方穎琪 沈燚 張奇 王娜 劉玉玲 朱露林 張巧艷* 秦路平*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州311053

2. 金花集團股份有限公司，陜西 西安710000

中藥虎骨來源于動物虎 Panthera tigris L.的骨骼，具有補腎益精、強筋健骨、舒筋活血、祛寒止痛等作用，常用于治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥[1]?；瘜W(xué)和藥理學(xué)研究[2]表明虎骨含有鈣、磷等礦物質(zhì)及氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)類成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)和促進骨折愈合等作用。然而，按照瀕危物種國際貿(mào)易公約(Convention on International Trade in Endangered Species，CITES)的要求, 虎Panthera tigris L.作為瀕危動物應(yīng)予以保護，我國于1993年禁止將虎骨作為藥用[3]。人工虎骨粉由幾種飼養(yǎng)的動物骨骼制備而成，與天然虎骨的化學(xué)成分相似，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗骨質(zhì)疏松等藥理作用[4]。金天格膠囊為人工虎骨粉的制劑，用于緩解腰背疼痛、腰膝酸軟、下肢痿弱、步履艱難等癥狀，已被國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)(CFDA; China, Z20030080) 用于骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎的防治[5]。臨床試驗[6]表明金天格膠囊單用或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用可增加骨密度、緩解疼痛及降低化學(xué)藥物的副作用。一項多中心、雙盲、安慰劑對照的臨床試驗[7]證實金天格膠囊用于骨質(zhì)疏松癥防治具有良好的安全性和有效性。然而，金天格膠囊治療骨質(zhì)疏松癥的機制尚不清楚。本研究以去卵巢大鼠為模型，應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析大鼠血清代謝標(biāo)志物的變化，以闡明金天格膠囊防治骨質(zhì)疏松癥的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

金天格膠囊(批號：210311-1)由金花企業(yè)(集團)股份有限公司西安金花制藥廠提供；其他試劑均為國藥集團的分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1模型復(fù)制與實驗方案：32只12周齡的雌性Wistar大鼠，由上海西普凱爾實驗動物公司提供，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)[許可證號：SYXK(浙)2018-0012]。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(25±2) ℃，清潔級喂養(yǎng)，自由飲水及進食。動物實驗嚴格遵守浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會指導(dǎo)原則，禁食、禁水12 h后，每只大鼠經(jīng)腹腔注射10 %的水合氯醛(0.3 mL/100 g)，使其麻醉，按照國際公認的雙側(cè)卵巢摘除法進行絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型復(fù)制[8]。切除卵巢后，第1天腹腔注射青霉素鈉0.2 mL，隨后每天注射0.1 mL青霉素鈉，連續(xù)注射4 d。7 d后，按體重進行分組，包括假手術(shù)組，去卵巢模型組、金天格低劑量組(JTG-180 mg/kg)和金天格高劑量組(JTG-360 mg/kg)。從去卵巢手術(shù)后第8天開始灌胃給藥，假手術(shù)對照組和模型組給予等量0.5 %的CMC-Na溶液，每天1次，給藥12周。觀察體重的變化，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量。

1.2.2骨組織形態(tài)變化觀察：取大鼠左側(cè)后肢股骨，于4 %多聚甲醛中固定，常溫保存，應(yīng)用Micro-CT檢測遠端股骨的骨組織微結(jié)構(gòu)，測定骨密度和骨礦含量。

1.2.3代謝組學(xué)分析

1.2.3.1血清樣品制備：大鼠用10 %水合氯醛麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血，4 ℃下3 500 r/min離心15 min，分離血清。取50 μL血清，加入含內(nèi)標(biāo)(5 μg/mL L-氯苯丙氨酸)的150 μL甲醇，渦旋1 min。4 ℃下13 000 r/min離心15 min，取100 μL上清液置進樣小瓶，用于代謝組學(xué)分析。取待測的血清樣本各10 μL，混合，作為QC(quality control)樣本。

1.2.3.2UPLC-MS分析：儀器：Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜與Agilent 6538 UHD 和 Accurate-Mass Q-TOF質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?HSS T3(2.1 mm×100 mm, 2.5 μm)；流動相：A-0.1 %甲酸溶液，B-乙腈(0.1 %甲酸)；流速：0.35 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：正離子模式下2 μL，負離子模式下4 μL。梯度洗脫程序：0～2 min，5 % B；2～13 min，5%～95 % B; 13～15 min，95 % B。駐留時間為5 min。質(zhì)譜參數(shù)：毛細管電壓，陽離子模式為4 kV，陰離子模式為3.5 kV；干燥氣體流速，11 L/min；氣體溫度350 ℃；載氣壓力，45 psig；碎裂電壓，120 V；撇渣器電壓，60 V；質(zhì)譜的采集范圍m/z 100～1 000。質(zhì)譜采集過程中同時打入?yún)⒈入x子用于監(jiān)測質(zhì)量軸的準(zhǔn)確性，正離子模式：121.050 9，922.009 8；負離子模式：112.985 6，1 033.988 1。

1.2.3.3數(shù)據(jù)處理和多變量數(shù)據(jù)分析：應(yīng)用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.04.00 software(Agilent Technologies, USA)將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成通用(mz.data)格式，使用XCMS程序包進行峰的識別，保留時間校正，自動積分等預(yù)處理。按80 %原則對樣本數(shù)量進行篩選后，接著內(nèi)標(biāo)歸一化，得到一個包含樣品名，m/z-RT對，峰面積的可視化矩陣。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-P軟件(版本14.1)，進行中心化和Pareto標(biāo)度化后，進行多元統(tǒng)計分析。

1.2.3.4代謝途徑分析：利用KEGG在線數(shù)據(jù)庫(http：//www.genome.ad.jp/kegg/)、人代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB, http://www.hmdb.ca/)、PubChem(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)和MetaboAnalyst(http://www.metaboanalyst.ca/)整合本研究中確定的潛在生物標(biāo)志物，繪制代謝網(wǎng)絡(luò)圖。應(yīng)用在線軟件Statistical Analyst(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/ModuleView.xhtml)繪制差異代謝物熱圖。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠股骨Micro-CT分析

由圖1可知，與假手術(shù)組(sham)比較，去卵巢組(OVX)大鼠的骨組織微結(jié)構(gòu)退化，骨小梁稀疏，數(shù)量減少；與OVX組比較，180 mg/kg和360 mg/kg的金天格膠囊給藥組大鼠的骨組織微結(jié)構(gòu)恢復(fù)，骨小梁較為致密，數(shù)量顯著增加。如表1所示，與sham組比較，OVX組大鼠的骨密度(bone mineral density，BMD)和骨礦物含量(bone mineral content，BMC)顯著下降(P<0.01)，金天格膠囊給藥組大鼠股骨的骨密度和骨礦物質(zhì)含量顯著增加(P<0.05，P<0.01)。

表1 大鼠遠端股骨骨密度和骨礦物質(zhì)含量

2.2 血清樣品UHPLC-Q-TOF-MS代謝組學(xué)分析

在正離子和負離子模式下采用UHPLC-QTOF-MS掃描大鼠血清QC樣品，得到總離子流(total ion chromatogram, TIC)，見圖2。

圖3所示，在主成分分析(PCA)評分圖中，QC樣品分布集中，表明數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，方法穩(wěn)定性好。圖3A、3B顯示Sham組和OVX組大鼠血清樣品在正負離子模式下的PCA得分圖中能顯著分離，表明去卵巢大鼠血清代謝輪廓發(fā)生了改變，映射了骨質(zhì)疏松的發(fā)生與發(fā)展過程。圖3C、3D顯示在PCA得分圖中，JTG-180 mg/kg組有接近一半的大鼠血清樣品可與OVX組分離，JTG-360 mg/kg組的所有血清樣品與OVX模型組可顯著分離，表明金天格膠囊能夠逆轉(zhuǎn)去卵巢大鼠血清代謝輪廓的變化。

2.3 去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥相關(guān)生物標(biāo)志物的篩選

圖4A、4B顯示，Sham組和OVX組大鼠血清樣品在有監(jiān)督的OPLS-DA得分圖中分離明顯；圖4C、4D顯示，對血清樣品的OPLS-DA得分圖模型進行置換檢驗，得到Sham組和OVX組間正離子模式下的區(qū)分變量參數(shù)為 R2X=0.754，R2Y=0.999，預(yù)測Q2=0.897；負離子模式下的區(qū)分變量參數(shù)為R2X=0.481，R2Y=0.988，預(yù)測Q2=0.741。Q2數(shù)值較高，表明OPLS-DA模型可靠，未發(fā)生過擬合，可用于預(yù)測差異代謝物。通過S-plot散點圖(圖4E、4F)，結(jié)合VIP值(VIP>1)和t檢驗(P<0.05)篩選得到去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥相關(guān)生物標(biāo)志物。結(jié)合HMDB和KEGG 等在線數(shù)據(jù)庫，最終鑒定出17個去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的生物標(biāo)志物，見表2。

表2 大鼠血清中的代謝標(biāo)志物Table 2 Metabolic markers in serum of rats

2.4 金天格膠囊對去卵巢骨質(zhì)疏松癥生物標(biāo)志物的影響

將Sham組、OVX組和金天格膠囊處理組大鼠血清代謝物水平進行可視化熱圖分析，如圖5A所示，與Sham組比較，OVX組大鼠血清中有15個生物標(biāo)志物水平顯著下調(diào)，2個顯著上調(diào)；與OVX組比較，金天格膠囊處理組大鼠血清生物標(biāo)志物大多顯著回調(diào)，接近Sham組的水平。采用各組均值得到的可視化熱圖(圖5B)也顯示金天格膠囊能夠逆轉(zhuǎn)去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠血清生物標(biāo)志物的變化。

通過觀察藥物作用后血清生物標(biāo)志物的回調(diào)個數(shù)及回調(diào)程度，可直觀的反映金天格膠囊對去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠的作用。如圖6所示，與Sham組比較，去卵巢組大鼠血清中LysoPE(20∶0/0∶0)、L-色氨酸、半胱氨酸-絲氨酸、D-色氨酸、LysoPC(18∶1/0∶0)、5’-磷酸吡哆胺、LysoPC(20∶2/0∶0)、LysoPC(14∶0/0∶0)、LysoPC(18∶4/0∶0)、LysoPC(16∶1/0∶0)、15(S)-Hydroxyeicosatrienoic acid、N2-Succinyl-L-glutamic acid 5- semialdehyde、9-順式視黃酸(9-cis-Retinoic acid)、甘氨膽酸(Glycocholic acid)和LysoPE(22∶6/0∶0)顯著下調(diào)，PI(18∶0/20∶4)和5-HEPE顯著上調(diào)。與OVX組比較，金天格膠囊處理組大鼠血清中LysoPE (20∶0/0∶0)、L-色氨酸、半胱氨酸-絲氨酸、D-色氨酸、LysoPC(18∶1/0∶0)、5’-磷酸吡哆胺、PI(18∶0/20∶4)和15(S)-Hydroxyeicosatrienoic acid的水平顯著回調(diào)，其他代謝物的水平也有一定的回調(diào)趨勢，提示金天格膠囊能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)OVX大鼠血清生物標(biāo)志物的水平變化，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。

2.5 去卵巢骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)代謝通路及金天格膠囊的調(diào)控作用

將表2中的17個差異代謝物導(dǎo)入metaboanalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca)進行通路分析，如圖7A所示，最終得到6條去卵巢骨質(zhì)疏松癥的潛在相關(guān)代謝通路，分別為色氨酸代謝、維生素B6代謝、視黃醇代謝、甘油磷脂代謝、原發(fā)性膽汁酸生物合成和氨基酰基-tRNA生物合成。將給予金天格膠囊后回調(diào)的8個代謝產(chǎn)物導(dǎo)入metaboanalyst 5.0進行通路分析，如圖7B所示，得到4條金天格膠囊防治去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥可能的代謝通路，分別為色氨酸代謝、維生素B6代謝、甘油磷脂代謝和氨基?；?tRNA生物合成。利用KEGG數(shù)據(jù)庫和MetaboAnalyst對各通路進行關(guān)聯(lián)分析，得到代謝網(wǎng)絡(luò)圖(圖7C)。

3 討論

本研究利用去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥模型，采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)和多元統(tǒng)計分析方法，通過比較假手術(shù)組與模型組大鼠血清樣品中的生物代謝物，發(fā)現(xiàn)了17種骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的生物標(biāo)志物及6條代謝通路。根據(jù)金天格膠囊對去卵巢骨質(zhì)疏松癥生物標(biāo)志物的調(diào)控趨勢，發(fā)現(xiàn)金天格膠囊可能通過調(diào)控維生素B6代謝和色氨酸代謝實現(xiàn)抗骨質(zhì)疏松的機制。

維生素B6是機體正常生理活動所必須的營養(yǎng)物質(zhì)[9]。低的維生素B6攝入水平或者血液中低的維生素B6濃度可能是骨質(zhì)疏松潛在的風(fēng)險因素。研究[10]表明血液中低濃度的維生素B6水平可導(dǎo)致破骨細胞的活性增強，骨基質(zhì)的降解增加。骨折愈合過程中維生素B6缺失導(dǎo)致新骨的形成減少，及成骨細胞和破骨細胞的偶聯(lián)失衡[11]。維生素B6缺失使得骨膠原的交聯(lián)和形成減少，影響骨骼的機械力學(xué)性能，增加骨折風(fēng)險[12]。維生素B6的代謝物包括吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺等[9]，金天格膠囊可在一定程度上逆轉(zhuǎn)去卵巢大鼠血清5’-磷酸吡哆胺水平的降低，通過調(diào)節(jié)維生素B6代謝發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。

色氨酸為人體必需氨基酸，通過犬尿氨酸通路進行代謝，并與骨骼的衰老、骨質(zhì)降解、干細胞功能和骨生成有關(guān)[13]。色氨酸代謝物3-羥基犬尿氨酸、犬尿喹啉酸和氨茴酸會破壞骨骼，降低骨密度，增加骨折風(fēng)險；而色氨酸其他代謝物如3-羥基氨茴酸、黃尿酸、吡啶甲酸和喹啉酸可增加骨密度[13-14]。犬尿氨酸的氧化產(chǎn)物可終止骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖，抑制成骨細胞的增殖、分化；同時犬尿氨酸水平增加會促進骨吸收，增強骨骼脆性，增加骨折風(fēng)險[15]。金天格膠囊可逆轉(zhuǎn)去卵巢大鼠血清色氨酸的降低，減少骨丟失。

甘油磷脂參與骨代謝的調(diào)控。大鼠去卵巢后血漿中甘油磷脂水平下降，抗骨質(zhì)疏松藥物能夠逆轉(zhuǎn)這一變化[8,16-17]。甘油磷脂水解后可生成溶血磷脂，其合成磷脂酸后再與堿基連接可形成磷脂酰乙醇胺。金天格膠囊可逆轉(zhuǎn)去卵巢大鼠血清甘油磷脂代謝物溶血磷脂酰膽堿類成分及磷脂酰乙醇胺類成分水平的降低，調(diào)節(jié)骨代謝。

絕經(jīng)后婦女血清膽汁酸水平與骨密度呈正相關(guān)，與反映骨吸收的骨轉(zhuǎn)換生物標(biāo)志物呈負相關(guān)[18]。膽汁酸影響維生素D的腸道吸收，進而影響維生素D對鈣和磷酸鹽代謝及骨礦化的調(diào)控作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠血清中甘氨膽酸水平下降，導(dǎo)致膽汁酸轉(zhuǎn)化異常，影響維生素D的吸收和骨代謝。

維生素A(視黃醇)是人體必需的維生素[20]，增加的血清視黃醇水平與低骨量和骨質(zhì)疏松性骨折風(fēng)險相關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠血漿中維生素A的降解產(chǎn)物9-順維甲酸水平降低。金天格膠囊不能逆轉(zhuǎn)卵巢大鼠血清甘氨膽酸和9-順維甲酸水平，提示金天格可能不是通過調(diào)節(jié)膽汁酸和視黃醇代謝發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用非靶向代謝組學(xué)的方法和思路，發(fā)現(xiàn)金天格膠囊通過調(diào)控維生素B6代謝和色氨酸代謝實現(xiàn)抗骨質(zhì)疏松的作用機制，為其臨床上用于骨質(zhì)疏松癥的防治提供了科學(xué)依據(jù)。后期有必要應(yīng)用靶向代謝組學(xué)技術(shù)，深入探討金天格膠囊對維生素B6和色氨酸代謝通路上代謝物變化的影響，進一步驗證金天格膠囊調(diào)控骨代謝的作用機制。金天格膠囊對骨代謝的效應(yīng)細胞成骨細胞和破骨細胞功能的調(diào)控作用也是后續(xù)應(yīng)著力研究的方向。