付夜平 楊芳 孫鑫 邸貴鑫 安勇

遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110032

骨痿是“五體痿”之一，最早見于《素問·痿論》：“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿?！逼洳C為腎氣亢盛，灼傷津液，髓骨不充，從而導致骨痿[1]。中醫(yī)學認為，骨痿的發(fā)生與脾、腎相關，脾虛是關鍵，腎虛為本源[2]。如《證治匯補·腰膝門》所言：“胃氣一虛，……，骨節(jié)空虛。”腎為先天之本主骨生髓，而脾為后天之本，脾主肌肉，先天資后天，后天養(yǎng)先天，因此前人提出“骨肉不相親”理論。由此理論推斷肌源性干細胞(MDSCs)應該存在向成骨細胞轉(zhuǎn)化的可能。筆者查閱相關文獻資料，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)廣泛存在于人體的組織器官以及細胞之中，并且有相關研究表明SDF-1與成骨分化存在密切聯(lián)系。BMP-2是已知的BMP家族生長因子中活性最強的生長因子[3]，所以本研究采用人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)為誘導劑，通過中醫(yī)補腎陰法、補腎陽法、健脾法、補腎健脾法，探討中醫(yī)不同治法誘導大鼠肌源性干細胞(MDSCs)向成骨細胞分化中成骨細胞中SDF-1 mRNA的表達情況，為中醫(yī)在骨科疾病的病機研究以及治療中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細胞：選取SD大鼠(SPF級)60只，雌性，未交配，2～3月齡，體重180～220 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗單位使用許可證編號：SYXK(遼)2013-0009；大鼠飲用水為純凈水，于沈陽茂華生物科技有限公司采購SPF級大鼠生長繁殖飼料[許可證號：SCXK(遼)2017-0001]及墊料，并且均經(jīng)過輻照消毒；大鼠肌源性干細胞(MDSCs)購自上海佰曄生物科技中心。

1.1.2藥物及制備：補腎陰組使用左歸丸(熟地、山萸肉、山藥、枸杞、牛膝、菟絲子、鹿角膠、龜甲膠)；補腎陽組使用右歸丸(熟地、山萸肉、山藥、菟絲子、杜仲、枸杞、肉桂、附子、鹿角膠、當歸)；健脾組使用補中益氣湯(黨參、當歸、黃芪、白術、炙甘草、柴胡、陳皮、升麻、大棗、生姜)；補腎健脾組(熟地、鹿角膠、黨參、黃芪、甘草、淫羊藿)。以上藥物均為顆粒劑，購買于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院。大鼠胃容積為1 mL/100 g，以此為大鼠配藥及灌胃。上述藥物按計算比例給藥劑量如下：補腎陰組：熟地2.52 g /(kg·d)、山茱萸1.26 g/(kg·d) 、山藥1.26 g/(kg·d)、枸杞1.26 g /(kg·d)、牛膝0.945 g/(kg·d)、菟絲子1.26 g/(kg·d)、鹿角膠1.26 g/(kg·d)、龜甲膠1.26 g/(kg·d)；補腎陽組：熟地2.52 g/(kg·d)、山茱萸0.945 g/(kg·d)、山藥1.26 g/(kg·d)、菟絲子1.26 g/(kg·d)、杜仲1.26 g/(kg·d)、枸杞1.26 g/(kg·d)、肉桂0.945 g/(kg·d)、制附子0.945 g/(kg·d)、鹿角膠1.26 g/(kg·d)、當歸0.945 g/(kg·d)；健脾組：黨參1.575 g/(kg·d)、當歸1.05 g/(kg·d)、黃芪1.575 g/(kg·d)、白術1.05 g/(kg·d)、炙甘草1.575 g/(kg·d)、柴胡1.26 g/(kg·d)、陳皮0.63 g/(kg·d)、升麻0.63 g/(kg·d)、大棗0.63 g/(kg·d)、生姜0.945 g/(kg·d)；補腎健脾組：熟地1.575 g/(kg·d)、鹿角膠1.26 g/(kg·d)、黨參1.575 g/(kg·d)、黃芪1.575 g/(kg·d)、甘草1.575 g/(kg·d)、淫羊藿1.26 g/(kg·d)。將藥物置于燒杯之中，加入適量蒸餾水，用玻璃棒攪拌配置成溶液，并將所配置藥物保存在冰箱中，使用時按每日大鼠所需進行加熱。

1.1.3試劑：Rat SDF-1 ELISA試劑盒[批號：202011(AMEKO)]；胎牛血清(GIBICO，美國)；茜素紅(批號：T190613H501)；雙抗(批號：79180101100)；SYBR? Premix Ex TaqTMII (TliRNaseH Plus)，ROX plus，廠家：Takara,貨號：RR42LR,出廠號AK6948；PBS溶液(批號:AE27369284)；人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)(批號AG12015747)；0.25 %Trypsin EDTA消化酶 (批號：1868903)；PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser，廠家：Takara,貨號：RR047A,出廠號：BK3153。

1.1.4主要儀器：MDF-382 N型超低溫冰箱(日本Sanyo)；蛋白核酸分析儀(DU640美國貝克曼)；倒置相差顯微鏡(1×71型，OLYMPUS日本)；酶標儀(Infinite M200，瑞士TECAN)；移液槍(eppendorf 德國)；熒光定量PCR儀(Stratagene Mx3000P德國安捷倫)；三氣培養(yǎng)箱(Oxford Optronix 英國)；臺式離心機(德國 JOUANSA，Labofuge 400型)；CO2培養(yǎng)箱(HERA cell50i，Thermo 美國)；超凈工作臺(1287#6型，Thermo 美國)；低溫高速離心機(法國 Jouan SA MR1822)；濾膜(0.22 a m，Mi11 ipore，USA)。

1.2 方法

1.2.1細胞復蘇及培養(yǎng)：將復蘇后的大鼠肌源性干細胞(MDSCs)制成細胞懸液，將細胞懸液分置兩處，一處為6孔板，另一處則在培養(yǎng)瓶中，將二者放入CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，5 % CO2)中培養(yǎng)24 h。到時間以后取出，把培養(yǎng)基和不貼壁的細胞吸出，然后取新培養(yǎng)基加入其中，將二者放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。與此同時在鏡下觀察細胞的培養(yǎng)生長狀況(單層貼壁生長)，當細胞生長至80 %～90 %融合后，將舊培養(yǎng)基從中吸出，加入PBS溶液，洗滌2～3次即可，隨即加入0.25 %胰蛋白酶，消化1～3 min，與此同時在鏡下觀察細胞情況。當細胞明顯去除后，把完全培養(yǎng)基加入，終止消化，再用移液管吸取完全培養(yǎng)液緩慢吹打瓶壁上的細胞，制備成細胞懸液，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1 500 r/min，離心5 min，把上清液吸出丟棄，把離心后的沉淀轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，加入適量新培養(yǎng)基，將細胞濃度調(diào)度至1×105/mL ，把細胞繼續(xù)轉(zhuǎn)移到CO2培養(yǎng)箱(37 ℃ ，5 % CO2)中，收集后轉(zhuǎn)入第四代進行實驗。

1.2.2含藥血清制備：用隨機數(shù)字表法將SPF級3月齡雌性大鼠(體重180～200 g)60只分為6組，依次為正常組、誘導液組、誘導液+補腎陰組、誘導液+補腎陽組、誘導液+健脾中藥組、誘導液+補腎健脾中藥組。各組大鼠的給藥時間為每天早上8點，每日一次，連續(xù)給藥1周。正常組、誘導組的給藥用相同劑量的0.9 % NaCl溶液替代。給藥劑量為1 mL/100 g (大鼠重量)，計算方法為按成人每公斤體重所用生藥量的6. 3倍灌胃(成人體重按 60 kg 計算)。在第7天早晨給藥以后的2 h，用10 %水合氯醛(0.35 mL/100 g)對實驗大鼠肌肉行注射麻醉，在無菌條件下進行大鼠腹主動脈血的采集。將采集的腹主動脈血靜置于冰箱內(nèi)(溫度為4 ℃)，時間為3～4 h，隨后取出進行30 min離心(3 000 r/min)，收集血清，并用水浴(溫度為56 ℃)滅活補體(時長30 min)，冷凍保存(溫度為-70 ℃)，用0.22 μm濾膜過濾除菌，隨后分裝在不同試管，做好標記。使用前將含藥血清用無血清DMEM把血清濃度調(diào)配至15 %。

1.2.3藥物血清培養(yǎng)細胞：完全培養(yǎng)液組(正常組)、BMP-2誘導液組(誘導組)、補腎陰組、補腎陽組、健脾組、補腎健脾組等各中藥組組成均為15 %對應中藥大鼠血清+80 %完全培養(yǎng)液+5 %誘導液。各實驗組含藥物的培養(yǎng)基加入到各實驗組的時間為鋪板后的24 h，繼而進行連續(xù)培養(yǎng)，此外新鮮培養(yǎng)基(不同中藥組)的更新替換為3 d /次，培養(yǎng)至第15天收集材料。

1.2.4檢測指標及方法

1.2.4.1茜紅素染色細胞形態(tài)觀察：將培養(yǎng)15 d的細胞進行茜素紅染色。先將0.1 %明膠(Cyagen)包被在24孔板上，然后將各組樣本接種在24孔板上，每豎排4孔為一組，分別標記為正常組、誘導組、補腎陰組、補腎陽組、健脾組、補腎健脾組，分別在細胞培養(yǎng)的第15天取出觀察。首先進行兩次洗板，溶液使用PBS溶液，隨后把多聚甲醛(4 %)加入孔中進行固定，時間為20 min，再清洗兩次，清洗溶液為去離子水。繼續(xù)往每孔加入茜素紅(200 μL)，染色時間30 min，到時間以后再用去離子水洗三次。鏡下觀察茜紅素染色細胞形態(tài)。

1.2.4.2qRT-PCR法檢測SDF-1 mRNA表達情況：在培養(yǎng)的第15天將各組培養(yǎng)細胞的孔板中培養(yǎng)基吸出，加入適量無菌PBS溶液，然后用移液槍不停吹打，使全部細胞從培養(yǎng)板上脫落，還未脫落的細胞用細胞刮勺輕剝離，把細胞與PBS溶液轉(zhuǎn)移到EP管中，離心5 min，將EP管底部沉淀保留，上清液丟棄。隨后分別裝到不同管內(nèi)加入Trizol，將總RNA提取出來。根據(jù)試劑盒說明書，采用QRT-PCR法檢測SDF-1 mRNA的表達,利用公式計算出所得各樣品Ct值各樣品mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 下游引物Table 1 Downstream primers

1.2.4.3ELISA法檢測成骨細胞中SDF-1蛋白表達：細胞收集方法同上，嚴格按照試劑盒操作說明進行操作檢測，標準曲線的回歸方程用EXCEL計算，以此計算各指標。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 茜紅素染色細胞形態(tài)的觀察

于鏡下觀察第15天誘導細胞的生長狀態(tài)。細胞生長良好，各中藥組細胞生長與正常組以及誘導組相比，細胞數(shù)量不僅多而且生長較為集中。見圖1。

2.2 SDF-1 mRNA表達結(jié)果

各組細胞SDF-1 mRNA相對表達量結(jié)果見表2。與正常組比較，誘導組、補腎陰組、補腎陽組、健脾組、補腎健脾組中SDF-1 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.01)；與誘導組比較，健脾組無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其余組均有顯著升高，且具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表2 各組細胞SDF-1 mRNA相對表達量結(jié)果分析對比Table 2 Analysis and comparison of relative expression of SDF-1 mRNA in each

2.3 SDF-1蛋白表達

各組細胞SDF-1蛋白相對表達量結(jié)果見表3。補腎陰組、補腎陽組、誘導組、健脾組、補腎健脾組SDF-1蛋白表達均高于正常組，其中補腎陰組、補腎健脾組不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，只有補腎陽組、誘導組、健脾組具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與誘導組比較，各給藥組SDF-1含量均高于誘導組，其中補腎陰組、補腎陽組、健脾組具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，補腎健脾組SDF-1含量雖然也高與誘導組，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 各組細胞SDF-1蛋白相對表達量結(jié)果分析對比Table 3 Analysis and comparison of relative expression of SDF-1 mRNA in each group

3 討論

3.1 中醫(yī)學對“骨肉不相親”病機的認識

“骨肉不相親”理論出自《靈樞·經(jīng)脈》：“故骨髓不濡，即肉不著骨；骨肉不相親，即肉濡而卻”。這是對骨肉關系最為經(jīng)典且最早的論述[4]。其認為：腎生髓主骨，主生殖而能藏精，脾主四肢，合肌肉，能運化水谷精微[5]?！鹅`樞·經(jīng)脈》又言：“足少陰氣絕，則骨枯。……骨肉不相親，則肉軟卻；肉軟卻，故齒長而垢，發(fā)無澤；發(fā)無澤者，骨先死。戊篤己死，土勝也。”說明肌肉痿軟，甚至齒發(fā)枯槁無澤的根本歸結(jié)于腎氣不得濡養(yǎng)于骨，即“骨肉不相親。”《素問·五運行大論》云：“腎生骨髓。”《素問·五臟生成》曰：“脾之合肉也”?！端貑枴ゐ粽摗罚骸捌⒅魃碇∪猓I主身之骨髓?！蹦I藏精，髓源于精，髓充于骨。骨骼是否強壯的關鍵因素在于腎精是否充足，若腎精充盈則骨髓充盛，進而體現(xiàn)出骨骼強健，壯實有力。充盈于腎中之精，不僅溫養(yǎng)骨髓，而且還能助脾運化，則氣血生化并不乏源，四肢百骸得以濡養(yǎng)，同時腎精的填補，腎氣的滋養(yǎng)又需要充盈的氣血來反養(yǎng)，是以先天養(yǎng)后天，后天資先天，相互促進，似環(huán)無端。腎中陽氣可以溫煦助力脾之運化，腎中先天之精也需要由脾運化的后天之精之充補?！端貑枴ぬ庩柮髡摗费裕骸敖衿⒉〔荒転槲感衅浣蛞?，……筋骨肌肉，皆無氣以生，故不用焉?！笨梢娔I脾二臟共司骨骼與肌肉作為人體運動的基礎，互相補充，互相配合。另《素問·生氣通天論》中云：“是故謹和五味，骨正筋柔，氣血通暢，腠理致密，如是則骨氣以精?！贝司湓挶砻髁斯趋赖膹娊∮辛Τ嗽从诠趋辣旧恚€需要腠理的保護、營養(yǎng)與支持，這是對骨骼和肌肉生理狀態(tài)下的相互依存、相輔相成關系的生動闡釋。中醫(yī)學以腎主骨生髓，為先天之本，脾為后天之本，氣血生化之源為根基，不斷豐富脾腎理論，脾腎相資相助，使人體骨骼肌肉強健有力，骨髓不能濡養(yǎng)肌肉和骨骼，骨枯肉痿髓減，即“骨肉不相親”的病機。而本文正是基于骨肉之間密不可分的關系來探討肌源性干細胞(MDSCs)與成骨細胞之間分化的聯(lián)系。

3.2 SDF-1與成骨分化

基質(zhì)細胞衍生因子1(SDF-1)屬于CXC類趨化因子亞家族，又被稱趨化因子配體12(chemokine ligand 12，CXCL12)，是一種由骨髓基質(zhì)細胞.分泌的細胞因子基質(zhì)細胞衍生因子[6]。而SDF-1的兩種亞型分別分為SDF -1α和SDF-1β，其中SDF-1α為此主要亞型[7]。SDF-1在人腦、肺、心臟、腸道等多種組織器官中均有表達，并且在血管內(nèi)皮細胞、成骨細胞和成纖維細胞中也可以檢測到SDF-1的存在[8]。有相關研究[9]表明，SDF-1通過誘導BMSCs上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的表達，促進成骨分化，并增加局部血供。楊鎧寧等[10]通過實驗得出大鼠骨組織中SDF-1水平與骨質(zhì)疏松大鼠骨骼發(fā)育存在密切關系的結(jié)論。更加印證了SDF-1與成骨分化存在密切聯(lián)系。

3.3 肌源性干細胞向成骨細胞分化效應機制

肌源性干細胞(MDSCs)是一種具有多向分化潛能的成體干細胞[11]，可分化為成骨細胞[12]和軟骨細胞[13]。有相關文獻記載從小鼠體內(nèi)分離得到MDSCs，并成功將其誘導為成骨細胞，李翔等[14]通過BMP-9誘導兔骨骼肌源性干細胞(MDSCs)成骨分化證實BMP-9對誘導MDSCs成骨分化具有較強的定向作用，以及梅晰凡等[15]將大鼠肌源性干細胞 (MDSCs)體外定向誘導為軟骨細胞。以上實驗全都印證了肌源性干細胞向成骨細胞分化的可行性。MDSCs是目前最有可能滿足臨床修復骨缺損要求的細胞，具有容易獲取、來源廣、短期內(nèi)擴增量大的特點[12]，為臨床骨質(zhì)疏松癥的治療提供了思路。

目前，誘導成骨相關實驗多數(shù)由骨髓間充質(zhì)干細胞分化。然而對肌源性干細胞誘導成骨細胞分化的研究相對較少。劉穎等[16]在觀察骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的過程中探討朝藿定A對其分化的影響，應用ELISA技術研究其抗骨質(zhì)疏松作用及相關分子機制；倪飛飛等[17]研究人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMSC)受IL-18作用影響的成骨分化作用。以上皆是由骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的實驗。

本研究結(jié)果顯示，大鼠肌源性干細胞(MDSCs)在中醫(yī)不同治法及方藥作用下，經(jīng)成骨誘導15 d后鈣化結(jié)節(jié)的茜素紅染色呈橘紅色塊狀和片狀，表明對鈣化結(jié)節(jié)的形成有明顯的促進作用。另從PCR和ELISA檢測結(jié)果來看，不同治法均可以使成骨細胞中SDF-1蛋白表達水平升高，對肌源性干細胞(MDSCs)成骨分化存在正向促進作用，印證了肌源性干細胞成骨轉(zhuǎn)化的可行性。中醫(yī)基礎理論“骨肉不相親”對于肌源性干細胞成骨誘導具有指導意義，本研究也為中醫(yī)臨床治療骨科疾病提供了科學的實驗根據(jù)。