楊豐菁，仇曉亮，張曼，劉欣，秦旭光，朱天剛，王福軍，張莉，胡大一，劉文玲

致心律失常性右心室心肌?。ˋRVC）是一種與心律失常性心原性猝死風險增加相關(guān)的遺傳性心肌疾病，其特征是心室心肌漸進性喪失，被纖維或纖維脂肪組織取代[1]。

ARVC 是青少年和運動員心律失常性猝死的主要原因之一，了解其遺傳特征和病理過程對ARVC的診斷和治療具有重要意義。

在近十余年中，已經(jīng)報道了一些基因的異常導致ARVC。大多數(shù)ARVC 由編碼橋粒蛋白的基因突變引起，如plakophilin-2（PKP2）[2-10]、desmoplakin（DSP）[11]、desmoglein（DSG2）[12-13]、plakoglobin（JUP）[14-15]和desmocollin -2（DSC2）[16-18]。此外，有報道稱一些非橋?；蚺cARVC 相關(guān)，如轉(zhuǎn)化生長因子β3（TGFβ3）[19]、跨膜蛋白43（TMEM43）[20-21]、lamin A/C（LMNA）[22]、desmin（DES）[23]、titin（TTN）[24]、phospholamban（PLN）[25]和αT-Catenin（CTNNA3）[26]。

這些針對ARVC 的遺傳學研究提高了對該病發(fā)病機制的認識。但由于ARVC 的遺傳和臨床異質(zhì)性以及缺乏長期的大隊列家系共分離研究，基因型與表型相關(guān)性研究的結(jié)論不盡相同。更多元的地理和種族背景對拓展研究有很大的幫助。近年來，一些研究對中國ARVC 患者的遺傳變異進行了分析[9,10,27-28]。本研究對32 例ARVC 患者進行了基因型和臨床表型研究，以確定該隊列中橋粒和橋粒外的變異譜，并確定潛在的基因型-表型關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究中32 例ARVC 患者來自ARVC 注冊研究[10]。研究方案經(jīng)北京大學人民醫(yī)院倫理委員會批準。所有患者均獲得知情同意書。

臨床評估包括家族史和患者病史、體格檢查、12 導聯(lián)心電圖、經(jīng)胸超聲心動圖。部分患者接受信號平均心電圖、24 小時動態(tài)心電圖和MRI 檢查。

1.2 基因變異的分析

根據(jù)歐洲心臟病學會、國際工作組標準[29]和2010 工作組更新的診斷標準[30]，研究者對其中32例患者進行了評估。對32 例符合修訂的工作組標準的非相關(guān)漢族患者進行了PKP2、DSP、DSG2、DSC2、JUP、DES、TGFβ3和TMEM43的篩選。從全血樣本中提取基因組DNA。使用PCR 擴增上述基因DNA 片斷，應用DNA 直接測序方法對上述基因全部外顯子及其相鄰內(nèi)含子進行測序[10,31]。由北京天一輝遠生物科技有限公司測序。

所有變異均根據(jù)人類基因組變異學會命名指南[32]，基于參考序列進行命名（DSC2：NM_024422.3；DSG2：NM_001943.3；DSP：N M_004415.2；JUP：NM_021991.2；PKP2：NM_004572.3）。所有的變異都經(jīng)Mutalyzer（http://www.LOVD.nl/mutalyzer）查驗，并通過Mutalyzer（http://www.LOVD.nl/mutalyzer）[33]確認命名。然后所有變異均在ARVC 的遺傳變異數(shù)據(jù)庫(http://www.arvcdatabase.info/Default.aspx）,dbSNP 數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）,1 000 人基因工程數(shù)據(jù)庫（http://www.1000genomes.org）,或外顯子組變異服務器（http://evs.gs.washington.edu/EVS/）檢查。各變異也通過在線PROVEAN 軟件（http://provean.jcvi.org/index.php），SIFT 軟件（http://sift.jcvi.org/）和Polyphen2 分析檢查。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有分析均使用SPSS 22.0 軟件進行。符合正態(tài)分布的連續(xù)變量表示為均數(shù)±標準差，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。分類變量表示為計數(shù)、率或構(gòu)成比。率的比較用卡方檢驗。雙側(cè)P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 32 例患者基線特征

32 例患者中，最常見的臨床表現(xiàn)為心悸，共23 例（71.9%）。16 例（50.0%）表現(xiàn)為暈厥，3 例（9.4%）表現(xiàn)為黑矇。有心臟整體或局部功能異?；蚪Y(jié)構(gòu)改變的患者共28 例（87.5%），復極異常患者24 例（75.0%），除極異?；颊?3 例（71.9%），心律失?；颊?5 例（78.1%）。7 例（21.9%）患者有家族史。

2.2 32 例患者橋粒和橋粒外的變異譜

在18 例（56.3%）患者中發(fā)現(xiàn)了4 個橋?；騊KP2、DSP、DSG2、DSC2的17 個突變，包括6 個新突變（6/17，35.3%）。橋粒外基因未發(fā)現(xiàn)突變。突變總數(shù)為23 個，包括不同患者的相同突變。錯義突變是最常見的突變類型，占47.8%。其次是移碼突變，占26.1%，無義突變、整碼突變和拼接突變分別占13.0%、8.7%和4.3%，各變異情況見表1。

表1 32 例患者基因變異匯總

32 例患者中，11 例（34.4%）存在PKP2突變，3例（9.4%）存在DSP突變，3 例（9.4%）存在DSG2突變，4 例（12.5%）存在DSC2突變。5 例（15.6%）患者出現(xiàn)多個突變?；蛐?表型分析未發(fā)現(xiàn)突變患者與非突變患者、單突變患者與多突變患者在性別、首發(fā)癥狀、年齡、暈厥、V1～V3T 波倒置、Epsilon 波、V1～V3QRS ＞110 ms、24 小時心電圖室性早搏＞500次、非持續(xù)性室性心動過速、心室顫動、陣發(fā)性室上性心動過速 等臨床特征及預后因素存在差異。PKP2突變也未顯示出任何臨床和預后價值，見表2。

表2 32 例ARVC 患者基因突變與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性

3 討論

ARVC 相關(guān)基因目前發(fā)現(xiàn)了15 個，包括5 個橋粒蛋白基因（JUP、DSP、PKP2、DSG2、DSC2）和10 個非橋粒蛋白[34]。本研究篩查了較常見的8 個致病基因，確定了32 例ARVC 患者的基因型。目前發(fā)現(xiàn)PKP2是最常見的致病基因，本研究結(jié)果與之前報道的一致，表明PKP2是最常見的突變基因，占ARVC 患者總數(shù)的34.4%。這提示可能與種族、區(qū)域無關(guān)[35]。PKP2突變的患者與無突變患者間臨床表型無差異。據(jù)報道，DSP是ARVC 患者中僅次于PKP2的第二個常見突變基因[36]。本隊列中，發(fā)現(xiàn)了3 個變異，包括一個新發(fā)現(xiàn)的Q271L突變，其臨床意義尚不清楚。在2 例患者中發(fā)現(xiàn)M1NfsX30，在數(shù)據(jù)庫中顯示是單核苷酸多態(tài)性（SNP）。該隊列中有3 個突變位于DSG2基因高度保守的殘基中，其中R46G 是新發(fā)現(xiàn)的突變。在4 例不相關(guān)的患者中發(fā)現(xiàn)4 個DSC2突變，其中2 例為G790del突變，2 例為新發(fā)現(xiàn)的錯義突變V420L。根據(jù)SIFT和PROVEAN 預測，V420L 可能是一個致病突變。PKP2基因N852fsX930 突變可能是中國人群的一個熱點突變，因為有3 例嚴重的ARVC 患者攜帶這一突變，這在中國的另一項研究中也有相同發(fā)現(xiàn)[8]。然而，由于臨床表現(xiàn)的不同和年齡依賴性外顯率，建議謹慎解釋基因變異。除了在線的in silicon預測外，ARVC 變異數(shù)據(jù)庫（http://www.arvcdatabase.info/Default.aspx）的協(xié)作、雙向更新和及時的臨床隨訪數(shù)據(jù)對于解釋特定的變異非常重要。

值得注意的是，研究中未發(fā)現(xiàn)非橋粒體基因。Bao 等[8]在100 例ARVC 患者中篩選了9 個ARVC 致病基因，共鑒定出59 個突變，其中93%位于橋粒蛋白基因。非橋粒蛋白基因突變僅有4 個（TMEM432 個，TGFβ32 個），提示中國ARVC 人群中非橋粒蛋白基因突變較少。用第一代測序技術(shù)對其進行評價可能產(chǎn)量低，成本高。然而，隨著新一代測序平臺的發(fā)展和突變檢測面板的商業(yè)化，所有致病基因的篩選變得更加容易。

基因型-表型關(guān)系和精準醫(yī)學是近年來研究的熱點和未來醫(yī)學模式。迄今為止，多項研究表明，基因突變可能在ARVC 的臨床表現(xiàn)、嚴重程度和預后中發(fā)揮重要作用。一項北美的研究發(fā)現(xiàn)，PKP2突變的先證者比無PKP2突變的ARVC 先證者更早出現(xiàn)癥狀和心律失常[7]。在一項來自中國人群的研究中，Bao 等[8]報道了突變攜帶者，尤其是PKP2，有室性心動過速病史的比例更高，且更易誘導快速室性心動過速。也有報道DSP突變攜帶者發(fā)生左心室功能不全（40%）和心力衰竭（13%）的幾率是PKP2突變攜帶者的4 倍以上。

一項系統(tǒng)綜述和Meta 分析顯示，橋粒蛋白基因突變患者發(fā)病年齡更早，V1～V3導聯(lián)T 波倒置發(fā)生率更高，且有家族史[37]。然而，本研究結(jié)果顯示，攜帶與未攜帶橋粒蛋白基因突變的兩類患者臨床特征無區(qū)別。這可能與納入的病例數(shù)較少有關(guān)。在本研究中，在5 例患者中發(fā)現(xiàn)了多個突變。據(jù)報道，多種突變在ARVC 人群中普遍存在，其臨床意義備受關(guān)注。在Bauce 等[38]的研究中，多個突變攜帶者顯示心電圖復極改變和左心室受累的發(fā)生率明顯更高，但在短期隨訪中沒有更嚴重的心律失常發(fā)生。根據(jù)Rigato 等[39]的報告，多個突變攜帶者心肌浸潤性改變更多見且有更嚴重的表型，并發(fā)現(xiàn)復合或雙基因雜合突變是終生重大心律失常事件和心原性猝死的較強危險因素。在歐洲的一項隊列研究中，4%的患者發(fā)現(xiàn)具有多個突變的復雜遺傳狀態(tài)，并且與更多的猝死相關(guān)[40]。在本研究中，5 例ARVC 患者中發(fā)現(xiàn)多個突變，其中1 例在20 歲游泳時發(fā)生心原性猝死?；颊叽嬖? 個PKP2復合雜合突變S249T和N852fsX930。無義突變通常預示較差的臨床表型。一項中國ARVC 患者的研究中，Zhou 等[9]對48 例中國漢族ARVC 患者的橋粒體基因突變進行了全面分析，表明左心室受累可能是心臟橋粒蛋白基因無義突變攜帶者的一種跡象。在本研究中，3 例ARVC 患者為無義突變攜帶者，其中1 例左心室壁功能減退，另外2 例左心室正常。這些差異可能與樣本大小、種族、背景和生活方式的差異有關(guān)。

人類遺傳數(shù)據(jù)正在以不斷增長的速度積累，這有助于了解不同個人和人群對常見疾病的易感性。臨床醫(yī)生、患者、衛(wèi)生系統(tǒng)、制藥行業(yè)以及政策制定者對精準醫(yī)療的日益認可，反映了一個正在迅速加速并將對醫(yī)學實踐產(chǎn)生重大影響的領(lǐng)域的出現(xiàn)。事實上，專業(yè)建議和基因檢測在心臟通道疾病和心肌病中的作用開創(chuàng)了精準醫(yī)療時代的工作。隨著DNA 測序技術(shù)的進步和精準醫(yī)學相關(guān)技術(shù)的突破，ARVC 這一致命但可控制的遺傳病有望出現(xiàn)新的診斷、風險分層和治療規(guī)范。

致謝：衷心感謝Frank Marcus 教授和Guy Fontaine 教授對本研究的支持，衷心感謝范玉新教授對本研究的指導，感謝支持過本研究的各位醫(yī)師

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突