謝菲飛 宋立穩(wěn) 王小英 胡燕芳 謝蘊(yùn)云 劉文華 謝寶強(qiáng)*

1. 廣東省人民醫(yī)院贛州醫(yī)院(贛州市立醫(yī)院)內(nèi)分泌代謝科，江西 贛州 341000

2. 濰坊市人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，山東 濰坊 261000

骨質(zhì)疏松癥是最常見的骨骼疾病之一，其特點(diǎn)是骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、骨密度降低和脆性骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[1]。據(jù)估計(jì)[2]，全球50歲以上人群中，約有40 %絕經(jīng)后女性、20 %男性患有骨質(zhì)疏松癥。絕經(jīng)后婦女的發(fā)病率要比同齡男性高6倍，其原因是絕經(jīng)后卵巢功能衰退、雌激素水平下降，甲狀旁腺素(PTH)導(dǎo)致骨吸收增強(qiáng)，成骨細(xì)胞的増殖和分化受到抑制，使骨吸收大于骨形成，從而導(dǎo)致骨密度降低，易發(fā)生骨折[3-4]。前期研究中發(fā)現(xiàn)GCM1在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMO)患者血清中低表達(dá)，但是關(guān)于GCM1在PMO中的作用和分子機(jī)制還尚未有研究報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)GCM1能夠促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化[5-6]，揭示其具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的潛力。本研究擬通過觀察GCM1對MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化及礦化的影響及具體的作用機(jī)制，為PMO的治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1)購自中國科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、TRIzolRNA分離試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreen均購自ThermoFisherScientific(中國)；RIPA裂解緩沖液購自北京碧云天生物科技有限公司；堿性磷酸酶(ALP)染液購自南京建成生物工程研究所；GCM1兔多抗、GAPDH兔多抗購自proteintech；RUNX2兔單抗、Osterix兔單抗、Ostopontin兔單抗、CollagenI兔單抗、Wnt3a兔單抗、β-Catenin以及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白IgG二抗均購自Abcam。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分化：將MC3T3-E1細(xì)胞在含10 % FBS的α-MEM培養(yǎng)基中于37 ℃、含5 % CO2的條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80 %時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)：將MC3T3-E1細(xì)胞在分化培養(yǎng)基(DM)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并添加10 %胎牛血清、50 μg/mL抗壞血酸、4 mmol/L β-甘油磷酸酯和BMP2(300 ng/mL)，每三天更換一次，培養(yǎng)14 d[7]。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染：GCM1過表達(dá)載體(pcDNA-GCM1)及其陰性對照(pcDNA-NC)和GCM1干擾序列(sh-GCM1)及其陰性對照(sh-NC)由廣州銳博生物科技有限公司合成。根據(jù)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000制造商的使用說明書將GCM1過表達(dá)載體和GCM1干擾序列及其陰性對照轉(zhuǎn)染至各自細(xì)胞組：Ov-NC組、Ov-GCM1組、Sh-NC組以及Sh-GCM1組，并通過qRT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)定量分析：根據(jù)制造商的使用說明書，使用TRIzolRNA分離試劑從各組細(xì)胞中分離提取總RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用SYBRGreen進(jìn)行qRT-PCR定量分析。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理，并用2-ΔΔCt值計(jì)算目的基因相對表達(dá)水平。所用引物見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列Table 1 The primer sequence of qRT-PCR

1.2.4蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)檢測：將各處理組細(xì)胞以2×106個(gè)/孔接種在6孔板中，并在實(shí)驗(yàn)前培養(yǎng)24 h。收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞并在冰上用預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液裂解10 min，收集總蛋白。通過BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量分析。取50 μg總蛋白使用SDS-PAGE在100 V條件下電泳1 h。隨后，在60 V的條件下電轉(zhuǎn)2 h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。在室溫下用5 %脫脂牛奶對膜封閉處理2 h，4 ℃下與一抗孵育過夜。將膜用含0.1 %Tween 20的PBS洗滌3次(每次10 min)在室溫下和二抗一起孵育2 h。免疫印跡用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色，并拍照觀察。

1.2.5堿性磷酸酶(ALP)染色檢測：在細(xì)胞成骨誘導(dǎo)14 d后，棄去培養(yǎng)皿中的誘導(dǎo)液，PBS洗滌3次，室溫下在4 %多聚甲醛中固定30 min，棄去固定液，PBS洗滌3次。加入適量新鮮配置的底物應(yīng)用液，在濕盒中避光孵育15 min后，水洗2 min。趁濕用復(fù)染液復(fù)染30 s，蒸餾水洗1 min，甩干，在倒置光學(xué)顯微鏡下拍照觀察。

1.2.6茜素紅染色：細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，棄去培養(yǎng)皿中的誘導(dǎo)液，PBS洗滌3次，在95 %乙醇中固定10 min，再用PBS洗1～2次，用含0.1 %茜素紅溶液染色10 min。最后用PBS沖洗，在倒置光學(xué)顯微鏡下拍照觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，并用GraphPad Prism8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(雙尾)。

2 結(jié)果

2.1 GCM1在PMO患者血清中低表達(dá)

在GEO數(shù)據(jù)庫中獲取并下載絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者芯片GSE56116數(shù)據(jù)(包括3例正常、10例PMO患者)，GEO2R分析發(fā)現(xiàn)GCM1在PMO患者血清中低表達(dá)(圖1A)。如圖1B、1C所示：Western Blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA-GCM1使MC3T3-E1細(xì)胞中GCM1表達(dá)升高(P<0.001)，而轉(zhuǎn)染sh-GCM1后GCM1表達(dá)降低(P<0.001)。

2.2 GCM1促進(jìn)BMP2誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化

RT-qPCR檢測MC3T3-E1成骨分化過程中GCM1的相對表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GCM1隨著誘導(dǎo)成骨分化時(shí)間遞增(圖2A)。ALP是成骨分化的標(biāo)志物，ALP染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(圖2B)，和control組相比，BMP2誘導(dǎo)組ALP含量增加(P<0.001)；和BMP2+ov-NC組相比，BMP2+ov-GCM1組ALP含量增加(P<0.001)；和BMP2+sh-NC組比，BMP2+sh-GCM1組ALP含量降低(P<0.001)。進(jìn)一步通過Western Blot檢測成骨分化相關(guān)基因(RUNX2、Osterix、Ostopontin、CollagenⅠ)的表達(dá)水平，結(jié)果如圖2C所示，和control組相比，BMP2誘導(dǎo)組成骨分化相關(guān)基因表達(dá)增加(P<0.001)；和BMP2+ov-NC組相比，BMP2+ov-GCM1組成骨分化相關(guān)基因表達(dá)增加(P<0.001)；和BMP2+sh-NC組比，BMP2+sh-GCM1組成骨分化相關(guān)基因表達(dá)降低(P<0.001)。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)成骨分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平與Western Blot結(jié)果保持一致(圖2 D，P<0.001)，表明GCM1促進(jìn)了BMP2誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化，而抑制GCM1表達(dá)則抑制了BMP2誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化。

2.3 GCM1促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞礦化

通過茜素紅染色觀察MC3T3-E1細(xì)胞礦化情況，結(jié)果如圖3所示：和control組相比，BMP2誘導(dǎo)組成鈣化結(jié)節(jié)面積增加(P<0.001)；和BMP2+ov-NC組相比，BMP2+ov-GCM1組鈣化結(jié)節(jié)面積增加(P<0.001)；和BMP2+sh-NC組比，BMP2+sh-GCM1組鈣化結(jié)節(jié)面積降低(P<0.001)。表明GCM1促進(jìn)BMP2誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞礦化，而抑制GCM1表達(dá)則抑制了BMP2誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞礦化。

2.4 GCM1激活Wnt3a/β-catenin信號

通過Western Blot和RT-qPCR檢測Wnt3a/β-catenin信號水平變化，結(jié)果如圖4所示：和control組相比，BMP2誘導(dǎo)組GCM1、Wnt3a、β-catenin的表達(dá)水平增加(P均<0.001)；和BMP2+ov-NC組相比，BMP2+ov-GCM1組GCM1、Wnt3a、β-catenin的表達(dá)水平增加(P均<0.001)；和BMP2+sh-NC組比，BMP2+sh-GCM1組GCM1、Wnt3a、β-catenin的表達(dá)水平降低(P均<0.01)。表明GCM1在BMP2誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化過程中激活Wnt3a/β-catenin信號。

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMO)引起的疼痛和骨骼變形等癥狀均嚴(yán)重影響并困擾女性患者的生活及工作，帶來的后果也給家庭和社會造成了負(fù)擔(dān)，因此探究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制并為PMO治療提供新的思路具有重要意義。

GEO數(shù)據(jù)庫包含全球各地研究者上傳的各種高通量測序數(shù)據(jù)，在本研究篩選出的GSE56116芯片(包括3例正常、10例PMO患者)中，發(fā)現(xiàn)GCM1在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的血清中低表達(dá)。多項(xiàng)研究[8-9]發(fā)現(xiàn)GCM1能夠促進(jìn)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞分化，但是關(guān)于其在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中的作用機(jī)制還尚未有研究報(bào)道。在骨質(zhì)疏松癥患者中增加骨形成，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和礦化，促使骨形成大于骨吸收，能夠有效緩解骨質(zhì)疏松癥[10]。本研究發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的過程中，GCM1表達(dá)逐漸增加，暗示GCM1與MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的進(jìn)程相關(guān)。ALP是成骨細(xì)胞中的關(guān)鍵標(biāo)記基因，在早期成骨中起關(guān)鍵作用，能夠水解各類磷酸鹽促進(jìn)細(xì)胞成熟和鈣化[11]。在成骨分化后期，轉(zhuǎn)錄因子RUNX2、Osterix促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生骨基質(zhì)[12]，Ostopontin、Collagen Ⅰ在成骨分化過程中逐漸合成，促進(jìn)細(xì)胞附著并刺激成骨細(xì)胞分化[13-14]。本研究通過ALP染色和Western Blot發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GCM1能夠促進(jìn)ALP表達(dá)以及成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，而抑制GCM1表達(dá)則抑制了ALP表達(dá)以及成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)GCM1能夠促進(jìn)BMP2誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化。茜素紅能夠與鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色的化合物，從而能夠檢測到成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞外面沉積的鈣化結(jié)節(jié)，進(jìn)而用來鑒定細(xì)胞株的成骨分化[15]。本研究通過茜素紅染色發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GCM1促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞礦化，而抑制GCM1表達(dá)則抑制MC3T3-E1細(xì)胞礦化。

Wnt/b-catenin信號通路在調(diào)控胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖以及成骨分化和骨形成過程中發(fā)揮重要作用[16-18]。多項(xiàng)研究[19]發(fā)現(xiàn)激活Wnt/β-catenin信號通路能夠促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，緩解骨質(zhì)疏松癥。如敲除Foxf1基因激活Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，防止卵巢切除引起的骨丟失[20]；植物雌激素通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路來預(yù)防去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松癥[21]。此外，還有研究[22]發(fā)現(xiàn)Preptin通過上調(diào)β-catenin表達(dá)促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和成骨;熊果苷通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)MC3T3-E1小鼠成骨前體細(xì)胞增殖和分化[23]。脫鹽鴨蛋蛋白肽通過上調(diào)Wnt3a表達(dá)，激活Wnt/beta-catenin信號通路促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化[24]。這些研究均表明激活Wnt/β-catenin信號通路在PMO的治療中具有重要價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GCM1可以上調(diào)Wnt3a、β-catenin的表達(dá)水平，而抑制GCM1表達(dá)則抑制了Wnt3a、β-catenin的表達(dá)，表明GCM1在MC3T3-E1成骨分化的過程中能夠激活Wnt3a/β-catenin信號通路，暗示GCM1具有治療PMO的潛在價(jià)值。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)GCM1在PMO患者血清中低表達(dá)，過表達(dá)GCM1能夠通過激活Wnt3a/β-catenin信號通路促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化和礦化，改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，為PMO患者的治療提供新的思路和治療方向。