何超拔，王友煉，袁少英，耿立果，覃湛，金明昱，張兆磊，王偉光

廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院，廣東 珠海 519015

精索靜脈曲張(varicocele，VC)是指精索內(nèi)蔓狀靜脈叢的異常擴(kuò)張、伸長和迂曲。普通成人患病率約為15%[1]，其中20%～50%患者伴精液質(zhì)量異常和睪丸組織學(xué)異常，并影響男性的生育能力。生精細(xì)胞的大量凋亡與VC不育癥密切相關(guān)，其細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要與線粒體自噬相關(guān)蛋白通道、促細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白通道[2-3]以及環(huán)境毒素增加而誘導(dǎo)支持細(xì)胞腫瘤壞死因子受體超家族因子6(tumor necrosis factor receptor superfamily member 6，F(xiàn)as)配體蛋白水平上升有關(guān)[4]。VC屬于中醫(yī)學(xué)“筋瘤”范疇，治療以活血化瘀為主，并根據(jù)具體情況辨證加減，如佐以清熱祛濕、疏肝行氣、滋補(bǔ)肝腎等[5]。對于腎虛血瘀型VC不育癥患者，中藥治療的妊娠率可以達(dá)到與手術(shù)治療相當(dāng)?shù)男Ч鸞6]。丹紅通精方是廣東省名中醫(yī)袁少英教授基于腎虛血瘀理論制定的治療VC不育癥的經(jīng)驗方，具體藥物組成：蒲黃 10 g，五靈脂10 g，水蛭3 g，丹參20 g，黃芪30 g，紅景天15 g，桃仁10 g，紅花6 g，穿破石10 g，牡蠣 30 g，川牛膝10 g，黃精10 g，枸杞子10 g，具有活血化瘀、補(bǔ)腎養(yǎng)陰之效。前期相關(guān)研究表明，丹紅通精方可顯著改善VC不育癥患者的精液質(zhì)量[7]。本研究旨在通過構(gòu)建VC大鼠模型探索其治療VC不育癥的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)機(jī)制，為其在臨床的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物8周齡SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量(290±15) g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(粵) 2008-0002，動物質(zhì)量合格證號：0094460。飼養(yǎng)于中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院SPF級實驗動物中心，使用許可證號為：SYXK(粵)2018-0188。自由飲水、進(jìn)食，溫度(24±2) ℃，濕度50%～70%，定期清潔消毒。

1.2 藥物及試劑蒲黃、五靈脂、水蛭、丹參、黃芪、紅景天、桃仁、紅花、穿破石、牡蠣、川牛膝、黃精、枸杞子顆粒(國藥集團(tuán)江陰天江藥業(yè)有限公司，批號：19060431、19061801、19050711、19120571、19050811、19121901、19121291、19060813、19060513、19060624、19080724、19031881、19080332)。大鼠卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、雙氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)檢測試劑盒及FAS抗體、Fas配體(fas ligand，F(xiàn)asL)抗體(廣州市欣福聯(lián)生物科技有限公司，貨號：E-EL-R0391C、E-EL-R0026C、E-EL-0031C、A0233、A0234)；原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TdT-mediated-dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒(美國Promega公司，批號：15595-026)；Bouin′s固定液(北京索萊寶科技有限公司，批號：G2300)。

1.3 儀器JY-9000型偉力數(shù)碼彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)(北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司)；BX53型熒光正置顯微鏡(日本OLYMPUS)；Pannoramic 250 Flash 型高分辨數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)(匈牙利3DHISTECH公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模與給藥采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只SD雄性大鼠分為假手術(shù)組、模型組及丹紅通精方低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組各8只。除假手術(shù)組外，其余組大鼠參照Turner腎靜脈縮窄術(shù)建立VC病理模型[8]，具體操作如下：戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，固定于操作臺，剃毛消毒，取腹正中切口，依次切開皮膚、肌肉、腹膜，找到左腎靜脈，順著腎靜脈找到精索內(nèi)靜脈，于下腔靜脈與精索內(nèi)靜脈之間放上24 G針頭，將針頭與左腎靜脈一起結(jié)扎，觀察發(fā)現(xiàn)左腎淤血明顯，然后小心抽出針頭。隨即可見左腎靜脈擴(kuò)張和左腎淤血消失，此時左腎靜脈結(jié)扎處的直徑減半，表示手術(shù)成功。假手術(shù)組只打開腹腔并找到左腎靜脈，不結(jié)扎。術(shù)后1周，各組大鼠開始灌胃，按照人與大鼠的體表面積進(jìn)行換算[9]，丹紅通精方低劑量組、中劑量組、高劑量組分別按1.3 g·kg-1·d-1、2.5 g·kg-1·d-1、5.0 g·kg-1·d-1標(biāo)準(zhǔn)給藥，假手術(shù)組、模型組灌胃給予等體積生理鹽水，早晚各1次，8周為1個療程。

2.2 精液質(zhì)量分析灌胃結(jié)束1周后再次麻醉SD大鼠，快速打開腹腔，剝離大鼠睪丸及附睪組織。取左側(cè)附睪組織稱其質(zhì)量后置于水浴箱中預(yù)溫的Hams′F10培養(yǎng)液中剪碎，37 ℃溫育30 min，使用 JY-9000型偉力數(shù)碼彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)檢測精子活力及精子總數(shù)。

2.3 TUNEL檢測睪丸細(xì)胞凋亡率取左側(cè)睪丸，用冷生理鹽水反復(fù)沖洗，電子天平稱其質(zhì)量，取部分睪丸組織用Bouin′s液固定，24 h后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋。切取4 μm厚睪丸組織石蠟切片，脫蠟、脫水、透明后，其余步驟按TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作，顯微鏡下組織切片中細(xì)胞核呈棕褐色或棕黃色的細(xì)胞為TUNEL陽性細(xì)胞，觀察每張切片的5個視野，記錄生精細(xì)胞數(shù)目及凋亡的生精細(xì)胞數(shù)目，并計算生精細(xì)胞凋亡率。

2.4 Western Blot 檢測大鼠睪丸組織中Fas、FasL蛋白的表達(dá)水平取大鼠左側(cè)睪丸組織，用冷生理鹽水反復(fù)沖洗，組織剪剪碎組織，放入RIPA 組織裂解液中，在玻璃勻漿器中勻漿破碎細(xì)胞，操作在冰上進(jìn)行，每次勻漿約1 min，間隔5 min 勻漿1 次，共5 次。4 ℃ 下放置過夜后12 000 r·min-1離心約 5 min，取上清液，分裝保存。依據(jù)BCA 蛋白定量檢測試劑盒的操作說明書檢測樣品蛋白濃度；將分離膠置于電泳槽內(nèi)加入電泳液；取樣品蛋白體積2倍的加樣緩沖液，每孔60 μg上樣；開始電泳，分離膠恒壓100 V、濃縮膠恒壓120 V，直到溴酚藍(lán)跑至濃縮膠末端；剝離凝膠轉(zhuǎn)至PVDF 膜上；將PVDF膜采用TBST漂洗5 min，之后采用5%脫脂牛奶搖床封閉1.5 h；TBST 洗膜10 min后，4 ℃孵育一抗(稀釋比例為11 000)過夜；TBST洗膜3次，每次 10 min，室溫孵育二抗(稀釋比例為11 000)2 h；TBST 洗膜3次，每次10 min，在暗室內(nèi)顯影、定影。采用Quantity one軟件分析相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

2.5 ELISA檢測血清性激素的水平取大鼠下腔靜脈血，離心后取血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書的要求檢測大鼠血清中FSH、LH和DHT的水平。

3 結(jié)果

3.1 各組VC大鼠附睪精液質(zhì)量比較最終造模成功的SD大鼠共32只，假手術(shù)組、模型組及丹紅通精方低劑量組各6只，丹紅通精方中劑量組、高劑量組各7只。結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的精子總數(shù)和運(yùn)動精子百分比明顯降低，不運(yùn)動精子百分比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，丹紅通精方低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠的精子總數(shù)和運(yùn)動精子百分比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；丹紅通精方中劑量組、高劑量組大鼠不運(yùn)動精子的百分比明顯減少(P<0.01)。見表1。

表1 各組VC大鼠附睪精液質(zhì)量比較

3.2 丹紅通精方對大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡的影響假手術(shù)組大鼠睪丸組織生精小管排列整齊，邊界完整清晰，生精上皮飽滿，各級生精細(xì)胞層次清晰，管腔內(nèi)精子濃度高，可見不同發(fā)育形態(tài)的精子，未見明顯凋亡的精子細(xì)胞。模型組大鼠睪丸組織生精小管排列紊亂，邊界萎縮、塌陷，生精上皮結(jié)構(gòu)錯亂，各級生精細(xì)胞層次不清，管腔內(nèi)精子稀少。丹紅通精方低劑量組大鼠睪丸組織可見部分結(jié)構(gòu)完整的生精小管，形態(tài)不一，生精上皮萎縮，細(xì)胞稀疏，管腔塌陷，管腔內(nèi)可見少量精子細(xì)胞。丹紅通精方中劑量組大鼠睪丸組織生精小管排列整齊，邊界完整清晰，生精上皮飽滿，各級生精細(xì)胞層次清晰，管腔內(nèi)可見不同發(fā)育時期精子及少量精子細(xì)胞凋亡。丹紅通精方高劑量組大鼠睪丸組織生精小管排列整齊，邊界完整清晰，各級生精細(xì)胞層次清晰，管腔內(nèi)精子濃度高，可見大量凋亡的精子細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率比較發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡率升高；與模型組比較，丹紅通精方低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡率降低；與丹紅通精方中劑量組比較，丹紅通精方低劑量組、高劑量組大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 各組VC大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡率比較

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：丹紅通精方低劑量組；D：丹紅通精方中劑量組；E：丹紅通精方高劑量組圖1 丹紅通精方對大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡的影響(×400)

3.3 各組VC大鼠睪丸組織中Fas、FasL蛋白表達(dá)比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠睪丸組織中Fas、FasL蛋白的表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，丹紅通精方低劑量組、中劑量組大鼠睪丸組織中Fas、FasL蛋白的表達(dá)水平顯著降低，丹紅通精方高劑量組大鼠睪丸組織中FasL蛋白的表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，F(xiàn)as蛋白的表達(dá)水平雖有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表3。

圖2 各組SD大鼠睪丸組織Fas、FasL蛋白表達(dá)Western Blot圖

3.4 各組VC大鼠血清性激素水平比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中LH、FSH水平升高，DHT水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，丹紅通精方高劑量組大鼠血清中LH水平升高，丹紅通精方各給藥組大鼠血清中FSH的水平降低，DHT的水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表3 各組VC大鼠睪丸組織Fas、FasL蛋白表達(dá)比較

表4 各組VC大鼠血清性激素水平比較

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)家對VC不育癥的病因病機(jī)論述不盡一致，如賈玉森教授認(rèn)為補(bǔ)腎法應(yīng)貫穿VC不育癥整個治療過程[10]；張耀圣教授認(rèn)為清陽不升、濁陰不降為因，腎虛血瘀為果，主張健脾益氣，升清降濁[11]；鄭軍狀等[12]認(rèn)為，VC應(yīng)以肝腎立論，肝氣郁結(jié)、經(jīng)絡(luò)瘀阻、腎精不足是本病的基本病機(jī)，基本治則為疏肝通絡(luò)強(qiáng)精。盡管各家論述有所側(cè)重，但始終離不開腎虛與血瘀兩方面，即腎虛血瘀是VC不育癥基本病機(jī)[13-14]。袁少英[15]認(rèn)為瘀血內(nèi)阻是VC的根本病因，瘀血日久，化熱傷陰傷氣，耗傷腎精腎氣，故瘀熱傷陰是VC不育癥的主要病機(jī)。故VC不育癥患者辨證當(dāng)以化瘀為前提，并輔以補(bǔ)腎養(yǎng)陰生精之品，改善VC導(dǎo)致睪丸生精功能的損傷，調(diào)節(jié)性激素的水平[13，16]。丹紅通精方是袁少英教授30余年實踐經(jīng)驗的自創(chuàng)代表方，由蒲黃、五靈脂、水蛭、丹參、黃芪、紅景天、桃仁、紅花、穿破石、牡蠣、川牛膝、黃精、枸杞子組成，體現(xiàn)活血化瘀、養(yǎng)陰生精的學(xué)術(shù)思想。方中紅景天益氣補(bǔ)血活血，水蛭破血通經(jīng)、逐瘀消癥，“力攻積久之滯”；蒲黃、五靈脂合用即失笑散，是化瘀止痛的要藥，四藥合用為君，共奏活血化瘀、通絡(luò)止痛、補(bǔ)益氣血之效，起到推陳出新、驅(qū)邪不傷正的效果。黃精、枸杞子共同組成二精丸，《本草經(jīng)疏》曰：“枸杞子，潤而滋補(bǔ)，兼能退熱，而專于補(bǔ)腎、潤肺、生津、益氣，為肝腎真陰不足、勞乏內(nèi)熱補(bǔ)益之要藥?！薄侗窘?jīng)逢原》曰：“黃精，寬中益氣，使五藏調(diào)和，肌肉充盛，骨髓強(qiáng)堅，皆是補(bǔ)陰之功?！钡⒖苫钛獩鲅?、清瘀熱；穿破石清熱活血，諸藥合用，可補(bǔ)腎填精，活血清熱養(yǎng)陰，共為臣藥。黃芪可大補(bǔ)脾腎之氣，升舉陽氣，益氣養(yǎng)血，為氣中血藥；桃仁、紅花可活血止痛、化瘀通絡(luò)；牡蠣性味咸，微寒，入肝腎經(jīng)，可軟堅散結(jié)，共為佐藥，可活血化瘀、升舉陽氣；牛膝既能活血，又引藥下行至病所，具有畫龍點睛之筆為使藥。前期的研究結(jié)果表明，丹紅通精方能改善VC不育癥患者精子濃度、精子總活力、精子前向運(yùn)動率、精子低滲腫脹率、精子頂體酶，降低精漿缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的水平，其作用機(jī)制可能與改善生殖系統(tǒng)缺氧狀態(tài)有關(guān)[7]。但其是否可通過性激素或Fas/FasL通路改善精液參數(shù)尚未明確。

本次研究的結(jié)果顯示，造模成功的VC大鼠精子總數(shù)及活力下降，DHT水平降低，F(xiàn)SH、LH反饋性升高；服用丹紅通精方可顯著提高VC不育模型大鼠的精子總數(shù)，改善精子活力，其中丹紅通精方中劑量組、高劑量組大鼠的不動精子百分?jǐn)?shù)降低，與已有的研究結(jié)果一致，表明丹紅通精方可改善VC大鼠的精液參數(shù)。

精子的生長及分化受下丘腦-腺垂體-睪丸軸的內(nèi)分泌水平調(diào)控。LH可促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌雄激素，以刺激精子的發(fā)生。FSH促進(jìn)支持細(xì)胞分泌雄激素結(jié)合球蛋白，與雄激素結(jié)合，保持生精小管內(nèi)較高的活性雄激素水平，促進(jìn)精子發(fā)生。而支持細(xì)胞分泌的抑制素和間質(zhì)細(xì)胞分泌的雄激素可反饋性抑制下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropinreleasing hormone，GnRH)和腺垂體FSH、LH的分泌。支持細(xì)胞分泌的抑制素減少，導(dǎo)致FSH、LH反饋性升高。VC大鼠由于睪丸缺氧、局部高溫及氧化應(yīng)激等機(jī)制導(dǎo)致睪丸組織細(xì)胞不同程度凋亡[17]，從而導(dǎo)致生精功能障礙。研究表明，F(xiàn)SH、LH在促性腺激素抑制模型中可獨(dú)立維持精子的發(fā)生[18]，給予不同劑量的丹紅通精方后，睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的雄激素增多，對下丘腦GnRH的負(fù)反饋作用減弱，VC不育大鼠血清中DHT水平升高，反饋性降低FSH水平，提高LH水平。即丹紅通精方可通過負(fù)反饋抑制作用增加LH的分泌，減少FSH的分泌；還可促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞分泌DHT，促進(jìn)精子的發(fā)育和成熟，二者共同作用改善精子濃度及活力。

Fas、FasL是兩種重要的調(diào)控細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)，在人體的子宮、睪丸、甲狀腺、腦等器官廣泛表達(dá)，對生殖系統(tǒng)具有重要的作用。Lee等[19]證明了大鼠的睪丸遭受理化損傷后(如輻射暴露或給藥)，F(xiàn)as會在睪丸中大量表達(dá)。Francavild S等[20]發(fā)現(xiàn)，在生殖細(xì)胞停滯患者中 Fas表達(dá)上升，表明某些不育患者中Fas過量表達(dá)可能導(dǎo)致精子質(zhì)量低下。也有研究表明，F(xiàn)as在成熟精子的表達(dá)可作為細(xì)胞凋亡的生物標(biāo)志物[21]。張培海等[22]認(rèn)為大多補(bǔ)腎活血類中藥可以抑制FasL的過度表達(dá)，減少生精細(xì)胞的凋亡進(jìn)而改善精液質(zhì)量。對于Fas系統(tǒng)具體的調(diào)節(jié)機(jī)制，有研究者認(rèn)為[23-25]，睪丸細(xì)胞凋亡主要涉及FasL依賴性，內(nèi)源性和外源性凋亡途徑的直接或間接調(diào)節(jié)。一方面，F(xiàn)asL誘導(dǎo)信號復(fù)合體(death-inducing signaling complex，DISC)激活半胱氨酸蛋白酶(caspase)-8，然后激活caspase-3、caspase-6、caspase-7級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；另一方面，caspase-8的激活有助于調(diào)控線粒體通路作用于B 細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell leukemia，Bcl-2) /Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)，上調(diào)caspase-9、caspase-3誘導(dǎo)凋亡。本次研究中，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的睪丸組織破壞嚴(yán)重，顯微鏡下可見生精小管塌陷、排列紊亂，各級生精細(xì)胞層次不清，管腔內(nèi)精子稀少。TUNEL及Western Blot的結(jié)果表明，與模型組比較，服用不同劑量的丹紅通精方后，大鼠的睪丸組織凋亡率明顯下降，凋亡相關(guān)因子Fas、FasL蛋白的表達(dá)降低，表明丹紅通精方可以通過下調(diào)Fas、FasL蛋白的表達(dá)水平，降低VC大鼠睪丸細(xì)胞的凋亡率，改善大鼠的生精功能。

綜上，丹紅通精方可明顯改善VC大鼠睪丸的生精功能及精液質(zhì)量，其作用機(jī)制可能與調(diào)控性激素LH、FSH、DHT及凋亡相關(guān)蛋白Fas、FasL的表達(dá)水平有關(guān)。