張懿丹，麥婷婷，方晶晶，萬坤銘，王麗娜

1 海軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院，上海 200433；2 海軍軍醫(yī)大學中醫(yī)系

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤，病死率高，其病因和發(fā)病機制尚未確定［1］。目前，臨床治療原發(fā)性肝癌的方法主要包括以肝切除術、肝移植術為代表的外科治療及經(jīng)肝動脈化療栓塞術、局部消融、化療、靶向治療等局部治療，均取得一定療效，但也存在局限性［2］。近年來，中醫(yī)藥逐步介入原發(fā)性肝癌的治療過程，在病程各期聯(lián)合西醫(yī)療法可達到提高療效、減輕不良反應、延長患者生存期等目的，具有良好的輔助作用［3］。烏頭分為川烏、草烏兩種，入心、肝、脾經(jīng)，有溫陽散寒、除濕止痛的功能。多項研究報道，烏頭對惡性腫瘤有治療作用。口服烏頭湯及外敷癌癥鎮(zhèn)痛散均可有效緩解患者癌性疼痛；肌內注射烏頭注射液可提高患者巨噬細胞吞噬功能，提高機體免疫力，增強抗腫瘤能力［4］?，F(xiàn)代藥理學研究也顯示，烏頭具有抗腫瘤、調節(jié)免疫、抗炎和鎮(zhèn)痛等方面的藥理作用［5］。雖然已有多項研究表明了烏頭治療腫瘤的有效性，但關于烏頭治療原發(fā)性肝癌的相關報道仍然較少。2020年2月—2021年12月，本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法分析了烏頭治療原發(fā)性肝癌的有效成分及作用機制，旨在為烏頭用于原發(fā)性肝癌治療的基礎和臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 烏頭有效活性成分篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw. com/tcmsp.php）中查找中藥川烏與草烏的化學成分，以生物口服利用度（OB）≥30%、化合物類藥性（DL）≥0.18為條件篩選烏頭的有效活性成分。

1.2 烏頭治療原發(fā)性肝癌的相關靶點收集 烏頭潛在作用靶點收集：在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中利用Targets information 功能進行在線分析，利用Mol ID 一欄搜索上一步篩選出的烏頭有效活性成分ID，得到各有效活性成分對應的靶點信息，在美國國家生物技術信息中心基因數(shù)據(jù)庫（NCBI，https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/gene/）中將靶點信息轉換為基因名稱。原發(fā)性肝癌潛在靶點收集：在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www. genecards. org/）中 以“primary liver cancer”為關鍵詞檢索獲得已有研究的原發(fā)性肝癌相關基因，以相關度＞0 為篩選標準，最大化納入原發(fā)性肝癌相關靶點。通過使用韋恩圖工具（https：//bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/）將原發(fā)性肝癌潛在靶點與烏頭潛在作用靶點取交集，獲得烏頭治療原發(fā)性肝癌的相關靶點。

1.3 烏頭治療原發(fā)性肝癌的有效活性成分—相關靶點相互作用關系分析 在Cytoscape3.7.2 軟件中構建烏頭治療原發(fā)性肝癌的有效活性成分—相關靶點相互作用網(wǎng)絡圖，在輸出結果中以不同顏色的節(jié)點分別代表烏頭、烏頭有效活性成分、烏頭治療原發(fā)性肝癌的相關靶點以及原發(fā)性肝癌，若節(jié)點間有相互作用，則兩者以直線相連，以此觀察烏頭治療原發(fā)性肝癌的有效活性成分—相關靶點相互作用關系。

1.4 烏頭治療原發(fā)性肝癌核心靶點篩選 在bioDBnet數(shù)據(jù)庫（https：//biodbnetabcc.ncifcrf.gov/）中將烏頭治療原發(fā)性肝癌相關靶點進行基因ID 轉換，將烏頭治療原發(fā)性肝癌相關靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db. org/），將物種設定為Homo sapiens 并刪去無關聯(lián)的節(jié)點，獲得烏頭治療原發(fā)性肝癌相關靶點的蛋白互作關系，將數(shù)據(jù)保存后導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構建烏頭治療原發(fā)性肝癌相關靶點蛋白互作關系圖。蛋白互作關系圖中，節(jié)點表示烏頭治療原發(fā)性肝癌的相關靶點，度中心性（DC）表示一個節(jié)點與其他所有節(jié)點間直接聯(lián)系數(shù)的總和，DC值越大，節(jié)點越大，與其他靶點的相關性越大。選取DC 值前5 位的靶點作為烏頭治療原發(fā)性肝癌的核心靶點。

1.5 相關靶點的GO生物學過程及KEGG信號通路分析 在Geneontology 數(shù)據(jù)庫（http：//geneontology.org/）中對相關靶點進行GO 生物學過程分析，以校正后P＜0.05 作為篩選標準，得到顯著富集的過程。在 KEGG 數(shù)據(jù)庫（https：//www. kegg. jp/）中對相關靶點進行KEGG 信號通路分析，以校正后P＜0.05 作為篩選標準，得到顯著富集的通路。

2 結果

2.1 烏頭有效活性成分篩選結果 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中共收集到符合OB≥30%、DL≥0.18 的川烏有效活性成分3 種、草烏有效活性成分8 種，去重后獲得烏頭有效活性成分10種。見表1。

表1 烏頭有效活性成分

2.2 烏頭治療原發(fā)性肝癌的相關靶點收集結果在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中共搜索到有靶點信息的烏頭有效活性成分3 個，共24 個靶點信息。見表2。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中共收集到14 274 個原發(fā)性肝癌相關基因。通過韋恩圖工具將烏頭潛在作用靶點與原發(fā)性肝癌相關靶點取交集，獲得烏頭治療原發(fā)性肝癌的相關靶點22 個，包括乙酰膽堿酯酶（ACHE）、腎上腺素能受體α1A（ADRA1A）、腎上腺素能受體α1B（ADRA1B）、腎上腺素能受體α1D（ADRA1D）、腎上腺素能受體β2（ADRB2）、雄激素受體（AR）、毒蕈堿型乙酰膽堿受體M1（CHRM1）、毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3（CHRM3）、熱休克蛋白90αA1（HSP90AA1）、熱休克蛋白 90αB1（HSP90AB 1）、核受體輔激活蛋白 1（NCOA1）、核受體輔激活蛋白2（NCOA2）、內皮型一氧化氮合酶（NOS3）、阿片受體 δ1（OPRD1）、阿片受體 μ1（OPRM1）、孕酮受體（PGR）、前列腺素內過氧化物合酶1（PTGS1）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、視黃醇X 受體α（RXRA）、SCN5A、拓撲異構酶Ⅱα（TOP2A）、拓撲異構酶Ⅱβ（TOP2B）。

表2 烏頭有效化學成分的相關靶點信息數(shù)

2.3 烏頭治療原發(fā)性肝癌的有效成分—相關靶點相互作用關系分析結果 烏頭治療原發(fā)性肝癌的有效成分—相關靶點相互作用網(wǎng)絡圖可見，編號為MOL002086 的有效成分可通過靶點PGR、NCOA1、NCOA2作用于原發(fā)性肝癌，編號為MOL002087的有效成分可通過靶點NCOA2、PGR、RXRA 作用于原發(fā)性肝癌，編號為MOL004763 的有效成分可通過ACHE、ADRA1A、ADRA1B、ADRA1D、ADRB2、AR、CHRM1、CHRM3、HSP90AA1、HSP90AB1、NOS3、OPRD1、OPRM1、PTGS1、PTGS2、RXRA、SCN5A、TOP2A、TOP2B 這19 個相關靶點作用于原發(fā)性肝癌。見OSID碼圖1。

2.4 烏頭治療原發(fā)性肝癌核心靶點篩選結果 烏頭治療原發(fā)性肝癌相關靶點蛋白互作關系圖可見，烏頭治療原發(fā)性肝癌的核心靶點為NOS3、ACHE、ADRA1B、AR和PGR。見OSID碼圖2。

2.5 相關靶點的GO生物學過程及KEGG信號通路分析結果 GO 生物學過程分析共收集到校正后P值＜0.05 的GO 生物學過程62 個，包括類固醇激素受體活性、G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性、腎上腺素能受體活性、肽結合、核受體結合以及胺結合等。見OSID碼圖3。KEGG 信號通路分析共收集到校正后P值＜0.05 的信號通路18 個，包括雌激素信號通路、鈣信號通路、白細胞介素17（IL-17）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）信號通路以及輔助性T細胞17（Th17）細胞分化等。見表3。

表3 烏頭治療原發(fā)性肝癌核心靶點的KEGG信號通路分析結果

3 討論

網(wǎng)絡藥理學可通過運用多種數(shù)據(jù)庫和分析工具來構建藥物—疾病網(wǎng)絡，從而挖掘網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點，闡釋藥物作用于疾病的機制［6］。本研究基于網(wǎng)絡藥理學分析了烏頭治療原發(fā)性肝癌的有效成分及作用機制，以期為原發(fā)性肝癌的治療提供理論依據(jù)。

本研究共篩選獲得3種烏頭有效成分及22個烏頭治療原發(fā)性肝癌的相關靶點，其中烏頭有效成分異波爾定堿治療原發(fā)性肝癌的潛在靶點有19個，占總作用靶點的86.4%，并可作用于NOS3、ACHE、ADRA1B 和AR 這4 個烏頭治療原發(fā)性肝癌核心靶點。以往對異波爾定堿的相關研究主要集中于降血壓及抗焦慮方面，本研究結果顯示，異波爾定堿作用的關鍵靶點NOS3 是NOS 的一種亞型，能夠起調節(jié)血管擴張和平滑肌增生的作用［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，NOS3在癌旁肝組織中的表達增加，可能是通過其舒張血管、增加肝癌組織血供和促進肝癌組織血管形成的作用促進其生長［8］。這提示異波爾定堿作用的NOS3在肝癌生長過程中具有重要作用，異波爾定堿可以作為治療肝癌潛在活性成分進行更深入的研究。

已有研究表明，炎癥與肝癌密切相關［9］。在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥可促進肝癌細胞的增殖與存活，通過影響免疫調控幫助肝癌細胞逃脫免疫系統(tǒng)監(jiān)視，還能促使基因突變并誘導血管生成［10］。炎癥細胞作為肝癌微環(huán)境的重要組成部分，貫穿著肝癌發(fā)生發(fā)展和轉移的全過程，抑制炎癥可以延緩肝癌的生長和進一步發(fā)展，擴大早期發(fā)現(xiàn)癌癥的機會并降低肝癌轉移的病死率［11］。Th17 細胞是一種具有獨立分化和調節(jié)機制的CD4+T 淋巴細胞，可特異性分泌重要的促炎細胞因子IL-17，其誘導的炎癥介質可刺激功能失調的髓樣細胞的擴張和募集，建立一個促血管生成和免疫抑制的肝癌微環(huán)境，從而促進肝癌的生長和轉移［12-13］。近年來，在組織干細胞中還發(fā)現(xiàn)了IL-17介導的直接有絲分裂信號，進一步證明了IL-17 在肝癌發(fā)展過程中的重要作用［14］。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者外周血和癌組織中Th17細胞占CD4+T 淋巴細胞的比例顯著升高，能促進血管生成和肝癌細胞增殖的IL-17 表達也顯著高于非癌組織，提示Th17 細胞比例升高和IL-17 水平升高與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關，其可成為抗肝癌的重要靶點［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，烏頭有效成分的作用靶點與Th17 細胞分化以及IL-17 信號通路密切相關，這與以往烏頭能夠抑制炎癥反應的研究相互印證，為烏頭用于原發(fā)性肝癌治療的研究提供了網(wǎng)絡藥理學證據(jù)［16-17］。

此外，在癌細胞中高表達的HSP90α 作為一種分子伴侶，可通過與癌組織發(fā)生相關蛋白結合使蛋白以活性形式存在，從而促進肝癌的生長與轉移。PI3K-AKT信號通路的異?；罨c肝癌細胞的生長、代謝密不可分，其中的AKT 作為HSP90α 的客戶蛋白，可被HSP90α 抑制劑誘導凋亡，使肝癌細胞的增殖和遷移受到抑制［18-19］。與 HSP90α 抑制劑作用相似，烏頭有效化學成分的作用靶點涉及HSP90AA1，且與PI3K-AKT 信號通路密切相關，提示烏頭或可通過影響HSP90AA1 進而抑制PI3K-AKT 信號通路達到抗肝癌的目的，具有一定的研究價值。

同時，我們發(fā)現(xiàn)KEGG 信號通路富集分析中富集程度最高的雌激素信號通路囊括了PGR 在內的7 個靶點，而雌激素及其受體可通過介導炎癥因子的表達在一定程度上抑制肝癌的發(fā)展［20］。KEGG 通路富集分析同時發(fā)現(xiàn)，鈣信號通路包含了鈣依賴性蛋白NOS3 在內的7 個作用靶點，可介導NOS3 蛋白表達的過程［8］。這提示烏頭對原發(fā)性肝癌的治療是多靶點、多途徑的，應當從多角度進行研究。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法，從理論上初步分析了烏頭治療原發(fā)性肝癌的有效成分及相關靶點，并對其作用機制進行了探討，為烏頭治療原發(fā)性肝癌相關機制提供了網(wǎng)絡藥理學證據(jù)。烏頭可通過異波爾定堿等有效成分作用于NOS3、ACHE、ADRA1B等核心靶點，調控類固醇激素受體活性、激素結合、G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性等生物學過程及IL-17、PI3K-AKT 等信號通路，多靶點、多途徑協(xié)同發(fā)揮治療原發(fā)性肝癌的作用。但本研究存在著一定的局限性：①僅使用網(wǎng)絡藥理學方法對烏頭治療原發(fā)性肝癌的相關機制作理論分析，并沒有運用體內或體外的相關研究論證烏頭治療原發(fā)性肝癌的相關靶點及信號通路，因此烏頭治療原發(fā)性肝癌的有效性尚需進一步的實驗研究。②烏頭的毒性在很大程度上限制了其研究與臨床應用，目前不僅缺乏其抗腫瘤機制的深入研究，而且其成分靶點的研究也存在空白，導致我們可用于討論的相關參考文獻較少。在以后的研究中，我們希望可以通過體內或體外的臨床研究佐證我們通過網(wǎng)絡藥理學分析得出的結論，并致力于尋找烏頭減毒增效的方法，以期未來能夠進一步挖掘烏頭治療原發(fā)性肝癌的深層次機制，為臨床提供安全有效、作用明晰的治療策略。