楊雨陽，蒙克嘎勒，阿不來提·阿合買提，屈晴 ，齊新偉，單驕宇

1 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室，烏魯木齊 830000；2 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中亞高發(fā)疾病發(fā)病機制與防治國家重點實驗室；3 新疆地方病分子生物學(xué)重點實驗室；4 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室；5 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機能中心實驗室

包蟲病又稱棘球蚴病，是由棘球絳蟲幼蟲寄生于人體及某些哺乳類動物體內(nèi)所致的一種嚴重的人畜共患寄生蟲病，可分為囊型棘球蚴病和泡型棘球蚴?。?］。多項研究表明，寄生蟲蟲源囊泡在宿主—寄生蟲相互作用中具有復(fù)雜多樣的免疫調(diào)節(jié)特性，包括免疫刺激和免疫抑制［2］。干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白（IFITM）屬于干擾素刺激基因（ISGs），是涉及病毒感染免疫反應(yīng)的一種蛋白，并可以抑制病原體活性［3］。人類的IFITM 家族由5 個成員組成，包括與免疫相關(guān)的IFITM1、IFITM2 和IFITM3 及在免疫中無已知作用的IFITM5 和IFITM10，其中IFITM3 已被多項研究證明在機體抗病毒及抗病原體方面發(fā)揮重要作用［4］。調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T 細胞亞群，Treg 的特征基因表達和抑制功能在很大程度上依賴于Treg 細胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 的穩(wěn)定表達和活性［5］。在蠕蟲感染期間，F(xiàn)oxp3 可以通過調(diào)控宿主體內(nèi)炎癥反應(yīng)來使寄生蟲逃避宿主的免疫攻擊，從而延長寄生蟲在宿主體內(nèi)的生存時間［6］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3在包蟲病患者肝臟組織內(nèi)表達量高于非包蟲病患者。進一步對Foxp3I 與FITM3 進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)IFITM3和Foxp3之間存在相關(guān)性，并且可在干擾素通路以及干擾素刺激基因15（ISG15）蛋白質(zhì)結(jié)合方面發(fā)揮作用。通過使用STRING 數(shù)據(jù)庫生成IFITM3 和FOXP3 及其相關(guān)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖并結(jié)合相關(guān)文獻，我們選取了與寄生蟲及抗病毒、病原體密切相關(guān)的ISGs（IFITM1、IFITM2、IFIT3 和 ISG15）進一步研究 IFITM3 和 Foxp3 之間的關(guān)系。2020年10月—2022年1月，我們通過對肝細胞進行包蟲囊液干預(yù)，觀察了Foxp3、IFITM3 與IFITM1、IFITM2、IFIT3 和 ISG15 的水平變化并分析其相關(guān)性，以期加深對包蟲感染疾病相關(guān)作用機制的理解。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞系HepG2 購自武漢普諾賽生命科技有限公司。TRIzol試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京寶信生物工程有限公司，熒光定量PCR 試劑盒（TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ）購自北京寶信生物工程有限公司，BCA 蛋白定量試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司，F(xiàn)OXP3 抗體購自美國Invitrogen 公司，IFITM3、ISG15、IFITM1、IFITM2、IFIT3 抗體購自美國Proteintech公司，引物由上海生工公司合成。

1.2 包蟲囊液干預(yù)處理及分組 從包蟲病羊的肝臟包囊中用注射器抽取囊液，離心后留上清備用。將 HepG2 細胞接種于培養(yǎng)基，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達80%以上時傳代。將傳代后的細胞以1×106/孔接種于6 孔板，待細胞生長14 h且狀態(tài)良好時，將細胞隨機分為高濃度組、中濃度組、低濃度組、對照組，分別加入 1∶10、1∶100和1∶1 000 濃度比例的囊液及不加囊液，另將低濃度組設(shè)2個復(fù)孔，對細胞干預(yù)72 h。

1.3 細胞 Foxp3、IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。收集干預(yù)后的4 組HepG2 細胞，及低濃度組在干預(yù)后0、12、24、36、48、60、72 h 的細胞，用細胞裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）裂解細胞，用BCA 蛋白濃度定量試劑盒檢測總蛋白的濃度。用12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGD）進行電泳，每個點樣孔加 20 μg 總蛋白。80 V 電泳 30 min 后換為 120 V 電泳 1 h，冰上 120 V 電轉(zhuǎn) 90 min。TBST緩沖液洗膜3 次，用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 緩沖 液 洗 膜 3 次 ，分 別 加 入 IFITM3（1∶1 000）、Foxp3（1∶2 000）、IFITM1（1∶10 000）、IFITM2（1∶1 000）、IFIT3（1∶3 000）、ISG15（1∶1 000）以及β-actin（1∶5 000）一抗，4 ℃搖床孵育過夜。TBST 緩沖液洗膜3 次，用5% 脫脂奶粉稀釋相應(yīng)二抗（1：5 000），室溫搖床避光孵育 1 h 后，用 TBST 緩沖液洗膜3 次。將ECL 化學(xué)發(fā)光溶液A 液和B 液等體積混合，將其覆蓋在膜上，置于顯色儀中顯色，用Image J軟件對條帶進行灰度值掃描及分析。以β-actin 為內(nèi)參，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值計算Foxp3、IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 蛋白相對表達量。

1.4 細胞 IFITM3、Foxp3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。收集干預(yù)后的4 組HepG2 細胞，及低濃度組在干預(yù)后0、12、24、36、48、60、72 h的細胞，用TRIzol法提取細胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，條件為 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，產(chǎn)物-80 ℃保存。冰上操作，將cDNA 稀釋5 倍，再將稀釋好的cDNA 樣品取1 μL 加入熒光定量試劑盒中的qPCR體系，于實時熒光定量PCR 儀上檢測IFITM3、Foxp3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15和GAPDH的相對表達量。循環(huán)條件：95 ℃ 30 s 預(yù)變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共 40 個循環(huán)。按照 GenBank 中檢索到的人IFITM3和Foxp3的基因序列設(shè)計引物，以人GAPDH作為內(nèi)參基因。引物序列：IFITM3 上游引物5′-GCACGCTCATCTCAGATCTCC-3′、下 游 引 物 5′-TTTTGGCTTCTTCAATGTCCAG-3′，F(xiàn)OXP3 上游引物5′-TCCCAGAGTTCCTCCACAAC-3′、下 游 引 物 5′-ATTGACTGTCCGCTGCTTCT-3′，IFITM1 上游引物5′-GTTCAACACCCTCTTCTTGAAC-3′、下游引物 5′-CATCTTCCTGTCCCTAGACTTC-3′，IFITM2 上游引物5′-CATGTGGTCTGGTCCCTGTTCAAC-3′、下游引物5′-CGTCGCCAACCATCTTCCTGTC-3′，ISG15 上游引物5′-TGGACAAATGCGACGAACCTC-3′、下游引物5′-TTTCCCCCAGTGACTAGACTTC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′、下游引 物 5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。 按 照2－ΔΔCt計 算 IFITM3、Foxp3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 mRNA的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0 和GraphPad Prism 8 統(tǒng)計軟件。計量資料的正態(tài)性分析采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗，符合正態(tài)分布以表示，組間比較行獨立樣本t檢驗，組內(nèi)不同時間點比較行重復(fù)測量方差分析，IFITM3、Foxp3 與 IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 的相關(guān)性采用 Spearman 相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同囊液濃度干預(yù)下HepG2 細胞Foxp3、IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15蛋白及mRNA表達比較

2.1.1 HepG2 細 胞 中 Foxp3、IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 蛋白 表 達比 較 IFITM1、IFITM2、IFITM3、Foxp3 及 ISG15 蛋白表達隨著干預(yù)囊液濃度的降低逐漸增高，IFIT3蛋白表達中濃度組＞低濃度組、高濃度組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組Foxp3、IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15蛋白表達比較（）

表1 各組Foxp3、IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15蛋白表達比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與高濃度組比較，#P＜0.05；與中濃度組比較，△P＜0.05。

組別低濃度組中濃度組高濃度組對照組ISG15 0.778±0.376*#△0.663±0.298*0.534±0.171*0.480±0.210 Foxp3 1.044±0.340*#△0.924±0.191*#0.698±0.189*0.536±0.133 IFITM3 0.827±0.154#△0.527±0.196*#0.414±0.202*0.720±0.111 IFITM1 1.115±0.077*△0.811±0.266#0.602±0.195 0.601±0.083 IFITM2 0.352±0.146#0.309±0.020*0.259±0.038*0.553±0.162 IFIT3 0.744±0.306*△0.931±0.117#0.631±0.114*1.112±0.217

2.1.2 HepG2 細 胞 中 Foxp3、IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 mRNA 表達比較 IFITM1、IFITM2、IFITM3、Foxp3 及 ISG15 mRNA 表 達 隨著干預(yù)囊液濃度的降低逐漸增高（P均＜0.05），IFIT3 mRNA 高、中、低濃度組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 各組Foxp3、IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 mRNA表達比較（）

表2 各組Foxp3、IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 mRNA表達比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與高濃度組比較，#P＜0.05；與中濃度組比較，△P＜0.05。

組別低濃度組中濃度組高濃度組對照組Foxp3 mRNA 2.061±0.420*#△1.421±0.416*#1.157±0.666 1.000±0.052 IFITM3 mRNA 2.300±0.198*#1.776±0.237*1.339±0.044 1.000±0.279 IFITM1 mRNA 2.006±0.273*#△1.872±0.241 1.140±0.150 1.000±0.209 IFITM2 mRNA 0.510±0.077*0.435±0.017*0.385±0.035*1.000±0.146 IFIT3 mRNA 0.008±0.013*0.006±0.014*0.009±0.001*1.000±0.215 ISG15 mRNA 1.707±0.148#△1.227±0.114*1.032±0.226*1.000±0.079

2.2 低囊液濃度干預(yù)下各時點HepG2 細胞Foxp3、IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15蛋白及mRNA表達比較

2.2.1 HepG2 細 胞 中 Foxp3、IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 蛋白表達比較 IFITM1、IFITM2及IFIT3蛋白表達隨著囊液干預(yù)時間延長而降低，IFITM3、ISG15 蛋白表達隨著囊液干預(yù)時間延長先升高后降低，F(xiàn)oxp3 蛋白表達隨著囊液干預(yù)時間的延長而升高。見圖1。

圖1 低囊液濃度干預(yù)下各時點IFITM1、IFITM2、IFITM3、Foxp3、IFIT3、ISG15蛋白表達比較

2.2.2 HepG2 細 胞 Foxp3、IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 mRNA 表達比較 IFITM2、IFIT3及ISG15 mRNA 表達隨著囊液干預(yù)時間延長而降低，IFITM3、IFITM1 mRNA 表達隨著囊液干預(yù)時間延長先升高后降低，F(xiàn)oxp3 mRNA 表達隨著囊液干預(yù)時間的延長而升高。見圖2。

圖2 低濃度組各時點IFITM1、IFITM2、IFITM3 Foxp3、IFIT3、ISG15 mRNA表達比較

2.3 Foxp3、IFITM3 與 IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15的相關(guān)性分析

2.3.1 不同囊液濃度干預(yù)下HepG2 細胞Foxp3、IFITM3 mRNA 與 IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 mRNA 的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，不同囊液濃度干預(yù)下Foxp3 mRNA 表達與IFITM3 mRNA 表達呈正相關(guān)（r=0.508，P=0.004）；Foxp3、IFITM3 mRNA 表達與 IFITM1、IFITM2、ISG15 mRNA 表達均呈正相關(guān)（P均＜0.05），與IFIT3 mRNA 表達無相關(guān)性。見表3。

表3 不同囊液濃度干預(yù)下HepG2細胞Foxp3、IFITM3 mRNA與IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 mRNA的相關(guān)性

2.3.2 不同囊液濃度干預(yù)下HepG2 細胞Foxp3、IFITM3 與 IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 蛋白的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，不同囊液濃度干預(yù)下Foxp3 蛋白表達與IFITM3 蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.889，P＜0.001）；Foxp3 蛋白表達與 IFITM1、ISG15 蛋白表達呈正相關(guān)（P均＜0.05），與 IFITM2和IFIT3 蛋白表達無相關(guān)性；IFITM3 蛋白表達與IFITM1、IFITM2、ISG15 蛋白表達呈正相關(guān)（P均＜0.05），與IFIT3 蛋白表達無相關(guān)性。見表4。

表4 不同囊液濃度干預(yù)下HepG2細胞Foxp3、IFITM3與IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15蛋白的相關(guān)性

2.3.3 低囊液濃度干預(yù)下各時點HepG2 細胞Foxp3、IFITM3 與IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，低囊液濃度干預(yù)下各時點Foxp3 mRNA及蛋白表達與IFITM3 mRNA及蛋白表達呈負相關(guān)（r=-0.562，P=0.012；r=-0.473，P=0.030）；Foxp3 表達與 IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15表達呈負相關(guān)；IFITM3 表達與 IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15表達呈正相關(guān)（P均＜0.05）。見表5、6。

表5 低囊液濃度干預(yù)下各時點Foxp3、IFITM3 mRNA與IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 mRNA的相關(guān)性

表6 低囊液濃度干預(yù)下各時點Foxp3、IFITM3與IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15 蛋白的相關(guān)性

3 討論

近年來，包蟲病已成為嚴重危害全世界公共衛(wèi)生健康的問題。包蟲幼蟲生長所需的營養(yǎng)依靠包蟲囊液提供，但包蟲囊液中的物質(zhì)對人類機體來說屬于外源性物質(zhì)，具有免疫原性，可引發(fā)機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。在細粒棘球蚴感染過程中，包蟲囊液所分泌的抗原物質(zhì)會調(diào)節(jié)宿主局部及全身免疫反應(yīng)，使蟲體便于逃避宿主的免疫攻擊，以保護棘球蚴在宿主體內(nèi)的生長［7］。

本研究采用包蟲囊液干預(yù)HepG2 細胞，通過使用Western blotting 和實時熒光定量PCR 檢測相關(guān)因子的蛋白及 mRNA 發(fā)現(xiàn)，IFITM1、IFITM2、IFITM3、Foxp3 和ISG15 的表達量均隨著囊液濃度降低而升高。這提示包蟲囊液在相對較低的濃度下具有促進IFITM3、Foxp3、IFITM1、IFITM2和ISG5表達的作用，而在相對較高的濃度可下調(diào)或抑制IFITM3、Foxp3、IFITM1、IFITM2和ISG5在宿主體內(nèi)的表達。我們研究結(jié)果同樣顯示，IFIT3 的相對表達量中濃度組＞低濃度組、高濃度組，低濃度組雖然與高濃度組在統(tǒng)計學(xué)比較中沒有顯著差異，但在表達量上是高于高濃度組的，這也在一定程度上提示了較低囊液濃度對IFIT3的表達有一定促進作用。

我們在采用低囊液濃度干預(yù)HepG2 細胞時發(fā)現(xiàn)，IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFIT3 及 ISG15 的表達量隨著囊液干預(yù)時間的延長逐漸降低，而Foxp3 表達量隨著囊液干預(yù)時間的延長逐漸增高。宿主對囊型棘球蚴病的免疫系統(tǒng)通常分為先天反應(yīng)和適應(yīng)性反應(yīng)，IFITM 家族在免疫損傷和炎癥感染中發(fā)揮的作用屬于先天免疫，是抵御寄生蟲的第一道防線，IFIT3 和ISG15 也與抗病毒和抗病原體的天然免疫有關(guān)，而Foxp3則與適應(yīng)性免疫反應(yīng)相關(guān)［8］。在感染包蟲初始階段，蟲體所分泌的蛋白及抗原有利于激發(fā)宿主免疫系統(tǒng)對蟲體發(fā)起攻擊，宿主通過干擾素信號通路促進 IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFIT3 和ISG15 表達增加，使其開始發(fā)揮抗病原體的作用，從而抑制蟲體在體內(nèi)的生長繁殖。隨著感染時間推移，宿主的免疫反應(yīng)又可分為Th1 型和Th2 型兩大類［9］。在感染早期，宿主主要產(chǎn)生以Th1 型細胞及其產(chǎn)生的干擾素γ（IFN-γ）、白細胞介素2（IL-2）等有利于清除寄生蟲的細胞因子；而在感染的中后期主要是以 Th2 細胞及其產(chǎn)生的 IL-10、IL-4、IL-5 等細胞因子參與的免疫反應(yīng)為主，在此階段宿主的免疫調(diào)控屬于負免疫調(diào)控，不會有效抑制寄生蟲的生長，反而有利于寄生蟲的生長繁殖。隨著宿主感染時間延長，T 細胞開始接受T 細胞受體（TCR）信號而被激活，分化為效應(yīng)T細胞來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答［10］。因此，在感染前期，F(xiàn)oxp3 表達量較少，提示其沒有開始發(fā)揮作用，但隨著感染時間的延長，免疫類型開始向Th2型偏移，囊液抗原物質(zhì)對細胞的刺激使Foxp3 表達增加，開始產(chǎn)生幫助蟲體免疫逃逸的影響。

IFITM3和Foxp3在不同囊液濃度干預(yù)下呈正相關(guān)，且 IFITM3 與 IFITM1、IFITM2、ISG15 呈正相關(guān)，F(xiàn)oxp3 與 IFITM1、ISG15 也呈正相關(guān)，但 Foxp3 與IFITM2 之間沒有相關(guān)性，因為相對于IFITM3 和IFITM1，在同一條件下IFITM2 的表達量是較低的，并且隨著囊液濃度的變化，IFITM2 表達量的變化也不如 IFITM3 和 IFITM1 的明顯，因此與 Foxp3 的相關(guān)性較低。在相同囊液濃度（低囊液濃度）干預(yù)下各時點 ，IFITM3 和 Foxp3 呈 負 相 關(guān) ，并 且 IFITM3 與IFITM1、IFITM2、IFIT3 及 ISG15 呈正相關(guān)，而 Foxp3與 IFITM1、IFITM2、IFIT3 及 ISG15 呈負相關(guān)。我們據(jù)此推測，動物在感染細粒棘球蚴初期，包蟲產(chǎn)生的囊液少、濃度低，這時與先天免疫有關(guān)的IFITM3、IFITM2、IFITM1、ISG15 和 IFIT3 開始發(fā)揮作用，為了防止寄生蟲對人體的進一步入侵，IFITM3、IFITM2、IFITM1、ISG15 和IFIT3 的表達量增加。而因為包蟲剛?cè)肭炙拗鲿r囊液濃度低，F(xiàn)oxp3 又與IFITM1、IFITM3 及 ISG15 之間呈正相關(guān)，則 Foxp3 的表達會相應(yīng)增高。隨著病程的延長，F(xiàn)oxp3 表達逐漸升高，其開始發(fā)揮免疫耐受作用，再加上隨著病程延長Foxp3 與 IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFIT3 及 ISG15 之間的關(guān)系轉(zhuǎn)為負相關(guān)，使得IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFIT3 和 ISG15 的表達量逐漸降低，從而在細粒棘球蚴感染后期蟲體得以逃避宿主的免疫攻擊。

綜上所述，我們使用不同濃度的包蟲囊液干預(yù)HepG2 細胞，發(fā)現(xiàn)低濃度的囊液會促進IFITM1、IFITM2、IFITM3、Foxp3 和 ISG15 的表達且 IFITM3 與Foxp3 呈正相關(guān)；我們使用低濃度包蟲囊液干預(yù)HepG2 細胞，發(fā)現(xiàn)隨著干預(yù)時間的延長可降低IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFIT3 和 ISG15 的表達，但會促進 Foxp3 的表達，并且 IFITM3 與 Foxp3 呈負相關(guān)。我們同時發(fā)現(xiàn)，IFITM3 作為抗病毒和抗病原體重要的蛋白，在包蟲病感染后期表達量減少的一部分原因可能為IFITM3 和Foxp3 呈現(xiàn)負相關(guān)性，也可能是IFITM3 蛋白的翻譯后修飾。IFITM3 受到多種翻譯后修飾的調(diào)節(jié)，這些修飾決定了其細胞定位、活性和豐度，包括有棕櫚?；?、泛素化、磷酸化和甲基化，而只有棕櫚?；瘜FITM3 的調(diào)劑起促進作用，其他三種翻譯后修飾會抑制IFITM3的抗病毒作用，使IFITM3應(yīng)對蟲體的攻擊能力下降，從而蟲體逃避宿主的免疫攻擊［11］。因此，后期我們將進一步研究包蟲感染過程中IFITM3 蛋白翻譯后修飾所致免疫逃逸機制，為包蟲感染疾病的作用機制和治療提供新思路、新想法。