龐海燕，陸兵兒，石剛剛

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041）

隨著人口老齡化的不斷加劇，心血管疾病的發(fā)病率和病死率呈現(xiàn)出逐年增高的趨勢(shì)，成為威脅人類健康的一大類公共衛(wèi)生疾病。而在心血管疾病的治療過程中，心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷已經(jīng)成為不可忽略的問題。心肌I/R損傷是心肌組織在缺血一段時(shí)間后恢復(fù)血供，非但沒有使結(jié)構(gòu)和功能得到完全恢復(fù)或明顯改善，反而出現(xiàn)比再灌注前更明顯、更嚴(yán)重的損傷和功能障礙的現(xiàn)象。臨床上表現(xiàn)為嚴(yán)重的和持續(xù)性的胸骨后疼痛，伴有血清心肌酶活性升高和進(jìn)行性心電圖改變，可能伴有心律失常、心臟破裂、休克或心力衰竭[1]。許多觀點(diǎn)認(rèn)為I/R損傷與氧自由基爆發(fā)、線粒體功能障礙、Ca2+超載、炎癥反應(yīng)以及能量代謝障礙等機(jī)制相互關(guān)聯(lián)、協(xié)同作用[2]，這些病理生理變化的分子機(jī)制成為了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究的熱點(diǎn)。

碘化N-正丁基氟哌啶醇（F2）是由我們實(shí)驗(yàn)室在氟哌啶醇的基礎(chǔ)上進(jìn)行哌啶基團(tuán)的修飾，篩選出的一種新型化合物。F2避免了氟哌啶醇的錐體外系不良反應(yīng)，保留了擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈的作用，具有很好的應(yīng)用前景[3]。以往的研究顯示，F(xiàn)2對(duì)心肌細(xì)胞和心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷具有良好的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與拮抗鈣超載[4]和減輕氧化應(yīng)激[5]有關(guān)。相關(guān)研究表明，F(xiàn)2可增加超氧化物歧化酶活力，降低丙二醛濃度[6]。然而，F(xiàn)2通過何種機(jī)制減輕I/R過程中的氧化應(yīng)激仍不清楚。叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1）可通過上調(diào)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等抗氧化基因的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激[7]。基于F2對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用以及FoxO1的抗氧化應(yīng)激作用，本研究在整體I/R模型上探討F2是否通過調(diào)控FoxO1來減輕I/R損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6J小鼠，8～12周齡，雄性，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和儀器戊巴比妥鈉購自德國Merck公司；FoxO1兔多克隆抗體購自美國CST公司；GAPDH鼠多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、二氫乙錠熒光探針購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；Vevo LAZR小動(dòng)物多模成像系統(tǒng)（加拿大Fujifilm Visual Sonics公司）；TBA-40FR全自動(dòng)生化分析儀（日本Toshiba公司）；CM1850冰凍切片機(jī)（德國Leica公司）；Olympus BX53正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌I/R模型的建立及給藥8～12周齡的小鼠通過腹腔注射1%的戊巴比妥鈉（75 mg/kg）進(jìn)行麻醉，經(jīng)氣管插管連接呼吸機(jī)（呼吸頻率115，呼吸比1.3∶1，潮氣量2.0）。于小鼠第3和第4肋骨間開胸暴露心臟，撕開心包膜，用8-0的帶針縫線結(jié)扎左前降支，通過心電圖出現(xiàn)ST段抬高證實(shí)為缺血。小鼠缺血45 min后去除結(jié)扎，關(guān)閉肋骨間隙并縫合肌肉和皮膚，進(jìn)行24 h再灌注。給藥：F2于I/R手術(shù)前24 h以10 mg/kg的劑量腹腔注射給藥；FoxO1的抑制劑AS1842586（AS）于I/R手術(shù)前48 h、24 h、30 min分3次以10 mg/kg的劑量腹腔注射給藥。

1.2.2 小動(dòng)物多模成像系統(tǒng)檢測(cè)心功能小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（sham組）、模型組（I/R組）、I/R+F2組，每組6只。采用3.0%（體積分?jǐn)?shù)）異氟烷氣體誘導(dǎo)麻醉小鼠，1.0%（體積分?jǐn)?shù)）異氟烷氣體維持麻醉。將小鼠固定在小動(dòng)物多模成像恒溫操作臺(tái)上，使用脫毛膏將小鼠胸部毛發(fā)脫除干凈，用MS-400超聲探頭在胸骨旁短軸切面分別采集M-Mode和B-Mode圖像。由圖像數(shù)據(jù)分析可得左心室射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率。

1.2.3 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶的活性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（sham組）、模型組（I/R組）、I/R+F2組，每組6只。將小鼠血清用生理鹽水分別稀釋64倍和16倍，吸取稀釋后的樣本100 μL于檢測(cè)管，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定乳酸脫氫酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶活性。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)心肌組織中FoxO1蛋白的表達(dá)水平小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（sham組）、模型組（I/R組）、I/R+F2組，每組6只。提取小鼠心肌組織蛋白：按100 mg心肌組織加1 mL蛋白裂解液的比例加入預(yù)冷的蛋白裂解液，用乳化分散儀進(jìn)行組織勻漿，冰上靜置30 min，4℃13 000 r/min離心15 min，收集上清液以相同條件再次離心后收集上清液。BCA法進(jìn)行蛋白定量后按4∶1的比例加入5倍上樣緩沖液，煮沸5 min變性，冷卻后使用細(xì)胞超聲破碎儀在冰上超聲（工作時(shí)間3 s，間隔時(shí)間5 s，工作次數(shù)3次）；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓50 V）至分離膠后，更換100 V電壓繼續(xù)電泳1 h；電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h；使用Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀曝光；使用Image Lab分析軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.2.5 二氫乙錠熒光探針法檢測(cè)心肌組織中活性氧的表達(dá)小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為I/R組、I/R+F2組、I/R+AS組、I/R+AS+F2組，每組6只。取下小鼠心臟制備厚度為8 μm的冰凍切片，將二氫乙錠原液用磷酸鹽緩沖液稀釋3 000倍，每個(gè)切片滴加50 μL稀釋后的二氫乙錠，37℃避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色5 min，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min，滴加抗熒光淬滅封片液，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。通過分析熒光強(qiáng)度反映活性氧的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料經(jīng)K-S正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 F2可改善小鼠心肌I/R后的心功能障礙

與sham組相比，小鼠心肌缺血45 min再灌注24 h后，射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）；小鼠I/R手術(shù)前給予F2預(yù)適應(yīng)后，射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率均升高（P值均＜0.01），表明I/R導(dǎo)致的心功能障礙得到明顯改善，如圖1所示。

圖1 F2對(duì)I/R小鼠心功能障礙的保護(hù)作用

2.2 F2可減少小鼠心肌I/R后血清酶的漏出

與sham組相比，小鼠心肌缺血45 min再灌注24 h后，肌酸激酶、肌酸激酶同工酶和乳酸脫氫酶的漏出增多（P值均＜0.01）；I/R手術(shù)前給予F2預(yù)適應(yīng)的小鼠肌酸激酶、肌酸激酶同工酶和乳酸脫氫酶的漏出減少（P值均＜0.01），如圖2所示。

圖2 F2對(duì)I/R小鼠血清酶漏出的影響

2.3 F2可提高小鼠心肌組織中FoxO1蛋白的表達(dá)

與sham組相比，小鼠心肌缺血45 min再灌注24 h后，心肌組織中FoxO1蛋白水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；給予F2預(yù)適應(yīng)的小鼠心肌組織中FoxO1的表達(dá)明顯提高（P＜0.01），如圖3所示。

圖3 F2對(duì)小鼠I/R心肌組織中FoxO1蛋白表達(dá)的影響

2.4 FoxO1抑制劑拮抗F2對(duì)I/R小鼠心肌組織中活性氧的抑制作用

如圖4所示，紅色熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，說明組織中活性氧的含量越高。與模型組（I/R組）相比，F(xiàn)2預(yù)處理的I/R小鼠心肌組織中的活性氧含量降低（P＜0.01）；而給予FoxO1的抑制劑AS后，F(xiàn)2對(duì)活性氧的抑制作用被拮抗（P＜0.01）。

圖4 F2及FoxO1抑制劑對(duì)小鼠心肌組織中的活性氧含量的影響

3 討論

本研究利用整體I/R模型，采用小動(dòng)物活體多模成像系統(tǒng)檢測(cè)小鼠心功能，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶的活性，通過射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率以及血清酶漏出評(píng)價(jià)I/R損傷程度。研究結(jié)果表明，小鼠I/R手術(shù)前給予F2預(yù)適應(yīng)可以減輕I/R損傷。這與Lu等[8]的研究中，F(xiàn)2對(duì)心肌細(xì)胞和心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷發(fā)揮保護(hù)作用是一致的。

心肌I/R損傷的發(fā)生機(jī)制很復(fù)雜，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌I/R損傷的主要因素之一。氧化應(yīng)激是活性氧的產(chǎn)生和抗氧化防御系統(tǒng)之間失衡的結(jié)果。研究表明，氧化應(yīng)激的進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致心肌重構(gòu)[9]。減少氧化應(yīng)激的發(fā)生可以減輕I/R誘導(dǎo)的心肌損傷。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)F2可以減輕缺氧復(fù)氧引起的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激[5]，但F2減輕氧化應(yīng)激的保護(hù)機(jī)制尚不清楚。本研究蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，F(xiàn)2可以有效提高心肌I/R過程中FoxO1的表達(dá)。Mohseni等[7]研究表明，F(xiàn)oxO1可通過轉(zhuǎn)錄激活超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等抗氧化基因的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激。接著對(duì)機(jī)制的進(jìn)一步探索，根據(jù)不同處理組中的活性氧含量結(jié)果分析，我們發(fā)現(xiàn)使用FoxO1的抑制劑AS1842586后，F(xiàn)2減輕氧化應(yīng)激的保護(hù)作用被抑制。這表明F2可以通過對(duì)FoxO1的調(diào)控減輕氧化應(yīng)激，從而保護(hù)心肌I/R損傷。

綜上所述，本研究在整體水平上證實(shí)了F2對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)作用，并初步證實(shí)F2可以通過調(diào)控FoxO1的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激，進(jìn)而減輕心肌I/R損傷。但關(guān)于F2具體通過何種途徑調(diào)控FoxO1，仍有待研究。在心肌I/R損傷的發(fā)病機(jī)制和治療的研究進(jìn)程中，雖然各種抗氧化治療已成功應(yīng)用于臨床前研究，但事實(shí)上將這種抗氧化治療融入臨床實(shí)踐還是十分具有挑戰(zhàn)性的，其中一個(gè)挑戰(zhàn)就是動(dòng)物模型與人類狀況的可比性。而面對(duì)種種挑戰(zhàn)與困難，仍需要學(xué)者們付出大量的時(shí)間與努力進(jìn)行研究克服，盡早攻克這威脅人類健康的一大類疾病。