鄒 俊，杜逸亭

(電子科技大學醫(yī)學院附屬婦女兒童醫(yī)院·成都市婦女兒童中心醫(yī)院 急診科，四川 成都 610073)

炎癥是宿主免疫反應的重要適應性機制，通常由細胞損傷和毒素引起[1]。過度和連續(xù)的炎癥可導致嚴重的組織損傷，最終對宿主造成嚴重損害，如肝炎、肺炎、感染性休克和類風濕性關節(jié)炎等[2]。正常的炎癥反應是自限性的，通過促炎因子的下調(diào)和抗炎因子的上調(diào)來維持機體的穩(wěn)態(tài)[3]。因此，靶向失調(diào)的炎癥過程和調(diào)節(jié)炎癥因子是控制炎癥性疾病的有效治療方法。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是一種從茶葉中分離出來的兒茶素單體，具有抗炎的作用[4]。EGCG發(fā)揮其抗炎活性的主要方式之一是調(diào)節(jié)許多信號通路[5-6]，已有研究表明EGCG通過抑制cGAS/Sting/NLRP3通路來降低H2O2誘導的髓核細胞的炎癥反應[7]。絲裂原活化蛋白激酶/核因子κB(MAPK/NF-κB)通路是參與炎癥反應的重要通路之一[8]，已有研究顯示抑制MAPK/NF-κB通路可減輕脂多糖誘導的關節(jié)軟骨細胞的炎癥反應[9]。但EGCG能否通過調(diào)控MAPK/NF-κB通路來參與炎癥反應尚不清楚。脂多糖(LPS)是一種內(nèi)毒素，可誘導巨噬細胞產(chǎn)生炎性因子及炎性介質(zhì)，利用LPS誘導RAW264.7巨噬細胞以構(gòu)建炎癥細胞模型，是評價藥物抗炎活性以及進行機制研究的常用細胞模型之一[10-11]。因此，本研究利用LPS誘導RAW 264.7細胞構(gòu)建體外細胞炎癥模型，觀察EGCG對LPS誘導的RAW 264.7細胞炎癥反應的影響，并探討其作用機制，以期為EGCG在炎癥性疾病中的使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 RAW 264.7細胞(貨號：CM-M056)購自通派(上海)生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器 EGCG(純度≥95%)、LPS購自美國Sigm-Aldrich公司；地塞米松(DEX)購自上海亞培生物科技有限公司；MAPK/NF-κB通路激活劑Anisomycin購自美國MedChemExpress公司；MTT檢測試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Bio-Rad公司；BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 ELISA試劑盒均購自上海恒遠生物科技有限公司；iNOS、COX-2、p-p38、p-IκBα、p-NF-κB、p38、IκBα、NF-κB、GAPDH兔多克隆抗體(anti-iNOS、anti-COX-2、anti-p-p38、anti-p-IκBα、anti-p-NF-κB、anti-p38、anti-IκBα、anti-NF-κB、anti-GAPDH)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗均購自美國CST公司；CO2培養(yǎng)箱購自購自上海潤度生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自南京貝登醫(yī)療股份有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組 將RAW264.7細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，然后在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中加濕培養(yǎng)。每隔1天換1次培養(yǎng)液，進行常規(guī)傳代培養(yǎng)，取傳代到第3代的細胞用于實驗。取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，消化后調(diào)整細胞濃度為5×106個/mL，并接種于6孔板中，培養(yǎng)20 h后換含0.5% FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細胞生長同步化，然后參照文獻[12-14]及前期預實驗結(jié)果，根據(jù)不同濃度 EGCG 預處理對 LPS 誘導的巨噬細胞形態(tài)、炎癥因子、iNOS 等釋放及MAPK/NF-κB通路相關蛋白表達的影響將細胞分為：對照組、LPS(1 μg/mL)組、LPS+EGCG-L(12.5 μmol/L)組、LPS+EGCG-M(25 μmol/L)組、LPS+EGCG-H(50 μmol/L)組、LPS+DEX(陽性對照，0.5 μg/mL)組。根據(jù)MAPK/NF-κB通路激活劑Anisomycin逆轉(zhuǎn)高劑量EGCG對LPS誘導巨噬細胞炎癥反應的抑制作用將細胞分為LPS+EGCG-H組、LPS+EGCG-H+Anisomycin(300 ng/mL)組，所有細胞在添加對應的藥物處理1 h后，再加入100 μL 1 μg/mL LPS，培養(yǎng)24 h后，進行后續(xù)相關實驗。

1.4 檢測項目 ①RAW264.7細胞形態(tài)觀察。收集各組細胞，利用倒置顯微鏡(型號：NIB900-FL，上海悌可光電科技有限公司)觀察各組細胞的形態(tài)特征。②MTT法檢測細胞增殖。將RAW264.7細胞以1×106個/100 μL 接種到96孔板中，其中調(diào)零組添加100 μL完全培養(yǎng)基，37℃孵育24 h，向每孔中加入100 μL MTT溶液，37℃ 孵育4 h，除去上清，每孔中加入150 μL DMSO，于搖床上搖晃10 min后，使用酶標儀檢測590 nm波長處的吸光度。細胞存活率=(OD實驗組-OD調(diào)零組)/(OD對照組-OD調(diào)零組)×100%。③Griess法檢測細胞上清中NO含量。收集各組細胞上清液50 μL于96孔板中，向上清中加入50 μL Griess A和50 μL Griess B試劑，室溫避光10 min。利用酶標儀檢測540 nm處的吸光度，NO含量由亞硝酸鹽標準曲線計算。每個樣品設置6個復孔。④ELISA法檢測各組細胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的表達。嚴格按照TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 ELISA試劑盒操作說明操作步驟對各組細胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的表達進行檢測。每個樣品設置6個復孔。⑤Western Blot檢測iNOS、COX-2蛋白及MAPK/NF-κB通路相關蛋白的表達。利用蛋白提取試劑盒提取細胞中的總蛋白。將等量蛋白質(zhì)經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗iNOS、COX-2、p-p38、p-IκBα、p-NF-κB、p38、IκBα、NF-κB、GAPDH在4℃下孵育過夜。次日，將膜與HRP標記的羊抗兔二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL發(fā)光試劑盒檢測蛋白條帶。ImageJ軟件用于進行灰度值分析。每個樣品設置6個復孔。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度EGCG預處理對RAW 264.7細胞形態(tài)特征的影響 對照組RAW 264.7細胞形態(tài)正常，呈圓形或橢圓形；LPS組RAW 264.7細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，呈梭形或伸出偽足等；與LPS組比較，LPS+EGCG-L組、LPS+EGCG-M組、LPS+EGCG-H組、LPS+DEX組RAW 264.7細胞形態(tài)逐漸趨于正常，且隨著EGCG濃度的升高，RAW 264.7細胞呈圓形或橢圓形的狀態(tài)越明顯(見圖1)。

A：對照組；B：LPS組；C：LPS+EGCG-L組；D：LPS+EGCG-M組；E：LPS+EGCG-H組；F：LPS+DEX組。

2.2 不同濃度EGCG預處理對RAW 264.7細胞活力的影響 經(jīng)不同處理的RAW 264.7細胞的存活率均大于92%，說明12.5、25、50 μmol/L EGCG對RAW 264.7細胞無毒性作用(見表1)。

表1 EGCG對各組RAW 264.7細胞存活率的影響

2.3 不同濃度EGCG預處理對LPS誘導的RAW 264.7細胞中NO含量的影響 與對照組比較，LPS組RAW 264.7細胞中NO含量顯著升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+EGCG-L組、LPS+EGCG-M組、LPS+EGCG-H組、LPS+DEX組RAW 264.7細胞中NO含量顯著降低，且EGCG濃度越高，RAW 264.7細胞中NO含量越低(見表2)。

表2 EGCG對LPS誘導的RAW 264.7細胞中NO含量的影響

2.4 不同濃度EGCG預處理對LPS誘導的RAW 264.7細胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10水平的影響 與對照組比較，LPS組RAW 264.7細胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高，IL-10水平顯著降低(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+EGCG-L組、LPS+EGCG-M組、LPS+EGCG-H組、LPS+DEX組RAW 264.7細胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低，IL-10水平顯著升高(P<0.05)，且EGCG濃度越高，RAW 264.7細胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平越低，IL-10水平越高(見表3)。

表3 EGCG對LPS誘導的RAW 264.7細胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10水平的影響

2.5 不同濃度EGCG預處理對LPS誘導的RAW 264.7細胞中iNOS、COX-2蛋白表達的影響 與對照組比較，LPS組RAW 264.7細胞中iNOS、COX-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+EGCG-L組、LPS+EGCG-M組、LPS+EGCG-H組、LPS+DEX組RAW 264.7細胞中iNOS、COX-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，且EGCG濃度越高，iNOS、COX-2蛋白表達水平越低(見圖2，表4)。

表4 各組RAW 264.7細胞中iNOS、COX-2蛋白表達比較

A：對照組；B：LPS組；C：LPS+EGCG-L組；D：LPS+EGCG-M組；E：LPS+EGCG-H組；F：LPS+DEX組。

2.6 不同濃度EGCG預處理對LPS誘導的RAW 264.7細胞中MAPK/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響 與對照組比較，LPS組RAW 264.7細胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+EGCG-L組、LPS+EGCG-M組、LPS+EGCG-H組、LPS+DEX組RAW 264.7細胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，且EGCG濃度越高，p-p38、p-IκBα、p-NF-κB蛋白表達水平越低。由于高濃度EGCG對MAPK/NF-κB信號通路相關蛋白表達及LPS誘導的RAW 264.7細胞炎癥反應的抑制作用最顯著，因此，后續(xù)選用MAPK/NF-κB通路激活劑Anisomycin來干預LPS+EGCG-H組，以驗證Anisomycin能否逆轉(zhuǎn)高劑量EGCG對LPS誘導巨噬細胞炎癥反應的抑制作用(見圖3，表5)。

A：對照組；B：LPS組；C：LPS+EGCG-L組；D：LPS+EGCG-M組；E：LPS+EGCG-H組；F：LPS+DEX組。

表5 各組RAW 264.7細胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB蛋白表達比較

2.7 MAPK/NF-κB通路激活劑Anisomycin逆轉(zhuǎn)高劑量EGCG對LPS誘導巨噬細胞炎癥反應的抑制作用 與LPS+EGCG-H組比較，LPS+EGCG-H+Anisomycin組RAW 264.7細胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB、COX-2、iNOS蛋白表達水平及細胞上清中NO含量、TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高，IL-10水平顯著降低(P<0.05)，RAW 264.7細胞有少量呈梭形、細胞形態(tài)發(fā)生改變(見圖4、5、表6、7)。

A：LPS+EGCG-H組；B：LPS+EGCG-H+Anisomycin組。

圖5 倒置顯微鏡觀察RAW 264.7細胞形態(tài)

表6 RAW 264.7細胞中p-p38、p-IκBα、p-NF-κB、COX-2、iNOS蛋白表達比較

表7 RAW 264.7細胞中NO含量及細胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平比較

3 討論

炎癥具有腫脹、發(fā)紅、發(fā)熱和經(jīng)常疼痛的典型特征，是對損傷、組織缺血、自身免疫反應或感染因子的關鍵防御反應，也是自身免疫性疾病機體損傷的主要促成因素[15]。小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞系是白血病小鼠體內(nèi)的一種單核巨噬細胞，LPS刺激的巨噬細胞能誘導大量炎癥介質(zhì)(NO)和炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10)以及iNOS、COX-2的產(chǎn)生[16]。TNF-α和IL-1β是由巨噬細胞分泌，可加重炎癥反應的因子，IL-6為主要的促炎細胞因子，IL-10具有多種免疫功能，可以抑制炎癥和細胞免疫反應，它們在炎癥反應的調(diào)控中起著重要的作用[17]。COX-2作為一種誘導酶，可調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)NO和iNOS的合成與釋放，加重機體炎癥[18]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，LPS處理的RAW264.7細胞形態(tài)呈梭形，細胞中NO含量及iNOS、COX-2蛋白顯著升高，細胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β表達顯著升高，IL-10表達顯著降低，提示LPS誘導的RAW264.7細胞體外炎癥模型構(gòu)建成功。

EGCG是綠茶多酚的主要成分，其具有重要的抗菌、抗病毒、抗氧化、抗動脈硬化、抗血栓形成、抗血管生成、抗炎和抗腫瘤作用[19]。近年來，關于EGCG在炎癥反應中發(fā)揮抗炎作用的研究越來越多。Wang等[20]報道EGCG通過其抗炎作用對LPS誘導的急性肺損傷小鼠起保護作用；王友元等[21]表明EGCG通過TLR4調(diào)節(jié)的NF-κB途徑對炎癥細胞因子進行負調(diào)節(jié)，對LPS誘導的小鼠子宮內(nèi)膜炎具有緩解作用；趙悅伶等[22]發(fā)現(xiàn)EGCG能夠抑制炎癥因子分泌，減少由腸道炎癥引起的小鼠全身性炎癥反應，對葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠炎癥性腸病起到一定的保護作用。本研究結(jié)果顯示，EGCG可抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應，提示EGCG可抑制炎癥反應，這與上述的研究結(jié)果是一致的。表明EGCG是一種可產(chǎn)生抗炎作用的藥物，對于炎癥性疾病的治療具有廣闊的應用前景。然而本研究只是在體外細胞水平上證明了EGCG的抗炎作用，而關于EGCG在體內(nèi)能否產(chǎn)生同等效應尚需后續(xù)實驗進一步探究。

MAPK/NF-κB信號通路參與控制各種促炎基因的激活，導致促炎細胞因子以及重要的炎癥蛋白如COX-2和iNOS的產(chǎn)生，進而加重炎癥性疾病[23]。據(jù)報道，橄欖油多酚通過抑制MAPK/NF-κB通路減輕氧甾醇誘導的腸細胞的促炎反應[24]；BML-111通過抑制p38 MAPK/NF-κB通路活化促進腸缺血再灌注早期肺損傷炎癥消退[25]。而EGCG能否調(diào)控MAPK/NF-κB通路發(fā)揮抗炎作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，EGCG可以下調(diào)MAPK/NF-κB信號通路相關蛋白p-p38、p-IκBα、p-NF-κB的表達，且呈濃度依賴效應，提示EGCG可能通過抑制MAPK/NF-κB信號通路對LPS誘導的RAW264.7細胞發(fā)揮抗炎作用。為了驗證EGCG的調(diào)控機制，本研究利用MAPK/NF-κB信號通路激活劑Anisomycin進行干預，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Anisomycin可以逆轉(zhuǎn)EGCG對LPS誘導的RAW264.7細胞的抗炎作用，證實了EGCG是通過抑制MAPK/NF-κB信號通路對LPS誘導的RAW264.7細胞發(fā)揮抗炎作用。本研究以MAPK/NF-κB信號通路為切入點，探討了EGCG的抗炎機制，證實了EGCG通過抑制MAPK/NF-κB信號通路對LPS誘導的RAW264.7細胞發(fā)揮抗炎作用，為EGCG能夠應用于臨床治療炎癥性疾病奠定理論基礎。

綜上所述，EGCG可抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應，該機制與抑制MAPK/NF-κB信號通路有關。然而，EGCG調(diào)節(jié)炎癥反應涉及的通路較多，有待后續(xù)實驗進一步探究。