孫娜 徐蕾 隋文靜 李寒 曹益國 孫慧君 李忠海, 5 田康,5 石志華 徐鋼,5*

1. 大連市第三人民醫(yī)院，遼寧 大連 116091

2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 大連 116011

3. 大連市公共衛(wèi)生臨床中心，遼寧 大連 116001

4. 大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116044

5. 遼寧省骨相關(guān)疾病修復(fù)重塑分子機(jī)制重點(diǎn)實驗室，遼寧 大連 116011

骨質(zhì)疏松癥常易導(dǎo)致骨折，致殘和致死率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為重要的全球性健康防治課題之一[1]。中藥地黃具有滋陰養(yǎng)血、益精填髓等功效，作為中醫(yī)臨床常用藥之一，常常組方用于防治骨質(zhì)疏松癥[2-5]。梓醇(catalpol)是中藥地黃的主要活性成分之一，2020版中國藥典中以梓醇和毛蕊花糖苷作為地黃的鑒別內(nèi)容，以梓醇和地黃苷D作為含量測定內(nèi)容[6]。梓醇是一種環(huán)烯醚萜類化合物(圖1)，具有抗炎和抗氧化等藥理活性，能夠發(fā)揮一定的抗抑郁、改善認(rèn)知和保護(hù)腦細(xì)胞作用，降血糖和改善糖尿病并發(fā)癥，抗腫瘤和保護(hù)心血管系統(tǒng)等[7]?，F(xiàn)將梓醇防治骨質(zhì)疏松癥方面的研究歸納總結(jié)，為深入挖掘其抗骨質(zhì)疏松作用和發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)提供借鑒。

1 梓醇抗骨質(zhì)疏松作用的體內(nèi)實驗研究

在顱骨缺損的6周雄性SD大鼠中，搭載梓醇和經(jīng)梓醇干預(yù)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的水凝膠支架能夠顯著提升其骨愈合能力[8]。此外，在卵巢切除8周雌性SD大鼠中，每天腹腔注射10 mg/kg梓醇，持續(xù)8周，能夠減少骨丟失，增加骨小梁數(shù)量[8]。在卵巢切除聯(lián)合顱骨缺損的12周雌性SD大鼠中，每天腹腔注射10 mg/kg梓醇，持續(xù)8周，能夠促進(jìn)骨再生和血管形成[9]。在高脂飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)8周雌雄各半Wistar大鼠糖尿病骨質(zhì)疏松模型中，含有梓醇等的熟地黃可以調(diào)節(jié)血清堿性磷酸酶(ALP)活性和骨鈣素(OCN)水平，提高骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)[10]。在高脂飼料聯(lián)合STZ誘導(dǎo)7周雄性ICR小鼠糖尿病骨質(zhì)疏松模型中，每天分別灌胃梓醇30、90 mg/kg，持續(xù)12周，能夠減少骨小梁結(jié)構(gòu)的退行性改變，從而顯著改善骨小梁惡化，影響ALP、I型膠原蛋白和OCN等骨形成標(biāo)志物水平以及OPG/RANKL水平[11]。

在尼古丁誘導(dǎo)5周雄性Wistar大鼠牙槽骨損傷模型中，皮下注射2 μg/kg梓醇，持續(xù)14 d，能夠減少骨質(zhì)流失，影響ALP、OCN和TNF-α等水平[12]。在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠骨質(zhì)疏松模型中，每天分別經(jīng)腹腔注射10 、30 mg/kg梓醇，持續(xù)7 d，均可以減少骨丟失，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色顯示梓醇顯著抑制過度的破骨細(xì)胞形成[13]；在卵巢切除8周雌性C57BL/6中，每天分別經(jīng)腹腔注射10 、30 mg/kg梓醇，持續(xù)6周，可緩解破骨細(xì)胞過度形成，高劑量梓醇顯著降低血清CTX-1水平[13]。在卵巢切除8周雌性BALB/c小鼠和14個月雌性自然衰老BALB/c小鼠中，脾細(xì)胞中Th1/Th2比值均明顯增大，與骨密度呈負(fù)相關(guān)；在前者模型中，灌胃梓醇可以顯著增加骨密度，并且呈劑量依賴性[14]。而且，梓醇并未升高血清雌激素水平，而顯著降低血清CTX-I水平，并且呈劑量依賴性，說明可能與抑制破骨細(xì)胞功能有關(guān)[14]。此外，灌胃梓醇后小鼠脾細(xì)胞中Th1細(xì)胞比例下降，而Th2細(xì)胞比例上升，而且，梓醇調(diào)節(jié)Th1/Th2比例也呈劑量依賴性。進(jìn)一步地，梓醇對調(diào)節(jié)Th1/Th2亞群比例的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)作用也呈劑量依賴性[14]，這可能是梓醇發(fā)揮骨保護(hù)作用的分子機(jī)制之一。

筆者通過上述文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)研究方面，大鼠[8-10,12]、小鼠[11,13-14]、雄性[8,10-13]、雌性[8-10,13-14]等動物研究對象和顱骨缺損[8-9]、卵巢切除[8-9,13-14]、高脂飼料聯(lián)合STZ[10-11]、尼古丁誘導(dǎo)[12]、LPS誘導(dǎo)[13]等造模方法的實驗結(jié)果均顯示梓醇具有抗骨質(zhì)疏松作用。梓醇對于卵巢切除和糖尿病等常見骨質(zhì)疏松模型均發(fā)揮防治作用，說明其可用于治療高轉(zhuǎn)換型和低轉(zhuǎn)換型等不同類型的骨質(zhì)疏松癥，這可能與其多靶點(diǎn)的作用機(jī)制有關(guān)，體內(nèi)作用機(jī)制仍待進(jìn)一步深入研究。

2 梓醇抗骨質(zhì)疏松作用的體外實驗研究

2.1 梓醇對于BMSCs的影響

在SD大鼠BMSCs中，梓醇25、50、100 μmol/L 作用24 h或者10、25、50、100 μmol/L 作用48 h均顯著促進(jìn)增殖；此外，梓醇50 μmol/L或100 μmol/L增強(qiáng)了ALP活性，而且茜素紅染色也驗證了促成骨活性[9]，該作用可能與激活JAK2/STAT3軸有關(guān)[9]。在SD大鼠BMSCs中，梓醇促進(jìn)細(xì)胞增殖和成骨分化，最佳濃度分別為1.0 mg/L和2.0 mg/L，梓醇促進(jìn)向成骨細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化后的成骨細(xì)胞成熟，上調(diào)Runx2 和OCN表達(dá)，增加ALP 的分泌沉積。該作用可能與Wnt信號通路激活有關(guān)[15]；類似地，10、50 、250 μmol/L梓醇并不影響增殖，而三個濃度均增加ALP活性且三者間無顯著性差異，50 μmol/L和250 μmol/L的梓醇可以顯著增強(qiáng)茜素紅染色[8]。進(jìn)一步，梓醇增加成骨分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，且被初步證實與激活Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)[8]。在SD大鼠BMSCs中，梓醇0.05 mg/L～10 mg/L均促進(jìn)增殖，其中濃度1.0 mg/L作用最強(qiáng)；當(dāng)濃度大于等于20 mg/L時，梓醇對增殖能力無明顯影響。梓醇0.2～100 mg/L均可以增強(qiáng)ALP 活性，其中濃度2.0 mg/L組ALP活性顯著高于其它組。梓醇0.2、1.0、2.0、20 mg/L均可以增加礦化結(jié)節(jié)數(shù)量，促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟[16]。在SD大鼠BMSCs中，不同濃度的梓醇促進(jìn)了增殖；1×10-5mol/L～ 1×10-3mol/L梓醇可以誘導(dǎo)成骨分化，1×10-4mol/L為最佳濃度；梓醇還可以增加ALP活性、礦化結(jié)節(jié)數(shù)目和OCN含量；該作用機(jī)制可能與Hedgehog信號通路有關(guān)[17]。

2.2 梓醇對于成骨細(xì)胞的影響

在MC3T3-E1中，梓醇1×10-9mol/L～1×10-7mol/L促進(jìn)增殖；梓醇1×10-6mol/L ～1×10-5mol/L增強(qiáng)ALP和OCN活性，促進(jìn)鈣化[18]；在SD大鼠成骨細(xì)胞中，梓醇1×10-3、1×10-5、1×10-7、1×10-9mol/L均促進(jìn)增殖。ALP活性顯示高濃度梓醇顯著促進(jìn)成骨分化，具有量效關(guān)系。不同濃度梓醇均顯著增強(qiáng)OCN活性[19]。

在MC3T3-E1中，梓醇在很高濃度條件下，細(xì)胞活力未被抑制。不同時間點(diǎn)不同濃度的梓醇均未明顯促進(jìn)增殖。梓醇濃度達(dá)到500 mg/L時，明顯升高ALP 活性，且促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)形成[20]。在以成骨細(xì)胞為色譜膜源篩選六味地黃湯中抗骨質(zhì)疏松活性成分的實驗中，對于親和強(qiáng)度以及含量較高的梓醇進(jìn)行了體內(nèi)外藥效驗證，驗證了梓醇(1.0、10 μmol/L)顯著促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞增殖，且提高骨質(zhì)疏松斑馬魚模型的頭部骨礦化面積[21]。類似地，通過成骨細(xì)胞膜色譜/質(zhì)譜法快速篩選了六味地黃煎劑含藥血清中的成骨活性成分，梓醇等四者(濃度均為0.1 μmol/L)均能顯著促進(jìn)MC3T3-E1增殖和ALP染色[22]。

2.3 梓醇對于高糖造模成骨細(xì)胞的影響

在高糖造模MC3T3-E1中，梓醇能夠通過調(diào)節(jié)BMP和IGF-1/PI3K/mTOR途徑促進(jìn)增殖和增強(qiáng)ALP活性，并通過信號通路抑制劑和分子對接研究加以證實[10]。在高糖造模MC3T3-E1中，1、10 μmol/L的梓醇均能夠增加ALP表達(dá)，二者的鈣化基質(zhì)茜素紅染色斑均更密集、更廣泛，而且顯著增加OPG/RANKL的比值[11]。在高糖造模MC3T3-E1中，1、2、4 mg/mL的梓醇可以劑量依賴地改善受損增殖狀態(tài)，且ALP活性和礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增加，成骨分化相關(guān)蛋白表達(dá)增加。進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，梓醇通過抑制高糖誘導(dǎo)的KDM7A蛋白表達(dá)而調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路[23]。

2.4 梓醇對于其他成骨細(xì)胞模型的影響

在LPS造模SD大鼠成骨細(xì)胞中，梓醇濃度小于1 mg/L時，未明顯促進(jìn)增殖；當(dāng)濃度大于10 mg/L時，則明顯促進(jìn)增殖并無毒性作用；當(dāng)濃度小于1 mg/L時，未明顯保護(hù)成骨細(xì)胞炎性反應(yīng)；而濃度大于10 mg/L時，則明顯保護(hù)細(xì)胞炎性反應(yīng)[24]。在2,3,7,8-四氯二苯對二噁英造模MC3T3-E1中，梓醇抑制細(xì)胞活性減弱，抑制增加的細(xì)胞凋亡和自噬，降低一氧化氮和硝酸鹽水平，抑制細(xì)胞色素P450 1A1和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶水平升高。而且，梓醇能夠修復(fù)超氧化物歧化酶和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1基因表達(dá)，顯著增加谷胱甘肽過氧化物酶4和成骨分化標(biāo)志物(包括ALP和osterix)表達(dá)[25]。在SD大鼠成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞共育體系中，梓醇(0.05 mg/L～2 mg/L)顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，其中，0.05 mg/L作用效果最強(qiáng)，0.05 mg/L還顯著升高ALP水平。而且，盡管該濃度下梓醇對于成骨細(xì)胞中ERα的mRNA表達(dá)無影響，但是其顯著上調(diào)成骨細(xì)胞中ERβ的mRNA表達(dá)[26]。

2.5 梓醇對于破骨細(xì)胞的影響

在小鼠骨髓巨噬細(xì)胞和RAW264.7經(jīng)RANKL誘導(dǎo)分化的破骨細(xì)胞中，梓醇(0、100、200、400 μmol/L)呈現(xiàn)濃度依賴性的早期抑制破骨分化，破骨細(xì)胞數(shù)量和面積均減少，但并未促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。F-肌動蛋白環(huán)和骨吸收陷窩實驗顯示梓醇減小成熟破骨細(xì)胞F-肌動蛋白環(huán)尺寸和骨片骨吸收陷窩面積。梓醇還抑制破骨相關(guān)基因表達(dá)，梓醇通過調(diào)節(jié)NF-κB 和AKT信號途徑抑制NFATc1基因表達(dá)。PTEN被認(rèn)為是RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的重要調(diào)控因子，PTEN在破骨細(xì)胞形成過程中調(diào)控RANKL刺激的AKT和NF-κB信號通路，梓醇可以通過調(diào)節(jié)PTEN的泛素化和降解以抑制破骨分化[13]。在上述共育體系中，0.05 mg/L濃度的梓醇作用48、72、96 h 后顯著抑制破骨細(xì)胞的骨吸收陷窩數(shù)量和TRAP活性[26]；梓醇0.05 mg/L～50 mg/L顯著減少骨吸收陷窩數(shù)目，可以抑制破骨細(xì)胞活性，0.05 mg/L梓醇誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)成骨細(xì)胞中OPG基因表達(dá)有關(guān)[27]。

通過上述文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面，多個體外實驗結(jié)果顯示梓醇具有一定的促進(jìn)BMSCs[11,13]和成骨細(xì)胞[8,14-15,17-18,20]增殖作用；在促進(jìn)細(xì)胞成骨分化方面，多個體外實驗結(jié)果顯示梓醇具有一定的促進(jìn)BMSCs[7,11-13]和成骨細(xì)胞[8,14-20]成骨分化作用，可能影響Wnt和Hedgehog等信號通路。此外，梓醇還具有一定的抑制破骨活性作用[9,20-21]，可能影響PTEN/RANKL信號通路。

3 討論和總結(jié)

結(jié)合上述體內(nèi)外研究結(jié)果，筆者認(rèn)為梓醇具有一定的抗骨質(zhì)疏松活性，這與其能夠促進(jìn)BMSCs及成骨細(xì)胞增殖和分化、抑制破骨細(xì)胞活性有關(guān)，很可能從幾個方面同時發(fā)揮作用，體現(xiàn)了其多靶點(diǎn)作用的治療特點(diǎn)，可能對于成骨不足的低轉(zhuǎn)換型和破骨明顯大于成骨的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松均具有防治作用，而且可以促進(jìn)大鼠骨折愈合[28]。將體內(nèi)動物實驗和體外細(xì)胞模型相結(jié)合進(jìn)行研究對于闡明梓醇的抗骨質(zhì)疏松作用意義重大。

中藥地黃具有滋陰養(yǎng)血、益精填髓等功效，具有一定的降糖作用[3]，同時具有抗骨質(zhì)疏松作用[2-4]，其組方在臨床上也多用于糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的治療[5]。而梓醇作為地黃的主要藥效成分，也具有降糖和改善糖尿病并發(fā)癥[7]以及抗糖尿病性骨質(zhì)疏松(糖尿病并發(fā)癥之一)的作用[10,23,29]，梓醇是否通過影響糖尿病和骨代謝關(guān)鍵分子AMPK[30]而發(fā)揮作用？這些問題以及相關(guān)作用機(jī)制仍待解決和深入研究。

目前，已有越來越多的文獻(xiàn)報道了有關(guān)骨質(zhì)疏松癥治療藥物的新發(fā)現(xiàn)[31]，對于梓醇抗骨質(zhì)疏松作用靶點(diǎn)方面仍待深入挖掘。結(jié)合梓醇化合物具有的自身抗氧化性質(zhì)[7]，正如已有文獻(xiàn)報道[13,25]，建議多從氧化還原反應(yīng)角度加以深入探究。綜上所述，梓醇抗骨質(zhì)疏松作用的深入研究將有助于解析中藥地黃防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制以及開發(fā)療效更佳的抗骨質(zhì)疏松治療藥物。