖3 各菌株運(yùn)動(dòng)能力的測(cè)定Fig.3 Determination of the motility of the strains to be tested

2.4 各菌株抗環(huán)境應(yīng)激能力的檢測(cè)將WT、KO、RS 菌株在各種應(yīng)激條件下培養(yǎng)，檢測(cè)各菌株生存率，結(jié)果顯示，KO 菌株在各種條件下的耐受能力比WT、RS 菌株有極顯著的下降（P＜0.01 或P＜0.001，圖4），表明yihE 參與和調(diào)控沙門菌對(duì)抗酸性應(yīng)激、堿性應(yīng)激、鐵饑餓條件、熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激、硝化應(yīng)激。

圖4 環(huán)境應(yīng)激對(duì)各菌株存活率的影響Fig.4 The influence of environmental stress on the survival rate of tested strains

2.5 各菌株生化鑒定結(jié)果利用ID32E 試紙條測(cè)定WT、KO、RS 菌株的生化特性，結(jié)果顯示，與WT、RS 菌株相比，KO 菌株參與腸炎沙門菌對(duì)半乳糖酸鹽的利用，影響沙門菌葡萄糖苷酶、葡萄糖醛酸酶的表達(dá)，這些生化指標(biāo)均與生物體糖代謝相關(guān)。表明yihE 可能參與腸炎沙門菌的糖代謝過程。

2.6 BF 形成能力的檢測(cè)將WT、KO、RS 菌株經(jīng)試管法和96 孔板微量法檢測(cè)BF 形成能力，試管法定性檢測(cè)結(jié)果顯示，相對(duì)于WT、RS 菌株，KO 菌株在氣液交界處形成的BF 明顯少于野生株（圖5A）；96 孔板定量檢測(cè)（570 nm）結(jié)果顯示，相對(duì)于WT、RS 菌株，KO 菌株的BF 的形成能力下降了約50%（圖5B）。表明yihE 參與腸炎沙門菌的BF 形成機(jī)制。

將WT、KO、RS菌株接種剛果紅瓊脂板，觀察菌落的生長(zhǎng)形態(tài)和顏色，結(jié)果顯示，WT、KO、RS 均能夠在剛果紅的瓊脂板上形成粗糙的帶有明顯褶皺的紅色菌落（圖5C），表明yihE基因缺失不能降低腸炎沙門菌BF 成分中卷毛蛋白的形成。

將WT、KO、RS 菌株接種含熒光增白劑的瓊脂板，在366 nm 的紫外線下觀察菌落的熒光情況，結(jié)果顯示，WT 和KO 菌株的熒光發(fā)光強(qiáng)度均一致（圖5D），表明yihE基因缺失不能降低腸炎沙門菌BF 成分中纖維素的合成。

圖5 各菌株BF的形成及成分分析Fig.5 The formation and composition analysis of the biofilm of the strain to be tested

2.7 各菌株耐藥性檢測(cè)利用K-B 紙片法檢測(cè)WT、KO、RS 菌株的耐藥情況。結(jié)果顯示，在內(nèi)酰胺類藥物中，KO、RS 菌株對(duì)頭孢曲松的敏感性增加，且抑菌圈直徑也比WT 菌株的大；在喹諾酮類藥物中，KO 菌株比WT、RS 菌株藥物敏感性強(qiáng)，且抑菌圈直徑也比WT、RS 菌株的大；而對(duì)于其他測(cè)試的抗生素的敏感性基本保持一致。表明yihE 能夠影響腸炎沙門菌對(duì)喹諾酮類、頭孢曲松藥物的敏感性。

2.8 各菌株毒力因子的檢測(cè)利用RT-qPCR 定量檢測(cè)WT 和KO 菌株的毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，在檢測(cè)的24 個(gè)毒力基因中，KO 菌株與WT 菌株相比，大部分毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平有所上升，小部分毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平下降，二者上調(diào)程度的差異性均基本相同，其中csgA、bscA、flgG、sipB、sodc基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)或下調(diào)差異極顯著（P＜0.001），其他毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平差異較?。▓D6）。可見yihE通過相對(duì)表達(dá)量的變化間接調(diào)控細(xì)菌的致病機(jī)制，表明yihE 是一種影響腸炎沙門菌毒力的多功能蛋白。

圖6 RT-qPCR檢測(cè)yihE基因缺失對(duì)腸炎沙門菌毒力基因的影響Fig.6 RT-qPCR detection of effects of yihE gene deletion on virulence factors of S.enteritidis

2.9yihE基因缺失株致病力試驗(yàn)將WT 和KO 菌株分別感染BABL/c 小鼠，觀測(cè)記錄14 d 內(nèi)的死亡數(shù)量。結(jié)果顯示，WT 和KO 菌株感染組均陸續(xù)出現(xiàn)死亡，而對(duì)照組未出現(xiàn)死亡。無菌采集死亡小鼠肝臟、脾臟樣品于SS 平板上劃線，呈現(xiàn)沙門氏菌典型菌落。根據(jù)寇式法計(jì)算各組LD50，WT 株LD50為1.2×105cfu，KO 菌株LD50為1.12×106cfu，與WT 株相比，KO 菌株毒力降低了約10 倍。表明yihE基因缺失后影響腸炎沙門菌致病力。

2.10 突變后的yihE 活性檢測(cè)結(jié)果利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)yihE 及217 位天冬氨酸突變的突變體蛋白yihEA217G。利用商品化試劑盒對(duì)表達(dá)純化的yihE及yihEA217G進(jìn)行激酶活性分析，結(jié)果顯示，與yihE比較，yihEA217G的激酶活性下降了約30%（圖7）。表明將yihE基因突變后降低了其激酶活性。

圖7 蛋白激酶活性的檢測(cè)Fig.7 Determination of protein kinase activity

3 討 論

沙門菌難以控制的主要原因是其能夠在細(xì)胞內(nèi)寄生，使機(jī)體長(zhǎng)期帶菌，持續(xù)感染[18]。而沙門菌在胞外和胞內(nèi)感染過程中要遭遇各種應(yīng)激殺傷，對(duì)這些應(yīng)激條件的抵御對(duì)于其感染至關(guān)重要。yihE 參與細(xì)菌的蛋白表達(dá)調(diào)控，因此本研究圍繞其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，探索該蛋白在沙門菌致病中的作用。

本研究構(gòu)建了腸炎沙門菌yihE基因缺失株、回補(bǔ)株，并對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，缺失株在LB 和M9 液體培養(yǎng)基中并沒有因缺失yihE基因而影響其生長(zhǎng)，和野生株、回補(bǔ)株的生長(zhǎng)曲線大致相當(dāng)。說明yihE基因的缺失并不影響腸炎沙門菌的生長(zhǎng)能力，這與已報(bào)道研究結(jié)果[19]相一致。

yihE 蛋白在大腸桿菌中參與調(diào)控能量代謝和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的100 多個(gè)基因的表達(dá)[4]，因此本研究模擬了酸性應(yīng)激、堿性應(yīng)激、氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激、硝化應(yīng)激、鐵饑餓等多種應(yīng)激條件，評(píng)估yihE在腸炎沙門菌抗應(yīng)激的作用，結(jié)果表明yihE基因的缺失使細(xì)菌抗應(yīng)激能力均有不同程度的下降，證明了yihE基因能夠調(diào)控細(xì)菌的應(yīng)激能力。

在細(xì)菌侵入機(jī)體的過程中，細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力的強(qiáng)弱對(duì)沙門菌是否能夠到達(dá)特定部位起著關(guān)鍵作用。但本研究發(fā)現(xiàn)野生株、yihE基因缺失株、回補(bǔ)株的運(yùn)動(dòng)能力沒有下降，有可能該基因?qū)?xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力影響很小，或者還有其他方面影響其運(yùn)動(dòng)能力，后續(xù)本研究室將進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行研究和確認(rèn)。

細(xì)菌的BF 是細(xì)菌免受外界惡劣環(huán)境影響、侵入宿主細(xì)胞、并在機(jī)體內(nèi)傳播和能夠持續(xù)性感染的一種重要的結(jié)構(gòu)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)yihE基因缺失后能夠使腸炎沙門菌BF 的形成能力下降，但構(gòu)成BF 的重要成分卷毛蛋白和纖維素未受影響，推測(cè)可能是因?yàn)閥ihE基因缺失后影響了沙門菌I 型菌毛的能力[21]，繼而影響了細(xì)菌BF 的形成能力。

同時(shí)通過對(duì)腸炎沙門菌野生株、缺失株、回補(bǔ)株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)yihE基因缺失后能使腸炎沙門菌對(duì)喹諾酮類抗生素的敏感性增強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)許多致死性的抗菌藥物，尤其是喹諾酮類藥物，似乎是通過羥基的自由基作用殺死細(xì)菌[22]，而羥自由基屬于ROS，因此推測(cè)yihE可能通過調(diào)控ROS 來保護(hù)細(xì)菌。本研究發(fā)現(xiàn)缺失株、回補(bǔ)株對(duì)內(nèi)酰胺類藥物的頭孢曲松敏感性均增加，且缺失株對(duì)其敏感性比野生菌株更高。同時(shí)通過對(duì)其生化指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，d-半乳糖酸鹽同化（GAT）、β-葡萄糖醛酸酶（βGUR）、α-葡萄糖苷酶（αGLU）這3 種生化指標(biāo)均與野生菌株有所不同，說明yihE基因缺失后有可能導(dǎo)致了腸炎沙門菌糖代謝能力改變，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

檢測(cè)腸炎沙門菌野生株、缺失株菌株毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)yihE基因參與腸炎沙門菌的感染過程。在檢測(cè)的毒力基因中，主要分為3 種：參與細(xì)菌生物代謝，調(diào)節(jié)群體感應(yīng)系統(tǒng)且影響沙門菌胞內(nèi)存活機(jī)制的基因有ssrA、rpoS、sopB、ssaV、bscA、tatA、prot6E、xthA和sipA[23]；抵抗宿主防御機(jī)制、參與細(xì)菌聚集特性、抵抗高鹽酸堿度和對(duì)環(huán)境脅迫抵抗力的調(diào)控且利于菌體在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存的基 因 有mrr1、ompR、sipB、orf245、hflk、pipB、rfbH、spvB和mgtC[24]；參與細(xì)菌BF 的形成、運(yùn)動(dòng)性、粘附性且利于腸炎沙門菌在禽體內(nèi)垂直傳播的基 因有：invH、sodC、fimD、flgG、csgA、csgD[25]，以上毒力基因除csgA、bscA、flgG、sipB、sodc外，其他毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平差異均較小或基本一致。參與BF 形成的毒力基因sodC、flgG在KO 菌株中的轉(zhuǎn)錄水平有所提高，但csgA的轉(zhuǎn)錄水平下降。結(jié)合本研究前述缺失株BF 的重要成分卷毛蛋白和纖維素?zé)o變化，推測(cè)毒力基因invH、sodC、fimD、flgG、csgD影響著卷毛蛋白和纖維素，雖然sodC、flgG基因的轉(zhuǎn)錄水平有所提高，但對(duì)卷毛蛋白和纖維素的形成能力無影響。而csgA基因有可能影響B(tài)F 的其他組分或者有其他毒力基因、其他方面影響著BF 的組分；或者是由于剛果紅平板和含熒光增白劑瓊脂板測(cè)定BF 僅為定性檢測(cè)，卷毛蛋白和纖維素的減少并不能從外觀看出。bscA、sipB基因是影響沙門菌在胞內(nèi)存活和在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存的毒力基因，其轉(zhuǎn)錄水平在KO 株中明顯比WT 菌株高，推測(cè)yihE缺失有可能會(huì)影響其在胞內(nèi)和巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)腸炎沙門菌yihE基因缺失后，雖然大部分的毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平有所上升，但yihE缺失株對(duì)小鼠的LD50上升了約10 倍，其毒力有所下降。

另外本研究通過測(cè)定yihE 蛋白和突變yihEA217G的激酶活性，發(fā)現(xiàn)突變蛋白yihEA217G的激酶活性下降了約30%。表明yihE通過其他毒力基因影響腸炎沙門菌致病力。在大腸桿菌的研究中，證實(shí)第217 位天冬氨酸是yihE 蛋白酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)[4]，對(duì)比大腸桿菌和沙門菌yihE蛋白氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)該蛋白在兩種菌中高度保守，因此推測(cè)第217 位天冬氨酸對(duì)沙門菌yihE同樣十分關(guān)鍵，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。

綜上所述，本研究首次驗(yàn)證了yihE基因參與腸炎沙門菌的生物學(xué)過程，并且證實(shí)yihE基因的缺失能夠使腸炎沙門菌的毒力下降，該結(jié)果為進(jìn)一步研究沙門菌致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。