區(qū)浩松，楊陽(yáng)，趙俊云

北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488

交泰丸是臨床上常用的治療心腎不交型失眠癥的中醫(yī)經(jīng)典方劑，以黃連、肉桂組方，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤的作用［1-2］。失眠是由于長(zhǎng)期情緒緊張或抑郁、負(fù)性精神刺激及精神創(chuàng)傷等因素造成大腦皮層興奮與抑制調(diào)節(jié)功能失調(diào)而引起的，長(zhǎng)期失眠可導(dǎo)致能量消耗增加，而能量產(chǎn)生的過(guò)程中伴有活性氧（ROS）的形成，大腦內(nèi)ROS 為主的自由基分子的增加和積累可引起氧化應(yīng)激損傷［3］。以往對(duì)于交泰丸作用機(jī)制的研究大多集中在其對(duì)失眠的治療作用方面，但關(guān)于其是否可以改善腦部細(xì)胞氧化損傷的研究較少?；诖?，2021年11月—2022年2月，本研究使用大鼠交泰丸含藥血清對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的人腦膠質(zhì)細(xì)胞（HEB）氧化損傷模型進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)HEB 氧化損傷的改善作用，并從細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及衰老相關(guān)基因沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）、趨化因子聯(lián)接因子1（CXCL1）、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O 亞族1（FOXO1）、P16、白細(xì)胞介素1α（IL-1α）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3（IGFBP3）、IL-6 的表達(dá)探討交泰丸抗腦部氧化損傷的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0015。細(xì)胞：HEB 購(gòu)買(mǎi)自蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。試劑：肉桂及黃連飲片購(gòu)自北京同仁堂，β-半乳糖苷酶染色試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8 試劑盒購(gòu)自北京翱翔生物科技有限公司，2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司Hoechst33342熒光染料、BCA 蛋白定量試劑盒、超敏發(fā)光液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，總RNA 小提試劑盒購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司，RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific。儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自日本Sanyo，超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Pultton，QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System 購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher Scientific，共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本Olympus，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman，正倒置一體顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Echo，酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)BioTek。

1.2 交泰丸含藥血清制備 將SD 大鼠在正常環(huán)境、光照及飲食下進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將大鼠隨機(jī)分為兩部分各5 只，分別制備含藥血清及空白血清。含藥血清：大鼠給予肉桂和黃連（1∶9）水提物灌胃，生藥含量為0.31 g/mL，灌服量為 1 次/天，每次 2 mL，連續(xù)灌服 5 d。第5 天時(shí)，大鼠禁食不禁水，在最后一次灌胃4 h 后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，從腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min 離心10 min 提取血清，過(guò)濾除菌，56 ℃補(bǔ)液滅活30 min，分裝后在-20 ℃保存。空白血清：大鼠給予同體積蒸餾水灌胃，其他操作方法同上。將DMEM培養(yǎng)基與血清配制成10%完全培養(yǎng)基，待用。

1.3 細(xì)胞分組處理及氧化損傷模型的建立 將HEB 以 4×104/孔接種到 96 孔板，培養(yǎng) 12 h 后分為對(duì)照組、模型組及交泰丸組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組及模型組加入空白血清培養(yǎng)基，交泰丸組加入含藥血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，交泰丸組及模型組使用終濃度為10 μmol/L的H2O2處理建立HEB氧化損傷模型，對(duì)照組使用等體積PBS 處理。處理1 h 后，各組更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 細(xì)胞氧化損傷比例觀察 三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)液，用PBS 洗1 次，用染色固定液在室溫下固定 15 h。PBS 洗滌 3 次，將 500 μL β-半乳糖苷酶染色工作液加入孔內(nèi)，37 ℃孵育過(guò)夜。顯微鏡下每孔隨機(jī)取三個(gè)細(xì)胞密度大致相同的視野，按照（視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)）×100%計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例，陽(yáng)性細(xì)胞比例即為氧化損傷比例。

1.5 細(xì)胞活力觀察 采用CCK-8 法。三組細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 后吸出培養(yǎng)液，取 100 μL CCK-8 工作液加入各孔內(nèi)，2 h 后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm 時(shí)的光密度值（OD），以（交泰丸組OD－模型組OD/對(duì)照組OD-模型組OD）×100%計(jì)算細(xì)胞活力。

1.6 細(xì)胞凋亡情況觀察 將三組細(xì)胞消化、離心后棄去上清液，加入終濃度為5 μg/mL的Hoechst33342熒光染料和終濃度10 μg/mL的PI染色液，在37 ℃孵育20 min。離心后棄去上清液，PBS 重懸，避光。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，設(shè)第一通道的激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm、檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，設(shè)第二通道的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm、檢測(cè)波長(zhǎng)為610 nm。

1.7 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平觀察 采用活性氧熒光染色法。三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后吸出培養(yǎng)液，加入終濃度為5 μg/mL 的Hoechst33342 熒光染料和終濃度1 μmol/L的DCFH-DA熒光染料，在37 ℃孵育20 min，使用DMEM 培養(yǎng)基輕輕洗3 次后加入PBS。在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，設(shè)第一組通道激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm、檢測(cè)波長(zhǎng)為430～470 nm，設(shè)第二組通道激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm、檢測(cè)波長(zhǎng)為500～600 nm。

1.8 細(xì) 胞 SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用 qRT-PCR 法。三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后吸出培養(yǎng)液，嚴(yán)格按照總RNA小提試劑盒操作方法提取細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃60 min，70 ℃5 min。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6及內(nèi)參GAPDH 的引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)，運(yùn)行機(jī)器自身的熔解曲線。采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6及GAPDH引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)和Shapiro-Wilk檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若呈正態(tài)分布以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；若呈非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞氧化損傷比例比較 β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組、交泰丸組細(xì)胞氧化損 傷 比例 分 別 為 12.78% ± 2.24%、32.60% ±8.55%、17.08% ± 2.84%，模型組＞交泰丸組＞對(duì)照組（P均＜0.05）。見(jiàn)OSID碼圖1。

2.2 三組細(xì)胞活力比較 對(duì)照組、模型組、交泰丸組細(xì)胞活力分別為 99.44% ± 4.84%、49.75% ±1.62%、54.36% ± 2.47%，對(duì)照組＞交泰丸組＞模型組（P均＜0.05）。

2.3 三組細(xì)胞凋亡情況比較 對(duì)照組、模型組、交泰丸組細(xì)胞凋亡率分別5.64% ± 4.44%、59.37% ±1.70%、41.6%±1.08%，模型組＞交泰丸組＞對(duì)照組（P均＜0.05）。見(jiàn)OSID碼圖2。

2.4 三組細(xì)胞氧化應(yīng)激水平比較 激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，輪廓完整，核膜邊界清晰，ROS熒光強(qiáng)度低；模型組細(xì)胞形態(tài)有明顯變化，細(xì)胞膜邊緣輪廓不清晰，核膜發(fā)生部分裂解，ROS熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；交泰丸組細(xì)胞膜及核膜結(jié)構(gòu)較模型組更加完整，ROS熒光強(qiáng)度降低。見(jiàn)OSID碼圖3。

2.5 三組細(xì)胞SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6 mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 三組細(xì)胞SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6 mRNA表達(dá)比較（）

表2 三組細(xì)胞SIRT1、CXCL1、FOXO1、P16、IL-1α、IGFBP3、IL-6 mRNA表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組交泰丸組IL-6 mRNA 1.01±0.14 1.01±0.22 1.08±0.47 SIRT1 mRNA 1.00±0.04 0.43±0.04*0.96±0.05#CXCL1 mRNA 1.00±0.00 1.75±0.00*0.86±0.18 FOXO1 mRNA 0.98±0.08 0.74±0.03*1.00±0.04#P16 mRNA 1.03±0.31 1.02±0.26 1.04±0.35 IL-1α mRNA 1.05±0.33 1.01±0.18 1.02±0.26 IGFBP3 mRNA 1.00±0.02 1.05±0.40 1.03±0.30

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，心腎不交型失眠主要以心腎不交為主軸，心火不降，腎水不升，形成未濟(jì)現(xiàn)象，陰陽(yáng)失交而發(fā)為失眠［4］。交泰丸以黃連、肉桂組方，黃連性寒、味苦，有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，具有抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)的作用［5］；肉桂性大熱、味辛甘，有補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛、溫經(jīng)通脈之功效，具有神經(jīng)保護(hù)、降脂、抗氧化、抗炎的作用［6］。兩藥配伍體現(xiàn)了中醫(yī)交通心腎、引火歸元的治則。

本研究使用終濃度為10 μmol/L 的H2O2處理HEB 細(xì)胞建立了細(xì)胞氧化損傷模型，并使用交泰丸含藥血清培養(yǎng)基預(yù)處理，結(jié)果顯示交泰丸含藥血清降低了細(xì)胞氧化損傷比例，提示交泰丸含藥血清處理能有效抵抗H2O2誘導(dǎo)的HEB 細(xì)胞氧化損傷。本研究結(jié)果同時(shí)顯示，交泰丸含藥血清預(yù)處理的HEB細(xì)胞活力增強(qiáng)、ROS熒光強(qiáng)度減弱、凋亡細(xì)胞比例降低，提示交泰丸含藥血清可促進(jìn)H2O2處理的細(xì)胞活力恢復(fù)、降低細(xì)胞內(nèi)氧化損傷水平，并可能通過(guò)抗凋亡途徑抵抗細(xì)胞氧化損傷。

氧化損傷和炎癥是導(dǎo)致衰老的重要因素，SIRT1、FOXO1 可共同調(diào)節(jié)氧化損傷和炎癥，從而參與衰老的調(diào)控［7］。FOXO1是Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族的O亞類(lèi)成員之一，也被稱(chēng)為長(zhǎng)壽因子，廣泛存在于生物體中，在轉(zhuǎn)錄中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。核激活的FOXO1可通過(guò)控制下游基因的表達(dá)，與靶點(diǎn)結(jié)合參與抗氧化應(yīng)激、細(xì)胞存活、凋亡、自噬、代謝調(diào)節(jié)等生物過(guò)程［8］。SIRT1是NAD+依賴(lài)性脫乙酰酶家族的成員，是重要的長(zhǎng)壽基因。SIRT1參與DNA修復(fù)、凋亡、炎癥、衰老等生物過(guò)程，F(xiàn)OXO1 可受SIRT1 調(diào)控激活細(xì)胞自噬，參與細(xì)胞增殖等過(guò)程，對(duì)衰老、氧化應(yīng)激等有著重要作用［9］。本研究結(jié)果顯示，交泰丸組SIRT1、FOXO1 mRNA 表達(dá)水平顯著上升，提示交泰丸可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬、增殖等途徑發(fā)揮抗細(xì)胞氧化損傷與抗衰老的作用。本研究選取的CXCL1、IL-1α、IL-6、P16、IGFBP3 均是衰老相關(guān)基因。CXCL1 是CXC 趨化因子重要的家族成員，參與許多炎癥性疾病發(fā)展，也是一種有效的中性粒細(xì)胞趨化因子和激活劑，主要通過(guò)CXCR2 受體起作用［10］。IL-1α 與 IL-6 均是促炎因子，IL-6 受 IL-1α 調(diào)控，參與細(xì)胞衰老，與衰老誘導(dǎo)的炎癥密切相關(guān)［11-12］。本研究結(jié)果顯示，模型組 CXCL1 mRNA 表達(dá)較對(duì)照組上升，交泰丸組CXCL1 mRNA 表達(dá)較模型組下調(diào)，提示交泰丸可能通過(guò)抗炎癥途徑減少炎性細(xì)胞衰老的發(fā)生。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，IL-1α、IL-6、IGFBP3、P16的mRNA 表達(dá)無(wú)差異，后續(xù)我們將設(shè)計(jì)不同時(shí)間和劑量等梯度深入探討可能的分子水平變化。

綜上所述，本研究基于交泰丸交通心腎、引火歸元的理論，通過(guò)大鼠交泰丸含藥血清干預(yù)HEB 氧化損傷模型，發(fā)現(xiàn)交泰丸含藥血清可抑制H2O2誘導(dǎo)的HEB氧化損傷，其可能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞活力、抗細(xì)胞凋亡、降低胞內(nèi)ROS 水平以及抗炎發(fā)揮作用。本研究只是初步探討了交泰丸對(duì)腦部氧化損傷的改善作用及其機(jī)制，后續(xù)還將結(jié)合體內(nèi)研究進(jìn)一步深入探究交泰丸抗腦部氧化損傷分子機(jī)制，為中醫(yī)心腎理論的生物學(xué)闡釋提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。