賈傳青 郭蘭萍 王曉 于宗淵 陳龍 董紅敬

關(guān)鍵詞黃芩;條芩提取物;枯芩提取物;指紋圖譜;抗炎活性;譜效關(guān)系

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，為臨床常用中藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效[1]。黃芩生長至3年以上者，其根部上段（老根）木心出現(xiàn)中空、腐朽，但下段仍致密、堅實。由其堅實的下段根部所制飲片為條芩，由其中空、腐朽的上段根部所制飲片為枯芩?！侗静萁?jīng)集注》記載：“圓者名條芩為勝，破者名宿芩，其腹中皆爛，故名腐腸，惟取深色堅實者為好”[2];《藥品化義》曰：“一品宜分兩用，蓋枯芩體輕主浮，專瀉肺胃上焦之火，而條芩體重主降，專瀉大小腸下焦之火”[3];《本草易讀》記載：“中枯而飄者名枯芩，瀉肺利氣，止嗽化痰，除風熱，清肌表宜之。細實而堅者名條芩，瀉大腸火，除濕止痢，養(yǎng)陰退陽”[4]。由此可見，條芩與枯芩的劃分是歷代中醫(yī)藥學家的實踐總結(jié)。然而，目前臨床處方均為“黃芩”，并未對條芩和枯芩進行區(qū)分，這可能會影響黃芩臨床應(yīng)用的精準化。

現(xiàn)代研究表明，黃芩含有黃酮、揮發(fā)油、多糖等活性成分，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種藥理活性，其抗炎活性尤為突出[5-8]。炎癥是導(dǎo)致多種疾病的關(guān)鍵因素，包括心腦血管疾病、肺疾病等[9]。因此，從成分及抗炎活性角度探討條芩與枯芩的區(qū)別，對兩者的臨床精準應(yīng)用具有重要的意義。中藥指紋圖譜是中藥譜效關(guān)系研究的基礎(chǔ)，其能夠整體、系統(tǒng)地表征中藥主要化學成分的相似性;化學模式識別可體現(xiàn)樣品間的差異，從而全面、準確地反映樣品的內(nèi)在質(zhì)量[10-11]?；诖?，本研究擬采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法建立條芩和枯芩的指紋圖譜，并進行化學模式識別分析;同時擬采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)RAW264.7 細胞建立炎癥模型，探討條芩、枯芩抗炎活性的差異，并通過灰色關(guān)聯(lián)分析法初步研究其譜效關(guān)系，旨在為條芩與枯芩的抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有ACCHROM-S6000 型HPLC儀[華譜科儀（北京）科技有限公司]，Eclipse Ts2 型倒置顯微鏡（日本Nikon 公司），Spark 型多功能酶標儀（瑞士Tecan 公司），BXM-50VE型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司），Scientz-10N型冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司），DZKW-C型單列雙孔電熱恒溫水浴鍋（上海樹立儀器儀表有限公司），TGL-16A型醫(yī)用離心機（湖南平凡科技有限公司），LAB DANCER S25 型微型渦旋振蕩器（德國IKA 公司），HFsafe-1200LC型生物安全柜、HF90 型CO2培養(yǎng)箱（上海力申科學儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號GP21080140836）購自武漢賽維爾生物科技有限公司;胎牛血清（fetal bovineserum，F(xiàn)BS，批號1928703）購自以色列Biological Industries公司;LPS（批號059M4173V）購自美國Sigma公司;二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號1209M036）、MTT（批號823L051）均購自北京索萊寶科技有限公司;一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒（ 批號032519190612）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;小鼠白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號分別為279559-002、267273-007）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

5 批條芩和5 批枯芩藥材分別購自各地藥材市場、藥房或自采，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學藥學院李佳教授鑒定為唇形科黃芩屬植物黃芩S. baicalensis Georgi 的干燥根。購買或采收后，各藥材樣品按2020 年版《中國藥典》（一部）“黃芩”項下“黃芩片”的制備工藝制成相應(yīng)飲片[1]，備用。5批條芩和5 批枯芩藥材樣品的來源信息見表1。

1.3 細胞

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 細胞株購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 供試品溶液的制備稱取各飲片粉末約0.5 g，加入10 倍量的70%乙醇，稱定質(zhì)量，加熱回流提取2 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%乙醇補足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.45μm微孔濾膜，濾過，即得。

2.1.2 色譜條件以Symmetry? C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～15 min，10%A→20%A;15～36min，20%A→25%A;36～50 min，25%A→38%A;50～55 min，38%A→45%A;55～65 min，45%A→65%A;65～75 min，65%A→80%A;75～80 min，80%A;80～86 min，80%A→10%A;86～91 min，10%A）;流速為1.0 mL/min;檢測波長為280 nm;柱溫為25 ℃;進樣量為5 μL。

2.1.3 精密度試驗取“2.1.1”項下供試品溶液（編號K1），按“2.1.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，以峰5為參照峰（由于峰5 的保留時間適中、分離度良好、峰面積相對較大，故以其為參照峰），計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.14%～0.58%（n=6），相對峰面積的RSD為0.46%～3.21%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗取“2.1.1”項下供試品溶液（編號K1），分別于室溫下放置0、3、6、9、15、24 h 時按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，以峰5 為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.17%～1.14%（n=6），相對峰面積的RSD為1.23%～4.66%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗精密稱取飲片樣品（編號K1）粉末，共6 份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，以峰5 為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.14%～0.64%（n=6），相對峰面積的RSD為0.67%～3.76%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 指紋圖譜的建立分別取5 批條芩、5 批枯芩飲片樣品粉末，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》，以色譜峰分離度好、信號強度相對較高的K1 樣品為參照，經(jīng)多點校正后，采用中位數(shù)法生成條芩和枯芩的HPLC疊加指紋圖譜及對照指紋圖譜（R）。結(jié)果顯示，5批條芩和5批枯芩飲片共有15個共有峰，詳見圖1。

2.1.7 相似度評價以對照指紋圖譜（R）為參照，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》對5 批條芩和5 批枯芩的指紋圖譜進行相似度評價。結(jié)果顯示，5 批條芩和5 批枯芩指紋圖譜與對照圖譜的相似度均大于0.990，表明指紋圖譜暫無法區(qū)分條芩與枯芩。結(jié)果見表2。

2.2 主成分分析

以15 個共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA 14.1軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。結(jié)果顯示，所建PCA模型的解釋能力參數(shù)（R2X）為0.962，預(yù)測能力參數(shù)（Q2）為0.613，均大于0.5，表明該模型擬合良好[12]。條芩與枯芩分別位于PCA得分圖（圖2）的兩側(cè)，其中條芩的聚集程度較高，枯芩則較分散，提示該法可區(qū)分條芩與枯芩。載荷圖中，變量離原點越遠，表示其對主成分的影響權(quán)重越大[13]。由共有峰的PCA 載荷圖（圖3）可知，主成分1 的主要信息來自于峰1、3～4、6、10～15，主成分2 的主要信息來自于峰2、5、7～9，其中對主成分1 影響權(quán)重較大的變量為峰12、14、15，對主成分2影響權(quán)重較大的變量為峰2、7。

2.3 正交偏最小二乘法-判別分析

以15 個共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA 14.1軟件進行正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partialleast-squares discrimination analysis，OPLS-DA）。變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）是評價變量對分類貢獻的常用指標，VIP 值>1 表示該變量對分類的貢獻率較大，為組間特征性成分[14]。本研究以VIP 值>1 為標準篩選影響條芩和枯芩質(zhì)量的差異標志物。結(jié)果顯示，共有8 個峰的VIP值>1，依次為峰14、12、15、6、10、13、11、4，表明這8 個峰對應(yīng)的成分可能是影響條芩和枯芩質(zhì)量的差異標志物。結(jié)果見圖4。

2.4 抗炎活性的測定

2.4.1 提取物和樣品母液的制備取條芩、枯芩飲片各約30 g，加入10 倍量的70%乙醇，加熱回流提取2 h，濾過，取濾液，減壓濃縮至無醇味，冷凍干燥，制得各飲片樣品的提取物凍干粉（得率為47%～52%）。稱取各凍干粉10 mg，加DMSO 溶解，制成質(zhì)量濃度均為200mg/mL（以提取物質(zhì)量計）的樣品母液，備用。

2.4.2 細胞毒性評價采用MTT法進行檢測。取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞，按1.0×106個/mL 接種于96 孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（培養(yǎng)條件下同）后，棄去上清液。將細胞分為空白對照組和給藥組，每組設(shè)置6 個復(fù)孔。空白對照組加入含5%FBS 的DMEM高糖培養(yǎng)基，給藥組加入不同濃度的樣品溶液（質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、400 μg/mL，取“2.4.1”項下樣品母液，用含5%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋而得，質(zhì)量濃度參考前期預(yù)實驗設(shè)置），每孔100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，按50 μL/孔加入1 mg/mL 的MTT溶液;繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，棄去上清液，每孔加入DMSO 100 μL，采用酶標儀于490 nm 波長下檢測各孔的吸光度（A）值，并按下式計算細胞存活率（%）：細胞存活率（%）=（A 給藥組/A 空白對照組）×100%。結(jié)果顯示，經(jīng)25～400 μg/mL的提取物作用24 h 后，各給藥組細胞的平均存活率均大于97%，表明各質(zhì)量濃度的條芩和枯芩提取物對細胞均無毒性，詳見表3。

2.4.3 NO抑制率的測定取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，按1.0×106個/mL接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，棄去上清液。將細胞分為空白對照組、LPS 模型組和給藥組，每組設(shè)置4 個復(fù)孔。空白對照組加入含5%FBS 的DMEM高糖培養(yǎng)基，LPS模型組加入含500 ng/mL LPS、5%FBS 的DMEM高糖培養(yǎng)基[15]，給藥組加入50 μg/mL樣品溶液（質(zhì)量濃度根據(jù)前期預(yù)實驗和“2.4.2”項下實驗結(jié)果設(shè)置），每孔100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，取每孔上清液50 μL，接種至新的96 孔板中，根據(jù)NO檢測試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀于540 nm波長下檢測各孔的A 值，采用格里斯法計算NO含量并根據(jù)標準曲線計算NO釋放量，再按下式計算NO抑制率：NO抑制率（%）=（NO釋放量LPS 模型組-NO釋放量給藥組）/NO 釋放量LPS 模型組×100%。采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行分析，數(shù)據(jù)均以x ± s 表示，采用t 檢驗，檢驗水準α =0.05。采用GraphPad Prism 8.0 軟件計算各樣品的半數(shù)有效濃度（median effective concentration，EC50）。

測定結(jié)果顯示，50 μg/mL 枯芩提取物的NO抑制率為62.14%～71.13%，條芩提取物為39.52%～50.19%，前者的平均值顯著高于后者（P<0.05）;枯芩提取物的EC50為18.81～34.10 μg/mL，條芩提取物為46.67～68.34μg/mL，前者的平均值顯著低于后者（P<0.05）。結(jié)果見表4。

2.4.4 IL-6、IL-1 β 抑制率的測定取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞，按1.0×106個/mL 接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，棄去上清液。將細胞分為空白對照組、LPS模型組和給藥組，每組設(shè)置4 個復(fù)孔?？瞻讓φ战M加入含5%FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基，LPS 模型組加入含500 ng/mL LPS、5%FBS 的DMEM高糖培養(yǎng)基[15]，給藥組加入50 μg/mL的樣品溶液（質(zhì)量濃度根據(jù)前期預(yù)實驗和“2.4.2”項下實驗結(jié)果設(shè)置），每孔100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，取每孔上清液30 μL，根據(jù)ELISA試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀于470 nm 波長下檢測各孔的A值，根據(jù)標準曲線計算IL-6、IL-1β的釋放量，并按下式計算IL-6 或IL-1β的抑制率（%）：抑制率（%）=（IL-6 或IL-1β釋放量LPS 模型組-IL-6 或IL-1β釋放量給藥組）/IL-6 或IL-1β釋放量LPS模型組×100%。統(tǒng)計學方法同“2.4.3”項。

測定結(jié)果顯示，50 μg/mL 枯芩提取物對IL-6、IL-1β的抑制率分別為3.32%～18.38%、93.12%～95.47%，條芩提取物分別為6.21%～22.55%、94.10%～96.44%;其中枯芩提取物的平均IL-6 抑制率顯著低于條芩提取物（P<0.05），而枯芩與條芩提取物的平均IL-1β抑制率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)果見表4。

2.5 灰色關(guān)聯(lián)分析2.5.1 原始數(shù)據(jù)的無量綱化處理由于原始數(shù)據(jù)數(shù)列單位或量綱不同，不便于比較，因此在進行灰色關(guān)聯(lián)分析前需要對數(shù)據(jù)進行無量綱化處理。本研究采用均值變換法，即用各序列元素分別除以相應(yīng)序列平均值。將NO、IL-6、IL-1β抑制率均值化處理后的數(shù)據(jù)設(shè)為參考序列Y（k）（k=1、2、3…10，為樣品編號），15 個共有峰峰面積均值化處理后的數(shù)據(jù)設(shè)為比較序列Xi（k）（i=1、2、3…15，為共有峰峰號），按下式計算絕對差序列Δi（k）：Δi（k）=|Y（k）-Xi（k）|[16]。

2.5.2 關(guān)聯(lián)系數(shù)的計算對于參考序列Y（k）有若干個比較序列Xi（k），絕對差序列中的最小值與最大值分別記為Δ（min）、Δ（max）;ρ為分辨系數(shù)，一般為0～1，通常取0.5;按下式計算關(guān)聯(lián)系數(shù)ξi（k）：ξi（k）=[Δ（min）+ρ×Δ（max）]/[Δi（k）+ρ×Δ（max）]。本研究中，參考序列為NO 抑制率時，Δ（min）=0.001 3，Δ（max）=1.782 5;參考序列為IL-6 抑制率時，Δ（min）=0.033 8，Δ（max）=2.639 8;參考序列為IL-1β抑制率時，Δ（min）=0.001 3，Δ（max）=1.971 7。

2.5.3 關(guān)聯(lián)度的計算關(guān)聯(lián)度（r）為各類關(guān)聯(lián)系數(shù)的平均值，按下式計算：r=1nΣk=1nξi（k）（式中，n 表示比較序列的數(shù)據(jù)個數(shù)）[16-17];當r≥0.9 時，表示子序列對母序列有顯著影響;當0.8≤r<0.9 時，表示有相對顯著影響;當0.7≤r<0.8 時，表示有明顯影響;當0.6≤r<0.7 時，表示有較小影響[18]。結(jié)果顯示，條芩與枯芩提取物中15 個共有峰與各炎癥因子抑制率的關(guān)聯(lián)度均大于0.6;與NO抑制率的關(guān)聯(lián)度由大到小依次為峰3>峰2>峰7>峰6>峰10>峰5>峰11>峰8>峰14>峰9>峰4>峰1>峰15>峰13>峰12，與IL-6 抑制率的關(guān)聯(lián)度由大到小依次為峰9>峰8>峰5>峰7>峰2>峰6>峰1>峰3>峰10>峰11>峰14>峰4>峰15>峰13>峰12，與IL-1β抑制率的關(guān)聯(lián)度由大到小依次為峰5>峰9>峰2>峰8>峰7>峰3>峰6>峰1>峰10>峰14>峰11>峰4>峰13>峰15>峰12。其中，峰2～3、5～8、10～11 與NO抑制率的關(guān)聯(lián)度均大于0.8;峰2、5、8～9 與IL-1β抑制率的關(guān)聯(lián)度均大于0.9;各峰與IL-6 抑制率的關(guān)聯(lián)度均小于0.8。由于條芩和枯芩提取物對IL-6 的抑制率均較低，對NO、IL-1β的抑制率均較高，初步確定峰2～3、5～11 為黃芩抗炎活性的主要成分;同時，結(jié)合“2.3”項下結(jié)果，初步確定峰6、10～11 為造成條芩與枯芩抗炎活性差異的主要化學成分。結(jié)果見表5。

2.6 聚類分析

以50 μg/mL 濃度下各組細胞的NO、IL-1β、IL-6 抑制率為指標，利用平方歐氏距離為測度，采用SPSS 26.0軟件進行聚類分析。結(jié)果顯示，當平方歐氏距離為25時，10 批樣品可聚為2 類，K1～K5 為一類，T12～T16 為一類，表明可將NO、IL-1β、IL-6 抑制率作為區(qū)分條芩與枯芩的指標。結(jié)果見圖5。

3 討論

本研究建立了5 批條芩和5 批枯芩的HPLC指紋圖譜，確定了15 個共有峰，相似度均大于0.990，表明指紋圖譜不能區(qū)分條芩和枯芩。PCA結(jié)果顯示，條芩與枯芩分別位于得分圖的兩側(cè)，其中條芩的聚集程度較高，枯芩則較分散，提示該法可區(qū)分條芩和枯芩。同時，推測枯芩較為分散的原因可能與采收年限的不同有關(guān)。OPLS-DA結(jié)果顯示，有8個峰的VIP值>1，表明這8個峰對應(yīng)的成分可能是影響條芩和枯芩質(zhì)量的差異標志物。

由于NO是氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要介質(zhì)，而氧化應(yīng)激能參與并加劇炎癥反應(yīng);腫瘤壞死因子α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）、IL-1β、IL-6 是由巨噬細胞產(chǎn)生的促炎性細胞因子，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生;NO、TNF-α、IL-1β、IL-6 是學者們關(guān)注較多的炎癥因子[19]，加之本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在50 μg/mL 質(zhì)量濃度下，條芩和枯芩提取物對TNF-α無明顯的抑制作用，但對IL-1β的抑制作用顯著，雖然條芩和枯芩提取物對IL-6 的抑制作用較弱，但組間比較仍有顯著的差異性，故綜合考慮，選擇NO、IL-1β、IL-6 作為評價條芩和枯芩抗炎活性差異的指標。

本研究結(jié)果顯示，各給藥組的NO抑制率、IL-6 抑制率差異顯著，兩種提取物對IL-1β的抑制率均較高。為在相同質(zhì)量濃度下比較提取物對各炎癥因子的抑制率，故僅對50 μg/mL 提取物對應(yīng)的數(shù)據(jù)進行比較。結(jié)果顯示，在50 μg/mL 質(zhì)量濃度下，枯芩提取物的平均NO抑制率顯著高于條芩提取物，平均EC50、平均IL-6 抑制率均顯著低于條芩提取物;兩種提取物對IL-1β的抑制率均大于90%。這表明在50 μg/mL 質(zhì)量濃度下，枯芩提取物對NO的抑制作用較強，但對IL-6 的抑制作用較弱，對IL-1β的抑制作用與條芩提取物相當。

灰色關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，峰2～3、5～8、10～11 與NO抑制率的關(guān)聯(lián)度均大于0.8;峰2、5、8～9 與IL-1β抑制率的關(guān)聯(lián)度均大于0.9;各峰與IL-6 抑制率的關(guān)聯(lián)度均小于0.8。聚類分析結(jié)果顯示，當平方歐氏距離為25時，10 批樣品可聚為2 類，K1～K5 為一類，T12～T16 為一類，表明可將NO、IL-1β、IL-6 抑制率作為區(qū)分條芩與枯芩的指標。結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)分析和OPLS-DA 結(jié)果，初步確定峰6、10～11 為條芩和枯芩抗炎活性差異的主要化學成分。這表明黃芩的抗炎活性是多種成分共同作用的結(jié)果，該結(jié)果可為條芩和枯芩功效差異的進一步研究提供依據(jù)。

綜上所述，在50 μg/mL 質(zhì)量濃度下，枯芩提取物對NO的抑制作用較強，但對IL-6的抑制作用較弱，對IL-1β的抑制作用與條芩提取物相當;初步確定峰6、10～11 對應(yīng)成分是條芩和枯芩抗炎活性差異的主要化學成分。