王艷華，袁淑靜，潘裕興，華燁，李世英，王天

天津市人民醫(yī)院口腔科，天津 300121

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有組織再生潛能，可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞［1］。人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）是從牙齒周圍組織中分離出來的一種MSCs，具有一定的組織修復(fù)潛能，可誘導(dǎo)動物模型中新骨、新牙骨質(zhì)和功能性牙周韌帶的形成［2-4］。近年來，誘導(dǎo)hPDLSCs 成軟骨分化已成為軟骨損傷相關(guān)疾病的一種有前景的治療策略。然而，精確調(diào)節(jié)hPDLSCs 成軟骨分化的分子機(jī)制尚不十分清楚。既往研究報道，微小RNA（miRNA）可在MSCs 成軟骨分化中發(fā)揮不同的作用。我們通過前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-375 具有促進(jìn)hPDLSCs成骨分化的作用［5］，而其在成軟骨分化中是否發(fā)揮作用尚不清楚?；谝寻l(fā)表文獻(xiàn)和miRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白470（ZNF470）可能是miR-375 的候選靶基因。2019年9月—2021年8月，本研究初步探討了miR-375 靶向ZNF470 對hPDLSCs 成軟骨分化影響并分析其調(diào)控機(jī)制，現(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 hPDLSCs 為天津市人民醫(yī)院口腔科制備。miR-375激動劑（miR-375-ago）、miR-375突變激動劑（miR-375-mut-ago）及對照激動劑（NC-ago）購自廣州銳博生物公司，ZNF470載體與空載購自蘇州吉瑪基因公司，誘導(dǎo)成軟骨分化試劑購自上海埃澤思生物公司，阿爾新藍(lán)染色試劑購自廣州捷倍斯生物公司，lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國賽默飛世爾科技公司，α-MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技公司，實(shí)時熒光定量PCR 試劑購自日本寶日醫(yī)生物技術(shù)公司，ZNF470 一抗購自美國Novus 生物公司，軟骨標(biāo)志性基因［Ⅱ型膠原α1（COL2A1）、性別決定基因9（SOX9）、軟骨可聚蛋白多糖（ACAN）、透明質(zhì)酸合酶2（HAS2）］、β-Actin 一抗以及相應(yīng)二抗均購自武漢愛博泰克生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及成軟骨分化誘導(dǎo) 采用α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基與10%胎牛血清培養(yǎng)hPDLSCs，添加2 mmol/L 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL鏈霉素。取生長狀態(tài)良好的hPDLSCs，采用2 mL誘導(dǎo)成軟骨分化培養(yǎng)基重懸并以3×105/孔接種于6 孔板。自接種時開始計算，每2 d 更換新鮮的誘導(dǎo)成軟骨分化培養(yǎng)基，共培養(yǎng)21 d。

1.3 細(xì)胞miR-375、ZNF470 mRNA表達(dá)檢測 采用實(shí)時熒光定量PCR法。取誘導(dǎo)分化1、3、7、14、21 d時的hPDLSCs，常規(guī)提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。miR-375 反轉(zhuǎn)錄引物為5'-CTCAACTGGTGTCGTG G A G T C G G C A A T T C A G T T G A G C T C A C G C-3'。隨后以cDNA 作為模板，分別采用Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green?試劑與 TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ試劑進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 檢測miR-375 與 ZNF470 mRNA 表達(dá)。反應(yīng)體系共 20 μL，其中包括1 μL cDNA、1 μL 引物（正向+反向）、10 μL TB Green?及8 μL 去離子水。反應(yīng)溫度與循環(huán)條件：95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，4 ℃ 60 min，共 36 個循環(huán)。引物序列：miR-375 上游引物 5′-AGTTTGTTCGTTCGGCTC-3′、下游引物 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′，內(nèi) 參 U6 上 游 引 物 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下 游 引 物 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；ZNF470 上游引物 5′-AGCCATCGTAAATCCCTTACT-3′、下 游 引 物 5′-ACTGATGACTCTCCGGTATGA-3′，內(nèi)參β-actin 上游引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′、下 游 引 物 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。以 U6、β-actin為內(nèi)參，按照 2－ΔΔCt計算 miR-375、ZNF470 mRNA 的相對表達(dá)量。

1.4 miR-375 與ZNF470 的靶向調(diào)控關(guān)系分析 采用雙熒光素酶報告基因檢測法。通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-375 的潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)ZNF470 的3′-UTR 中“GAACAA”序 列 可 與 miR-375 中“CUUGUU”序列互補(bǔ)配對，ZNF470 為miR-375 的潛在靶基因。采用PrimeSTAR?Max DNA Polymerase試劑進(jìn)行高保真PCR 擴(kuò)增含有miR-375結(jié)合位點(diǎn)的ZNF470 3′-UTR 序列，命名為野生型（WT）序列。引物 序 列 ：上 游 引 物 5′-AGCTTTGTTTAAACATTCAATCTCGTAAATGCTTCTAGC-3′、下游引物5′-CTAGACTAGTACTACTACCTACCCTGGT -TAGTCCT-3′。突變型（MUT）序列由上海生工生物公司以WT 序列為模版，采用基因定點(diǎn)誘變技術(shù)合成。WT 與MUT 序列經(jīng)測序驗(yàn)證后，克隆到miRNA載體中，構(gòu)建ZNF470-WT 與ZNF470-MUT 報告載體。將hPDLSCs 接種到12 孔板，接種24 h 后分為四部分，分別轉(zhuǎn)染ZNF470-WT+miR-375-ago、ZNF470-WT+NC-ago、ZNF470-MUT+miR-375-ago、ZNF470-MUT+NC-ago，并同時轉(zhuǎn)染0. 5 μg 表達(dá)海腎熒光素酶的pRL-CMV 載體。轉(zhuǎn)染48 h后，檢測各組螢火蟲和海腎熒光素酶值。

1.5 細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染及成軟骨分化誘導(dǎo) 取生長狀態(tài)良好的的hPDLSCs 接種至6 孔板中，當(dāng)融合度達(dá)到90%以上時，分為空白對照組、陰性對照組、miR-375 過表達(dá)組、對照+空載組、miR-375 過表達(dá)+空載組及miR-375 過表達(dá)+ZNF470 組，分別轉(zhuǎn)染75 nmol NC-ago、75 nmol miR-375-mut-ago、75 nmol miR-375-ago、50 nmol NC-ago+0.5 μg 空載、50 nmol miR-375-ago+0.5 μg 空載以及 50 nmol miR-375-ago+0.5 μg ZNF470 載體。轉(zhuǎn)染24 h 后收集各組細(xì)胞進(jìn)行成軟骨分化誘導(dǎo)，方法同“1.2”。

1.6 成軟骨分化情況觀察

1.6.1 軟骨細(xì)胞活性 采用阿爾新藍(lán)染色。收集“1.5”中成軟骨分化誘導(dǎo)21 d 后的各組細(xì)胞，采用10%甲醛 4 ℃固定30 min。用PBS 洗滌3 次，利用1%阿爾新藍(lán)溶液37 ℃染色60 min，用去離子水洗滌3 次。經(jīng)不同濃度乙醇脫水處理后，二甲苯清洗3 次。中性樹膠封片，顯微鏡觀察、拍照阿爾新藍(lán)染色結(jié)果，測定每組在600 nm波長時的吸光度（A）值，以A值表示軟骨細(xì)胞活性。

1.6.2 軟骨標(biāo)志基因表達(dá) 采用實(shí)時熒光定量PCR 法。收集“1.5”中成軟骨分化誘導(dǎo)21 d 后的各組細(xì)胞，實(shí)時熒光定量PCR 檢測軟骨標(biāo)志性基因COL2A1、SOX9、ACAN、HAS2 mRNA 表達(dá)，方法同“1.3”。引物序列：COL2A1 上游引物 5′-TGGACGATCAGGCGAAACC-3′、下 游 引 物 5′-GCTGCGGATGCTCTCAATCT-3′，SOX9 上游引物 5′-CTCTGGAGACTTCTGAACGAG-3′、下游引物5′-CCTTGAAGATGGCGTTGGGG-3′；ACAN 上游引物 5′-CCACTGTTACCGCCACTT-3′、下 游 引 物 5′-GTAGTCTTGGGCATTGTTGT-3′，HAS2 上游引物 5′-CTCTTTTGGACTGTATGGTGCC-3′、下游引物 5′-AGGGTAGGTTAGCCTTTTCAC-3′。以 β-actin 為內(nèi)參，按照2－ΔΔCt計算COL2A1、SOX9、ACAN、HAS2 mRNA 的相對表達(dá)量。

1.6.3 軟骨標(biāo)志蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。收集“1.5”中成軟骨分化誘導(dǎo)21 d 后的各組細(xì)胞，Western blotting 法檢測軟骨標(biāo)志性基因COL2A1、SOX9、ACAN、HAS2蛋白表達(dá)，常規(guī)提取細(xì)胞中總蛋白并定量各組蛋白濃度。配制8%與12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，每孔加入30 μg總蛋白。電泳結(jié)束后通過濕轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜膜，采用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，TBS-T 緩沖液洗滌 3 次。加入 COL2A1（1∶500）、SOX9（1∶1 000）、ACAN（1∶250）、HAS2（1∶250）以及β-Actin（1∶2 000）一抗4 ℃孵育過夜。將膜與相應(yīng)二抗（1∶1 000）37 ℃孵育60 min，利用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。以β-actin 作為內(nèi)參，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值計算COL2A1、SOX9、ACAN、HAS2蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS27.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以-x±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較行t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較行單因素方差分析，重復(fù)測量數(shù)據(jù)行重復(fù)測量方差分析。采用Spearman 相關(guān)性分析誘導(dǎo)hPDLSCs 成軟骨分化中 miR-375 與 ZNF470 表達(dá)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)hPDLSCs 成軟骨分化各時點(diǎn)miR-375、ZNF470 mRNA 表達(dá)比較 誘導(dǎo)hPDLSCs 成軟骨分化 1、3、7、14、21 d 時 miR-375 mRNA 表達(dá)分別為1.00± 0.16、0.90 ± 0.11、0.75± 0.09、0.69 ± 0.07、0.44 ± 0.09，ZNF470 mRNA 表 達(dá) 分 別 為 1.00 ±0.13、1.52 ± 0.10、2.32 ± 0.28、3.05 ± 0.24、5.16 ±0.40，miR-375 mRNA 表達(dá)呈時間依賴性下調(diào)，ZNF470 mRNA表達(dá)呈時間依賴性上調(diào)（P均＜0.05）。Spearman 相關(guān)性分析顯示，誘導(dǎo)hPDLSCs 成軟骨分化中miR-375 與ZNF470 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.47，P＜0.05）。

2.2 miR-375 與ZNF470 靶向調(diào)控關(guān)系 雙熒光素酶報告基因顯示，共轉(zhuǎn)染ZNF470-WT+NC-ago、ZNF470-WT+miR-375-ago的hPDLSCs細(xì)胞熒光素酶活性分別為 1.00 ± 0.20、0.39 ± 0.04（P＜0.05），共轉(zhuǎn)染 ZNF470-MUT+NC-ago、ZNF470-MUT+miR-375-ago 的hPDLSCs 細(xì)胞熒光素酶活性分別為1.00 ±0.18、1.06 ± 0.22（P＞0.05），提示miR-375可靶向負(fù)調(diào)控ZNF470。

2.3 miR-375 過表達(dá)對hPDLSCs 成軟骨分化的影響 阿爾新藍(lán)染色顯示，與空白對照組及陰性對照組比較，miR-375 過表達(dá)組鏡下藍(lán)色視野較淺，成軟骨分化程度減少（OSID碼圖1）；空白對照組、陰性對照組、miR-375 過表達(dá)組A 值分別為（1.86 ± 0.23）、（1.92 ± 0.25）、（0.40 ± 0.07），miR-375 過表達(dá)組軟骨細(xì)胞活性低于空白對照組及陰性對照組（P＜0.05）。實(shí)時熒光定量 PCR 與 Western blotting 顯示，與空白對照組及陰性對照組比較，miR-375 過表達(dá)組COL2A1、SOX9、ACAN、HAS2 mRNA 與蛋白表達(dá)均降低（P均＜0.05），空白對照組與陰性對照組各軟骨標(biāo)志性基因表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 miR-375過表達(dá)對hPDLSCs COL2A1、SOX9、ACAN、HAS2表達(dá)的影響（-x± s）

2.4 ZNF470 與 miR-375 共同過表達(dá)對 hPDLSCs 成軟骨分化的影響 阿爾新藍(lán)染色顯示，與對照+空載組及miR-375過表達(dá)+ZNF470組比較，miR-375過表達(dá)+空載組鏡下藍(lán)色視野較淺，成軟骨分化程度減少（OSID碼圖2），對照+空載組、miR-375過表達(dá)+空載組、miR-375 過表達(dá)+ZNF470 組 A 值分別為（2.01 ± 0.29）、（0.54±0.12）、（1.34±0.18），軟骨細(xì)胞活性miR-375過表達(dá)+空載組＜miR-375過表達(dá)+ZNF470組＜對照+空載組（P均＜0.05）。實(shí)時熒光定量PCR與Western blotting顯示，COL2A1、SOX9、ACAN、HAS2 mRNA與蛋白表達(dá)miR-375 過表達(dá)+空載組＜miR-375 過表達(dá)+ZNF470組＜對照+空載組（P均＜0.05）。見表2。

表2 ZNF470與miR-375共同過表達(dá)對hPDLSCs COL2A1、SOX9、ACAN、HAS2表達(dá)的影響（-x± s）

3 討論

由于細(xì)胞密度低且增殖能力差，軟骨細(xì)胞在受到損傷或退化時通常不能再生或自愈，容易造成軟骨永久性損壞。目前，軟骨組織再生和工程化是兩種治療軟骨損傷的主要方法。近年來隨著組織工程學(xué)的快速發(fā)展，誘導(dǎo)MSCs 成軟骨分化顯示出極大的臨床應(yīng)用前景。因此，如何精確調(diào)控成軟骨分化過程成為了研究熱點(diǎn)。PDLSCs 是一種牙齒周圍組織來源的MSCs，可以較容易地從正畸過程中獲得。LEE 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，PDLSCs 成軟骨分化潛能優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），表明PDLSCs是軟骨再生有前景的候選干細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-375 具有抑制hPDLSC 成軟骨分化的作用，其機(jī)制與負(fù)性調(diào)控ZNF470表達(dá)有關(guān)。

作為表觀遺傳調(diào)控的一類關(guān)鍵分子，miRNA 參與誘導(dǎo)MSCs 成軟骨分化的研究屢見不鮮，如miR-27b、miR-30a 以及 miR-134 可抑制成軟骨分化，而miR-92a-3p、miR-199b-5p 以及 miR-218 可促進(jìn)成軟骨分化等［7-10］。SUN 等［11］分析了誘導(dǎo)人 BMSCs 成軟骨分化過程中miRNA 表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)有35 個miRNA 表達(dá)上調(diào)，106 個 miRNA 表達(dá)下調(diào)，其中miR-320c過表達(dá)可促進(jìn)BMSCs成軟骨分化。YANG等［12］研究顯示，miR-210-3p 在大鼠 BMSCs 中可促進(jìn)成軟骨分化并抑制與低氧誘導(dǎo)因子3α 信號相關(guān)的成脂肪分化。此外，miR-101 被報道在大鼠BMSCs成軟骨分化過程中表達(dá)上調(diào)，miR-101 過表達(dá)能夠促進(jìn)成軟骨分化［13］。miR-375位于人基因組2q35區(qū)域，最早被發(fā)現(xiàn)在胰島組織高表達(dá)并可調(diào)節(jié)胰島素分泌［14］。隨后研究發(fā)現(xiàn)，miR-375 亦可參與其他病理生理過程，如葡萄糖穩(wěn)態(tài)、黏膜免疫和腫瘤進(jìn)展等［15］。ZHAO等［16］研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-375可改善氯胺酮誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞衍生神經(jīng)元的神經(jīng)毒性。我們的研究在誘導(dǎo)hPDLSCs 成軟骨分化過程中發(fā)現(xiàn)，miR-375 表達(dá)呈時間依賴性下調(diào)。進(jìn)一步研究miR-375在成軟骨分化中的作用，發(fā)現(xiàn)miR-375過表達(dá)能夠抑制hPDLSCs成軟骨分化。

為了探索miR-375 調(diào)節(jié)hPDLSCs 成軟骨分化的分子機(jī)制，我們基于已發(fā)表的文獻(xiàn)和miRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果，將ZNF470 選為miR-375 的候選靶基因。ZNF470 定位于人基因組19q13.43 區(qū)域，是一種由17個鋅指以及KRAB-A和KRAB-B基序的組成的分子量為64 kDa 的蛋白質(zhì)。ZNF470 最初是從體外誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的間充質(zhì)祖細(xì)胞中分離出來，在軟骨形成過程中高表達(dá)，最大豐度峰值與COL2A1 表達(dá)上調(diào)一致［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，ZNF470 在誘導(dǎo)hPDLSCs 成軟骨分化過程中呈時間依賴性上調(diào)，與之前發(fā)表的報道一致，表明該結(jié)果可信。隨后通過熒光素酶報告基因證實(shí)ZNF470 是miR-375 的靶基因，并且miR-375 負(fù)性調(diào)控ZNF47 的表達(dá)。此外，通過在miR-375 過表達(dá)的hPDLSCs 中給予ZNF470 過表達(dá)處理，發(fā)現(xiàn)ZNF470 過表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)miR-375對hPDLSCs成軟骨分化的抑制作用。

綜上所述，miR-375 能夠通過靶向負(fù)調(diào)控ZNF470 從而抑制hPDLSCs 成軟骨分化，這提示miR-375 可能是調(diào)控hPDLSCs 成軟骨分化的一個重要的分子靶點(diǎn)。由于本研究屬于體外實(shí)驗(yàn)，存在一定的局限性，下一步將在動物模型中予以驗(yàn)證。