吳昊 努蘭·拜都拉 劉琳玉 任艷利

關(guān)鍵詞沒食子酸;食管癌;凋亡;活性氧;TE-1 細胞

食管癌作為全世界發(fā)病率和病死率前10 位的癌癥，其治療情況和患者預(yù)后情況均較差[1-2];特別是在中國，食管癌的發(fā)病率和病死率分列第4 位和第6 位，均超過世界平均水平的2 倍[3]。根據(jù)全球癌癥觀察站的預(yù)測結(jié)果，我國男性食管癌新發(fā)病例數(shù)占比將超過全球新發(fā)食管癌病例數(shù)的一半[4]。食管癌患者的早期癥狀并不明顯，而當(dāng)患者出現(xiàn)明顯的吞咽梗阻、聲音沙啞或淋巴結(jié)腫大則提示其病情已進入晚期[5]。目前，食管癌的治療以手術(shù)切除、放化療為主，其中手術(shù)切除常伴隨著出血、穿孔、食管狹窄和感染等多種并發(fā)癥，而放化療會引發(fā)營養(yǎng)不良、骨髓抑制、肝腎功能損害和神經(jīng)系統(tǒng)毒性等明顯的毒副作用[6]?？梢?，尋找新的治療方案和新型藥物來改善食管癌患者的治療效果顯得尤為重要。

沒食子酸（gallic acid，GA）的分子式為C7H6O5，是一種多酚類化合物，通常為白色或淡黃色的針狀結(jié)晶，易溶于水和乙醇，具有抗氧化、抗菌和抗腫瘤等廣泛生理活性[7]。該成分在自然界中分布廣泛，是五倍子、大葉桉、紅景天等多種傳統(tǒng)中藥的主要活性成分之一[8]。已有研究表明，GA 能夠抑制人肺癌A549 細胞的增殖和遷移，并可通過調(diào)節(jié)Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription3，JAK/STAT3）信號通路及下游凋亡分子來增強順鉑的抗腫瘤作用[9]。另有研究表明，GA能夠提高活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，從而可誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細胞瘤細胞、膀胱癌細胞、人乳腺癌細胞以及黑色素瘤細胞的凋亡[10-12]。基于此，本研究擬以人食管癌TE-1 細胞為對象，首先考察GA對細胞增殖、遷移和集落形成能力的影響，其次探究該成分對TE-1 細胞ROS水平的影響，最后根據(jù)GA處理后TE-1 細胞內(nèi)凋亡相關(guān)因子B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）、胱天蛋白酶3（caspase-3）、caspase-9 以及細胞周期蛋白D1（cyclinD1）、cyclin D3 的表達水平來探索GA治療食管癌的潛在機制，以期為該成分抗腫瘤作用的闡釋以及食管癌的治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），Cyto-FLEX 型流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司），Galaxy 170S 型恒溫二氧化碳（CO2）細胞培養(yǎng)箱、5430 型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司），Mini-PROTEANTetra 型蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀、GS-900 型校準(zhǔn)型密度計（美國Bio-Rad 公司），Ti-s 型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司），HH-2 型電熱恒溫水浴鍋（上海力辰儀器科技有限公司），BSA124S 型電子天平（德國Sartorius 公司），SX-500 型高壓滅菌鍋[天美（中國）科學(xué)儀器有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

GA 對照品（批號63262，純度≥98%）購自美國MCE公司;胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶（批號分別為RB35941、AF29531042、J180022）均購自美國HyClone 公司;Annexin Ⅴ/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（批號0315976）購自美國BD公司;MTT試劑（批號0793）購自合肥白鯊生物科技有限公司;磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered solution，PBS，pH7.4，批號69092500）購自北京索萊寶科技有限公司;細胞熒光計數(shù)（cell fluorescencecounting kit-F，CCK-F）試劑盒、ROS 熒光探針（DCFH-DA）試劑盒、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號分別為122920210601、S0033S、082020201106），兔源Bcl-2、caspase-3、cyclin D1 單克隆抗體（批號分別為090220210406、121520210422、020321210405），鼠源Bax、caspase-9、cyclin D3、β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（ 批號分別為090920210311、090820210407、021219210413、120319201012），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 二抗（批號分別為020821210409、121020210409），以及RIPA 裂解液等Western blot 相關(guān)試劑均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;二甲基亞砜等其余試劑均購自天津北聯(lián)試劑廠;水為雙蒸水。

1.3 細胞

人食管癌細胞TE-1 購自武漢普諾賽生物科技有限公司，批號為CL-0231。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將人食管癌TE-1 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100u/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于37.5 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 細胞增殖活性的檢測

采用MTT 法進行檢測。取對數(shù)生長期的TE-1 細胞，調(diào)整細胞密度至1×105個/mL，按每孔100 μL接種于96 孔板中，培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后，分為給藥組和對照組（每組設(shè)置6 個復(fù)孔），并另設(shè)空白調(diào)零孔（不加細胞和藥物，只加培養(yǎng)基）。給藥組加入含GA 100、200、300、400、500 μmol/L（濃度依據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置）的培養(yǎng)基（無雙抗）100 μL，對照組加入同體積的培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)24 h 和48 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT試劑20μL，孵育2 h;棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜200 μL，振蕩10 min 使充分溶解，用酶標(biāo)儀于570 nm 波長下檢測吸光度（A）值，通過以下公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（給藥組A值-空白調(diào)零孔A值）/（對照組A值-空白調(diào)零孔A 值）×100%。采用SPSS 26.0 軟件計算GA作用不同時間后對細胞的半數(shù)抑制濃度（medianinhibitory concentration，IC50）。

2.3 細胞形態(tài)和細胞活性的檢測

采用CCK-F 法和倒置熒光顯微鏡進行檢測、觀察。取對數(shù)生長期的TE-1 細胞，調(diào)整細胞密度至1×105 個/mL，按每孔100 μL接種于96 孔板中，待細胞貼壁后，分為給藥組和對照組，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。給藥組加入含GA 100、300、500 μmol/L（濃度依據(jù)“2.2”項下實驗結(jié)果設(shè)置）的培養(yǎng)基100 μL，對照組加入同體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，采用倒置熒光顯微鏡觀察TE-1 細胞的形態(tài)變化;同時，采用CCK-F法檢測TE-1 細胞數(shù)量變化，按其試劑盒說明書方法進行操作。

2.4 細胞遷移情況的檢測

采用劃痕實驗進行檢測。取對數(shù)生長期的TE-1 細胞，調(diào)整細胞密度至1×106個/mL，按每孔2 mL接種于6孔板中，培養(yǎng)4 h，待細胞基本長滿時，使用10 μL白槍頭在皿底作筆直的劃痕，用PBS 沖洗細胞2 次。將細胞分為給藥組和對照組，給藥組加入含GA 100、300、500μmol/L（濃度依據(jù)“2.2”項下實驗結(jié)果設(shè)置）的培養(yǎng)基1mL，對照組加入同體積的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)0、4、12、24 h 時觀察并拍照，用Image J 軟件分析劃痕面積并按以下公式計算24 h 時的相對劃痕愈合率：相對劃痕愈合率（%）=（0 h 時劃痕面積-培養(yǎng)24h 時劃痕面積）/0 h 時劃痕面積×100%。

2.5 細胞集落形成的檢測

采用平板集落形成實驗進行檢測。取對數(shù)生長期的TE-1 細胞，調(diào)整細胞密度至1×103個/mL，按每孔1 mL接種于6 孔板中，待細胞貼壁后，分為給藥組和對照組，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。棄去培養(yǎng)基，給藥組加入含GA 5、10、15、20、25 μmol/L（濃度依據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置）的培養(yǎng)基2 mL，對照組加入同體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)10 d后，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗3 次;以10%甲醛溶液室溫固定15 min，用PBS沖洗3 次，再以結(jié)晶紫染色3 min，用PBS洗去浮色，采用Image J 1.8.0 軟件分析集落數(shù)量（肉眼可見的集落也計算在內(nèi)）并按下列公式計算集落形成相對數(shù)量：集落形成相對數(shù)量（%）=（給藥組集落數(shù)量/對照組集落數(shù)量）×100%。

2.6 細胞凋亡的檢測

采用流式細胞術(shù)進行檢測。取對數(shù)生長期的TE-1細胞，調(diào)整細胞密度至1×106個/mL，按每孔2 mL接種于6 孔板中，待細胞貼壁后，分為給藥組和對照組，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。棄去培養(yǎng)基，給藥組加入含GA 100、300、500 μmol/L（濃度依據(jù)“2.2”項下實驗結(jié)果設(shè)置）的培養(yǎng)基2 mL，對照組加入同體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，收集細胞，加入Annexin Ⅴ-FITC 和PI 染料，室溫避光染色15 min，過濾，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.7 細胞內(nèi)ROS水平的檢測

采用DCFH-DA 法進行檢測。DCFH-DA 能夠自由進入細胞膜并在細胞內(nèi)被酯酶水解為DCFH，細胞內(nèi)的ROS能夠氧化無熒光的DCFH使其變?yōu)橛袩晒獾腄CF，檢測其熒光強度即可反應(yīng)ROS水平。取對數(shù)生長期的TE-1 細胞，調(diào)整細胞密度至1×105個/mL，按每孔100 μL接種于96 孔板中，待細胞貼壁后，分為給藥組和對照組，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。給藥組加入含GA 100、200、300、400、500 μmol/L（濃度依據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置）的培養(yǎng)基100 μL，對照組加入同體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，收集細胞，于稀釋好的DCFH-DA中吹散，37 ℃避光孵育30min，每隔5 min取出混勻。孵育完成后，用無血清的培養(yǎng)基洗滌細胞2次，利用FITC通道檢測各孔的熒光強度，通過ModfitLT 5 軟件分析其平均熒光強度，再按以下公式計算ROS水平：ROS水平（%）=給藥組的平均熒光強度/對照組的平均熒光強度×100%。

2.8 細胞中caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax、cyclinD1、cyclin D3 蛋白表達的檢測

采用Western blot 法進行檢測。取對數(shù)生長期的TE-1 細胞，調(diào)整細胞密度至1×105個/mL，按每孔100 μL接種于96 孔板中，待細胞貼壁后，分為給藥組和對照組，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。給藥組加入含GA 100、200、300、400、500 μmol/L（濃度依據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置）的培養(yǎng)基100 μL，對照組加入同體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，收集細胞，使用RIPA裂解液及苯甲基磺酰氟提取總蛋白，以BCA法檢測蛋白濃度，參照最低濃度對所有蛋白濃度進行歸一化處理后，在蛋白樣品中加入上樣緩沖液，沸水浴中放置3 min 使變性。取變性蛋白適量，進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（分離膠電壓70 V，濃縮膠電壓110 V，電泳時間120 min）后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（電流300 mA;轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)蛋白大小決定，一般1 kDa 轉(zhuǎn)膜1 min）上;用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別按1 ∶1 000的稀釋比例加入各目的蛋白和內(nèi)參蛋白（β-actin）一抗，4 ℃孵育過夜;用TBST緩沖液洗膜3次，按1 ∶1 000 的稀釋比例加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h;用TBST緩沖液洗膜3次，加入ECL發(fā)光液適量，于暗室內(nèi)曝光，使用Image J 1.8.0軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為目的蛋白的表達水平。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。每組實驗至少重復(fù)3 次。計量資料用x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 GA對細胞存活率的影響

不同濃度（100、200、300、400、500 μmol/L）的GA處理24 h 和48 h 對TE-1 細胞均有明顯的抑制作用，且該抑制作用具有一定的濃度和時間依賴趨勢。24 h 和48h 時，GA 的IC50 分別為（281.22 ± 26.81）μ mol/L 和（220.90±31.15）μmol/L。結(jié)果見圖1。

3.2 GA對細胞形態(tài)和細胞活性的影響

CCK-F 結(jié)果顯示，隨著GA濃度的增加，TE-1 細胞數(shù)量明顯減少，且細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化;當(dāng)GA濃度為500 μmol/L 時，TE-1 細胞排列稀疏，細胞體積縮小、變圓，細胞核固縮，染色質(zhì)凝集。結(jié)果見圖2。

3.3 GA對細胞遷移的影響

對照組細胞的劃痕面積隨時間的延長而不斷縮小，在24 h 時其相對劃痕愈合率可達（62.31±2.41）%。隨著GA濃度的增加，各給藥組細胞的相對劃痕愈合率均顯著下降（P<0.01或P<0.05）;當(dāng)GA濃度為500 μmol/L時，相對劃痕愈合率為（6.71±1.33）%，且GA的抑制遷移作用有濃度依賴趨勢。結(jié)果見圖3、圖4。

3.4 GA對細胞集落形成的影響

在培養(yǎng)10 d 后，對照組存在大量肉眼可見的細胞集落;與對照組比較，各給藥組細胞集落形成相對數(shù)量均顯著減少（P<0.01 或P<0.05），且有隨GA濃度增加而減少的趨勢。結(jié)果見圖5、圖6。

3.5 GA對細胞凋亡的影響

當(dāng)TE-1 細胞經(jīng)不同濃度（100、300、500 μmol/L）的GA 作用24 h 后，其凋亡率分別為（6.21 ± 0.32）% 、（12.59±0.58）%和（15.41±0.41）%，對照組TE-1 細胞的凋亡率為（5.29±0.28）%。與對照組比較，各給藥組細胞的凋亡率均顯著升高（P<0.01 或P<0.05），且有隨著GA濃度增加而升高的趨勢。結(jié)果見圖7、圖8。

3.6 GA對細胞ROS水平的影響

經(jīng)DCFH-DA染色后，與對照組比較，除100 μmol/L的GA外，其余給藥組細胞的熒光強度和ROS水平均顯著升高（P<0.01 或P<0.05），且均有隨著GA濃度增加而升高的趨勢。結(jié)果見表1、圖9。

3.7 GA 對細胞中Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、cyclin D3 和cyclin D1 蛋白表達的影響

與對照組比較，各給藥組細胞中Bcl-2（僅GA 200μmol/L 組）、Bax（GA 100 μmol/L 組除外）、caspase-3、caspase-9（GA 100 μmol/L組除外）的表達水平均顯著升高（P<0.01 或P<0.05），Bcl-2（GA 100、200 μmol/L 組除外）、cyclinD1、cyclin D3 蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.01 或P<0.05），且均有一定的濃度依賴趨勢。結(jié)果見圖10、圖11。

4 討論

在我國，食管癌是較為高發(fā)的惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病位置特殊、誘發(fā)因素較多、早期癥狀不明顯、傳統(tǒng)手術(shù)和化療藥物對患者傷害較大等諸多原因，使得其整體治療水平尚未令人滿意[13]。

ROS 形式多樣，如超氧陰離子（O2 -）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（HO·）等。在正常的代謝過程中，機體會不斷產(chǎn)生ROS，后者會被一些抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶）和一些具有還原作用的小分子（如維生素C和還原型谷胱甘肽）所消耗，從而維持機體氧化與抗氧化的動態(tài)平衡[14]。不同濃度的ROS 對細胞有著不同的作用：高濃度的ROS 會破壞質(zhì)膜的完整性，影響actin 骨架的動力學(xué)穩(wěn)定性，造成DNA損傷，并導(dǎo)致正常的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制受損;而低濃度的ROS可能會促進細胞的增殖和分化，并可能會誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[15]。有研究指出，與正常組織細胞相比，腫瘤細胞處于較高的氧化還原狀態(tài)，可通過提高腫瘤細胞的ROS水平來使其先于正常細胞達到ROS的死亡閾值;換言之，腫瘤細胞對ROS的敏感性高于正常細胞。這一特點使ROS 對腫瘤細胞具有一定的選擇性殺傷能力[16]。范桂娟[17]的研究也證實，在由白藜蘆醇衍生物和Cu（Ⅱ）構(gòu)建的促氧化體系中，ROS對肝癌細胞HepG2 的毒性顯著高于正常細胞L02。

本研究發(fā)現(xiàn)，GA能明顯抑制食管癌TE-1 細胞的活力，并且呈一定的時間和劑量依賴趨勢;劃痕實驗和集落形成實驗結(jié)果顯示，GA能夠顯著抑制TE-1細胞的集落形成能力和遷移能力，且其在較低濃度（5～25 μmol/L）就能體現(xiàn)較強的集落形成抑制能力。凋亡檢測結(jié)果顯示，GA處理24 h 能明顯提高TE-1 細胞的凋亡水平，且有隨著藥物濃度增加而升高的趨勢。

為了進一步探究GA誘導(dǎo)食管癌TE-1 細胞的凋亡機制，本研究檢測了經(jīng)不同濃度GA處理后細胞中ROS水平的變化，結(jié)果顯示，隨著GA濃度的增加，TE-1 細胞內(nèi)的ROS水平也隨之提高。隨后的Western blot 結(jié)果顯示，與對照組比較，300～500 μmol/L的GA能使抗凋亡蛋白Bcl-2 蛋白的表達水平顯著降低，200～500 μmol/L 的GA能使促凋亡蛋白Bax 蛋白的表達水平顯著上升;同時，GA能夠提高caspase-3、caspase-9 的表達水平，降低cyclin D1、cyclin D3 的表達水平，且有濃度依賴趨勢。caspase 家族是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的全稱，其中caspase-9 可與細胞色素、凋亡酶激活因子形成復(fù)合物，從而激活caspase-9;激活的caspase-9 可再激活細胞凋亡的關(guān)鍵啟動者caspase-3，從而誘導(dǎo)后續(xù)的細胞凋亡[18]。cyclin D1 和cyclin D3 均為cyclin 家族成員，其主要作用是對細胞周期進行正調(diào)控，促進細胞增殖，其中cyclin D1 是細胞進入G1期的關(guān)鍵蛋白，其表達上調(diào)會導(dǎo)致G1/S 期檢測點失效，從而造成細胞越過此檢測點而直接進入S 期，允許未經(jīng)修復(fù)的突變DNA進行復(fù)制，最終增加癌癥發(fā)生的風(fēng)險[19]。cyclin D1 和cyclin D3 在不同組織中有著明顯的表達差異，Yu 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，cyclinD1 的過量表達和胃癌的病理程度沒有明顯的相關(guān)性，但cyclin D3 的表達卻與胃癌惡性程度存在明顯關(guān)聯(lián)。

綜上所述，GA能夠抑制TE-1 細胞的增殖、遷移和集落形成，其機制可能是通過提高食管癌TE-1 細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生水平來啟動凋亡，并通過上調(diào)Bax、caspase-3、caspase-9 的表達和下調(diào)Bcl-2、cyclin D1、cyclinD3 的表達來實現(xiàn)凋亡。本研究結(jié)果為闡明GA抑制食管癌的作用機制提供了一定的理論基礎(chǔ)，然而將GA作為抗食管癌的特效藥物并應(yīng)用于臨床，還需要大量深入研究以完善其具體的作用機制。