劉蘭寧 唐煥珍 李曉媛

牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是具有多能分化和自我更新能力的間充質(zhì)干細胞，在組織修復(fù)和再生中發(fā)揮重要作用，已廣泛應(yīng)用于免疫疾病、口腔疾病、脊髓損傷、心肌梗死等疾病的治療[1]。DPSCs在正?；虿±項l件下均可分泌直徑為30～100 nm的微小囊泡，即DPSCs來源外泌體，在組織缺損修復(fù)過程中，DPSCs首先遷移至受損的組織區(qū)域，然后釋放外泌體參與細胞間旁分泌的相互作用，通過誘發(fā)內(nèi)源性修復(fù)過程來發(fā)揮治療作用[2,3]。作為組織損傷的新型療法，DPSCs外泌體療法相較于傳統(tǒng)干細胞治療，不需要直接使用細胞，從而避免細胞移植相關(guān)的限制和風(fēng)險[4]。miRNA是長度約為22～26個核苷酸的非編碼RNA，可調(diào)節(jié)細胞增殖、代謝、凋亡和器官發(fā)育等多種病理生理過程[5]。研究表明，miRNA可調(diào)節(jié)巨噬細胞極化以及隨后的炎性反應(yīng)[6]；miR-124修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體負調(diào)控Ern1，從而促進巨噬細胞M2型極化并減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷[7]。而miR-124修飾的大鼠牙髓干細胞(rat dental pulp stem cells，rDPSCs)來源外泌體對巨噬細胞極化的影響尚未見報道，因此本研究通過提取miR-124修飾的rDPSCs來源外泌體并作用于皮膚缺損大鼠，觀察其對巨噬細胞極化的影響以及治療效果，以期為組織的再生調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡，體重為180～200 g，雄性SD大鼠購自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司，許可證號為：SCXK(粵)2020-0055。本研究得到了本院動物實驗倫理委員會的批準，所有動物實驗遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器 miR-124模擬物(miR-124 mimics)及其陰性對照(miR-NC)均購自廣州基迪奧生物科技有限公司；Trizol試劑、ELISA檢測試劑盒、BCA試劑盒均購自賽默飛世爾科技中國有限公司；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自Sigma-Aldrich公司；TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TransStart?Green qPCR SuperMix、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；CD63、CD81、TNF-α、TNF-1β、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、GAPDH兔多克隆抗體(anti-CD63、anti-CD81、anti-TNF-α、anti-TNF-1β、anti-IL-6、anti-IL-4、anti-IL-10、anti-IL-13、anti-GAPDH)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗均購自美國Abcam公司；CO2培養(yǎng)箱購自德國SIGMA公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 rDPSCs的分離與培養(yǎng)[8]用頸椎脫臼法處死大鼠后，無菌條件下取出下頜骨，并剝離頜骨表面的肌肉和組織，待暴露出頜牙后，建立牙髓通道，將牙髓從根管中取出。將牙髓組織切成小塊，使用Ⅰ型膠原酶溶液(4 mg/ml)和分散酶溶液(4 mg/ml)分散牙髓組織為單細胞懸液，收集細胞懸液，置于含有10% FBS的α-MEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 流式細胞儀檢測rDPSCs表面標志物 取對數(shù)生長期的第三代rDPSCs，用PBS稀釋細胞濃度為1×106個/ml后，取600 μl等分為6份后分別裝入1.5 ml離心管中，分別加入抗大鼠CD14-PE、CD34-PE、CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD146-PE于室溫下避光孵育20 min，用PBS洗3次后，分別用200 μl PBS重懸細胞，設(shè)置6個重復(fù)，利用流式細胞儀檢測rDPSCs表面標志物的陽性率。

1.5 rDPSCs的成骨成脂能力檢測 第三代rDPSCs培養(yǎng)至90%融合度時，向6孔板中加入成脂肪誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)14 d后，4%多聚甲醛固定，油紅O染色觀察脂肪細胞形成情況并拍照；第三代rDPSCs培養(yǎng)至90%融合度時向6孔板中加入成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)14 d后，4%多聚甲醛固定，茜素紅S染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況并拍照。

1.6 miR-124過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染rDPSCs 取第三代rDPSCs，調(diào)整細胞濃度為4×105個/ml，并分組為空白組、miR-NC組、miR-124組，待細胞融合度達到70%～80%時，將miR-NC組、miR-124組分別加入等量的miR-NC及miR-124 mimics重組慢病毒液，空白組加入等量的培養(yǎng)基。每組設(shè)置6個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.7 rDPSCs外泌體的提取及鑒定 收集空白組、miR-NC組、miR-124組中的rDPSCs上清液各1 ml，分別加入200 μl外泌體提取試劑，4℃孵育過夜，2 000 r/min離心40 min后收集的沉淀即為外泌體，最后用200 μl PBS將沉淀重懸，并分別命名為Exosome組(Exo組)、Exo/miR-NC組、Exo/miR-124組。取部分外泌體，每組設(shè)置6個復(fù)孔，利用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，利用western blot檢測外泌體標志蛋白CD63和CD81的表達，利用qRT-PCR檢測各組外泌體中miR-124的表達。

1.8 大鼠皮膚缺損模型的建立及分組 將25只大鼠隨機分為5組：sham組、model組、rDPSCs Exo組、rDPSCs Exo/miR-NC組和rDPSCs Exo/miR-124組，每組5只。參照文獻[8]，向大鼠腹腔內(nèi)注射30 mg/kg戊巴比妥鈉進行麻醉，將大鼠以俯臥位的狀態(tài)固定于手術(shù)臺上，背部中央常規(guī)備皮消毒后，切取直徑為2.5 cm的全層皮膚，然后在其表面注射30 μl PBS，最后用3M皮膚敷料固定創(chuàng)面，荷包縫合術(shù)將模型區(qū)域固定，以構(gòu)建皮膚缺損模型(model組)。sham組大鼠不做任何處理，僅在背部相應(yīng)區(qū)域注射等量的PBS，model組大鼠在皮膚缺損區(qū)域注射等量PBS，rDPSCs Exo組、rDPSCs Exo/miR-NC組和rDPSCs Exo/miR-124組大鼠于皮膚缺損相應(yīng)區(qū)域分別注射30 μl對應(yīng)的外泌體。15 d后進行皮膚、血清取材檢測。

1.9 qRT-PCR檢測miR-124表達水平 分別收集各組rDPSCs、rDPSCs外泌體、皮膚缺損組織，用Trizol法提取RNA，利用TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)。引物序列為：U6-F：5’-GGCCTCTCGAACTTGCGT GTC-3’，U6-R：5’-CCATCGGAAGCTC GTATA CGA-3’；miR-124-F：TAAGGCACGCGGTGAATGC，miR-124-R：GTCG

TATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT。使用U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT計算miR-124相對表達水平。

1.10 Western Blot檢測蛋白表達水平 收集各組rDPSCs外泌體或皮膚缺損組織，用預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離等量蛋白質(zhì)(50 μg)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h后，將膜與一抗CD63(1∶2 000)、CD81(1∶1 000)、TNF-α(1∶3 000)、TNF-1β(1∶2 500)、IL-6(1∶2 000)、IL-4(1∶1 000)、IL-10(1∶3 000)、IL-13(1∶2 000)、GAPDH(1∶2 000)于4℃條件下孵育過夜。經(jīng)洗滌后，加入HRP標記的羊抗兔二抗(1∶2 000)37℃孵育2 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑可視化蛋白質(zhì)。使用Image J軟件對蛋白條帶進行定量分析。

1.11 ELISA法檢測大鼠血清中iNOS、CD206含量 分別收集1.8中五組大鼠的血清，嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明書進行iNOS、CD206含量的測定。

2 結(jié)果

2.1 rDPSCs的鑒定

2.1.1 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，rDPSCs低表達CD14、CD34、CD45，高表達CD90、CD105、CD146。見圖1，表1。

表1 rDPSCs表面標志物的陽性率比較

2.1.2 rDPSCs在正常條件下形態(tài)均一，呈成纖維樣細胞分布，油紅O染色和茜素紅S染色均為陽性，證明成功分離獲得rDPSCs且細胞具有成骨成脂能力。見圖2。

2.2 rDPSCs外泌體的鑒定 透射電鏡觀察結(jié)果顯示，可觀察到大小均一，直徑為50～100 nm，呈圓形或橢圓形的囊泡結(jié)構(gòu)。CD63和CD81蛋白在rDPSCs外泌體中高表達，而在細胞裂解液中幾乎不表達，證明成功分離獲得rDPSCs外泌體。見圖3、4。

圖3 透射電鏡觀察rDPSCs外泌體的形態(tài)

圖4 western blot檢測CD63和CD81蛋白的表達

2.3 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后rDPSCs及rDPSCs外泌體中miR-124表達 與空白組和miR-NC組比較，miR-124組rDPSCs中miR-124表達水平顯著升高，且Exo/miR-124組rDPSCs外泌體中miR-124表達水平顯著高于Exo組和Exo/miR-NC組(P<0.05)，證明轉(zhuǎn)染成功，獲得高表達miR-124的rDPSCs和rDPSCs外泌體。見表2、3。

表2 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后rDPSCs中miR-124表達

表3 qRT-PCR檢測rDPSCs外泌體中miR-124表達

2.4 miR-124過表達的rDPSCs外泌體對大鼠創(chuàng)傷組織中miR-124表達的影響 與sham組比較，model組大鼠創(chuàng)傷組織中miR-124表達水平顯著降低(P<0.05)；與model組比較，rDPSCs Exo組、rDPSCs Exo/miR-NC組、rDPSCs Exo/miR-124組中miR-124表達水平顯著升高(P<0.05)，且rDPSCs Exo/miR-124組中miR-124表達水平顯著高于rDPSCs Exo組和rDPSCs Exo/miR-NC組(P<0.05)。見表4。

表4 qRT-PCR檢測各組大鼠創(chuàng)傷組織中miR-124表達

2.5 miR-124過表達的rDPSCs外泌體對各組大鼠血清中iNOS、CD206含量的影響 與sham組比較，model組大鼠血清中iNOS含量顯著升高，CD206含量顯著降低(P<0.05)；與model組比較，rDPSCs Exo組、rDPSCs Exo/miR-NC組、rDPSCs Exo/miR-124組中iNOS含量顯著降低，CD206含量顯著升高(P<0.05)，且rDPSCs Exo/miR-124組中iNOS含量顯著降低于rDPSCs Exo組和rDPSCs Exo/miR-NC組、CD206含量顯著高于rDPSCs Exo組和rDPSCs Exo/miR-NC組(P<0.05)。見表5。

表5 ELISA法檢測5組大鼠血清中iNOS、CD206含量

2.6 miR-124過表達的rDPSCs外泌體對皮膚缺損愈合過程中巨噬細胞極化相關(guān)因子的影響 與sham組比較，model組中與M1型極化的相關(guān)炎性因子TNF-α、TNF-1β、IL-6蛋白表達上調(diào)，與M2型極化的相關(guān)炎性因子IL-4、IL-10、IL-13蛋白表達下調(diào)(P<0.05)；與model組比較，rDPSCs Exo組、rDPSCs Exo/miR-NC組、rDPSCs Exo/miR-124組中TNF-α、TNF-1β、IL-6蛋白表達下調(diào)，IL-4、IL-10、IL-13蛋白表達上調(diào)(P<0.05)，且rDPSCs Exo/miR-124組中TNF-α、TNF-1β、IL-6蛋白表達顯著低于rDPSCs Exo組和rDPSCs Exo/miR-NC組，IL-4、IL-10、IL-13蛋白顯著高于rDPSCs Exo組和rDPSCs Exo/miR-NC組(P<0.05)。見圖5，表6。

圖5 western blot檢測5組大鼠創(chuàng)傷組織中TNF-α、TNF-1β、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13蛋白表達；A sham組；B model組；C rDPSCs Exo組；D rDPSCs Exo/miR-NC組；E rDPSCs Exo/miR-124組

表6 5組大鼠創(chuàng)傷組織中TNF-α、TNF-1β、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13蛋白表達

3 討論

組織修復(fù)與再生一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱門話題，如何通過適當?shù)恼{(diào)控來促進組織再生是科學(xué)研究者們探索的終極目標。干細胞由于具有高增殖率、容易獲得、保持持久效力、高分化潛能等良好的特性，其已應(yīng)用于多種疾病和組織再生的治療，并產(chǎn)生了積極的治療效果[9]，而干細胞分泌的外泌體卻比干細胞本身具有更大的治療價值[10]。外泌體是富含核酸、蛋白質(zhì)、脂類、氨基酸和代謝物，大小約為30～200 nm的細胞外囊泡，也是細胞間通信網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分[11,12]。DPSCs是從牙髓組織中分離出來的，來源較為充足，在組織的再生與修復(fù)中的應(yīng)用具有廣闊前景的干細胞[13]。本研究通過鑒定rDPSCs及rDPSCs外泌體，發(fā)現(xiàn)rDPSCs低表達CD14、CD34、CD45，高表達CD90、CD105、CD146，且rDPSCs在正常條件下形態(tài)均一，呈成纖維樣細胞分布，油紅O染色和茜素紅S染色均為陽性，證明成功分離獲得rDPSCs；透射電鏡觀察顯示，可見大小均一，直徑為50～100 nm，呈圓形或橢圓形的囊泡結(jié)構(gòu)，且CD63和CD81蛋白在rDPSCs外泌體中高表達，而在細胞裂解液中不表達，證明成功分離獲得rDPSCs外泌體。

已有研究報道，外泌體通過攜帶miRNA發(fā)揮促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、促進血管生成、促進組織損傷修復(fù)等生物學(xué)作用[14]；外泌體源性miR-124可以促進創(chuàng)傷性腦損傷急性期損傷腦組織中小膠質(zhì)細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，從而減輕創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)炎癥[15]；外泌體可遞送miR-124至機械性損傷后的小鼠皮層神經(jīng)元并提高神經(jīng)元中軸突再生相關(guān)因子NRP-1、GAP-43的表達，促進軸突再生[16]；M2小膠質(zhì)細胞來源的外泌體通過外泌體miR-124及其下游靶標泛素特異性蛋白酶14(USP14)減輕缺血性腦損傷并促進神經(jīng)元存活[17]。本研究成功構(gòu)建大鼠皮膚缺損模型，經(jīng)rDPSCs外泌體干預(yù)后，大鼠血清中iNOS含量顯著降低，CD206含量顯著升高，TNF-α、TNF-1β、IL-6蛋白表達下調(diào)，IL-4、IL-10、IL-13蛋白表達上調(diào)，而miR-124過表達外泌體組干預(yù)后的改善效果更顯著。據(jù)報道，巨噬細胞分為M1型和M2型兩種類型，iNOS、CD206分別為M1型、M2型巨噬細胞極化標志物[18,19]，M1型巨噬細胞分泌TNF-α、TNF-1β、IL-6等促炎因子，可導(dǎo)致機體的炎癥損傷，M2型巨噬細胞分泌IL-4、IL-10、IL-13等炎癥抑制因子，抑制促炎因子效應(yīng)，發(fā)揮抗炎癥損傷的作用[20,21]。提示miR-124過表達修飾的外泌體可能通過抑制M1型巨噬細胞極化來下調(diào)促炎因子TNF-α、TNF-1β、IL-6蛋白的表達，并通過促進M2型巨噬細胞極化來上調(diào)抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13蛋白的表達，進而調(diào)控炎性反應(yīng)來發(fā)揮促進組織修復(fù)與新生的作用。

綜上所述，miR-124過表達修飾的rDPSCs外泌體可通過抑制M1型巨噬細胞極化、促進M2型巨噬細胞極化來調(diào)控炎性反應(yīng)，進而在組織修復(fù)與再生中發(fā)揮促進作用。