尚 羽，李康睿，葉 民，沈華超

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬明基醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 南京 210000；2.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 南京 210000)

缺血性腦卒中是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是導(dǎo)致死亡或長期殘疾的主要原因之一。這種致殘事件是由栓子或血栓引起的腦血流量突然下降引起[1]。目前最有效的治療策略是立即恢復(fù)腦血流量。然而，當(dāng)血液供應(yīng)恢復(fù)時(shí)，再灌注可能會(huì)損傷大腦，導(dǎo)致不良的臨床結(jié)果和一系列病理生理事件，如炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙[2-3]。雖然臨床上常用溶栓劑治療缺血性腦卒中，但其治療窗狹窄等安全問題限制了其應(yīng)用[4]。因此，探索防治缺血性腦卒中的新靶點(diǎn)至關(guān)重要。細(xì)胞療法是治療包括腦卒中在內(nèi)的許多疾病的有前途的策略[5]。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有可用性、可快速擴(kuò)增以及在同種異體移植中沒有倫理和免疫問題等特點(diǎn)[6]。最近的研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植可減少腦卒中后的梗死面積并改善神經(jīng)功能，但確切的分子機(jī)制尚不清楚[7]。Toll樣受體4(TLR4)是先天免疫系統(tǒng)的跨膜受體蛋白，屬于I型跨膜糖蛋白受體家族。在腦缺血再灌注(I/R)過程中，內(nèi)源性配體通過TLR4信號通路激活核因子-κB(NF-κB)，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量促炎因子、趨化因子、粘附分子等分子，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而加劇腦組織損傷[8]。研究表明，在腦缺血再灌注條件下，TLR4基因敲除小鼠的梗死體積明顯減少，NF-κB的活化和炎癥因子表達(dá)減少[9]。以上發(fā)現(xiàn)提示TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)通路有望成為預(yù)防和治療缺血性腦卒中的重要靶點(diǎn)。為給缺血性腦卒中患者提供神經(jīng)保護(hù)治療的新視角，本研究主要從TLR4/NF-κB炎癥通路入手，探討B(tài)MSCs對缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑儀器 TTC染液(Sigma公司)；TUNEL染色試劑盒(Roche公司)；ELISA試劑盒(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)；BCA蛋白檢測試劑盒(武漢博士德工程有限公司)；增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；TLR4、NF-κB p65,NF-κB p50、IκB抗體(Abcam公司)；熒光顯微鏡(Leica公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 8周齡雄性SD大鼠，體重250～280 g，所有大鼠都飼養(yǎng)在12 h光照/黑暗循環(huán)的動(dòng)物房中，濕度為(60±5)%，溫度為(22±3)°C，可以自由獲取水和食物。所有方案均獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將大鼠隨機(jī)分為3組(每組n=8)：假手術(shù)組(Sham組)、模型組(MCAO組)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(BMSCs組)。

1.2.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離和鑒定 首先，深度麻醉大鼠后斷頭于無菌條件下取出股骨和脛骨。將分離后的股骨和脛骨上附著的肌肉和韌帶清除，然后用PBS沖洗脛骨和股骨骨髓腔獲得細(xì)胞。然后，用含有細(xì)胞培養(yǎng)基的注射器將骨髓沖洗到離心管中。將細(xì)胞接種于添加10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)到80%時(shí)，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代處理。傳至第3代后，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面標(biāo)記物來鑒定BMSCs。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，用一抗(CD34、CD45、CD29、CD90)染色30 min，然后根據(jù)說明書與相應(yīng)的FITC二抗孵育30 min，最后將BMSCs懸浮在300 μL PBS中用于流式細(xì)胞術(shù)鑒定。

1.2.3 大鼠局灶性腦I/R模型構(gòu)建和BMSCs移植 通過大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)建立大腦I/R 模型。首先，手術(shù)前用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉大鼠。將大鼠固定在手術(shù)臺上，采用頸中線切口暴露并分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、右側(cè)頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。將一根單絲尼龍縫線插入頸內(nèi)動(dòng)脈管腔，并向前推進(jìn)至頸內(nèi)動(dòng)脈約18～22 mm，直至輕度阻力阻塞大腦中動(dòng)脈的起始端。缺血90 min后，緩慢拉出尼龍縫線進(jìn)行再灌注。Sham組只分離頸內(nèi)動(dòng)脈，不進(jìn)行任何治療。BMSCs組大鼠尾靜脈單次注射3×106個(gè)BMSCs。MCAO組、Sham組大鼠尾靜脈注射1mL生理鹽水。

1.2.4 神經(jīng)功能缺損評分 在I/R后72 h，采用改良神經(jīng)嚴(yán)重程度評分法(mNSS)測定各組大鼠的神經(jīng)活動(dòng)，評估運(yùn)動(dòng)、感覺、反射和平衡功能。mNSS評分為0～18分，評分越高表示神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。

1.2.5 TTC染色 在I/R后72 h，通過用氯化2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色評估腦梗死體積。使用10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠后立即處死。迅速取出大腦并在-20℃下冷凍15 min，然后制作2 mm厚的冠狀切片，并使用2% TTC染色10 min。使用Image-pro plus 6.0軟件對圖像進(jìn)行拍照和分析。梗死體積的計(jì)算公式為(%)=(對側(cè)半球體積-同側(cè)半球正常部分體積)/對側(cè)半球體積×100%。

1.2.6 TUNEL染色 制作腦組織石蠟切片，并切成4 μm厚度的組織片。切片在梯度酒精中脫水并與不含DNase的蛋白酶K在37℃下孵育30 min。PBS清洗3次，根據(jù)TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL染色。載玻片用DAPI重新染色10 min，并在熒光顯微鏡下成像以評估細(xì)胞凋亡程度。每片隨機(jī)獲得5張圖像，計(jì)算5張圖像中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)的平均值。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 解剖大鼠，腹主動(dòng)脈采血，離心收集上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β的濃度。取大鼠腦組織，PBS洗滌，用含PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液勻漿。離心，收集上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測腦組織超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)活性。最后用酶標(biāo)儀測量450 nm波長處的吸光度值。

1.2.8 Western blotting 解剖大鼠腦組織并與RIPA裂解緩沖液混合裂解組織塊，離心取上清液為總蛋白。采用BCA蛋白檢測試劑盒測定樣品中的蛋白濃度。該蛋白在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后將膜與5%脫脂牛奶孵育2 h，并用TBST緩沖液洗滌3次。隨后，將膜與一抗在4℃下孵育過夜，然后用TBST緩沖液洗滌3次。隨后用與辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗孵育1 h。使用增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行顯色。使用Image J評估平均灰度值，蛋白質(zhì)條帶強(qiáng)度歸一化為β-actin。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的分離和鑒定 培養(yǎng)的BMSCs呈現(xiàn)典型的紡錘形形態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示BMSCs的表面標(biāo)志分子CD29(99.83%)和CD90(99.87%)呈陽性，CD34(0.46%)和CD45(1.33%)低表達(dá)(見圖1)。

A：BMSCs的形態(tài)；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測BMSCs表面標(biāo)志物CD34、CD45、CD29、CD90表達(dá)。

2.2 BMSCs對MCAO大鼠神經(jīng)功能障礙的影響 結(jié)果顯示，Sham組大鼠未出現(xiàn)任何的神經(jīng)功能缺損癥狀，MCAO組大鼠出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，mNSS評分較Sham組顯著升高，BMSCs組大鼠的mNSS評分較MCAO組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

*：與Sham組比較，P<0.05；#：與MCAO組比較，P<0.05。

2.3 BMSCs對MCAO大鼠腦梗死體積的影響 TTC染色結(jié)果顯示，MCAO組大鼠出現(xiàn)了明顯的腦梗死，BMSCs組大鼠的腦梗死體積較MCAO組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖3)。

2.4 BMSCs對MCAO大鼠腦組織和血清的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響 與Sham組比較，MCAO組大鼠缺血腦組織中SOD活性顯著降低，MDA水平升高，大鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6濃度顯著升高；與MCAO組比較，BMSCs組大鼠缺血腦組織中SOD活性顯著升高，MDA水平降低，大鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6濃度降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖4)。

*：與Sham組比較，P<0.05；#：與MCAO組比較，P<0.05。

2.5 BMSCs對MCAO大鼠腦細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的影響 與Sham組比較，MCAO組大鼠腦組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著升高，Bax和caspase-3蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)減少；與MCAO組比較，BMSCs組大鼠腦組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著降低，Bax和caspase-3蛋白表達(dá)減少，Bcl-2蛋白表達(dá)增加(P<0.05，見圖5)。

A：TUNEL染色檢測腦細(xì)胞凋亡情況；B：Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase-3、Bcl-2的表達(dá)；*：與Sham組比較，P<0.05；#：與MCAO組比較，P<0.05；×400。

2.6 BMSCs對TLR4/NF-κB信號通路的影響 與Sham組比較，MCAO組大鼠腦組織中TLR4、NF-κB p65、NF-κB p50蛋白明顯升高，IκB蛋白表達(dá)明顯降低；與MCAO組比較，BMSCs組大鼠腦組織中TLR4、NF-κB p65、NF-κB p50蛋白明顯降低，IκB蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05，見圖6)。

*：與Sham組比較，P<0.05；#：與MCAO組比較，P<0.05。

3 討論

先前的研究表明，腦I/R損傷是導(dǎo)致成人神經(jīng)功能障礙的主要原因，炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡是腦I/R損傷過程的3種主要機(jī)制，腦I/R損傷是世界范圍內(nèi)第二大最常見的致死因素，也是導(dǎo)致成人神經(jīng)功能障礙的主要原因[10-11]。此外，炎癥是腦I/R損傷的主要預(yù)防機(jī)制之一[12]。因此，抑制神經(jīng)元炎癥是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。雖然來自動(dòng)物研究的各種治療方法得到了發(fā)展，但是缺血性腦卒中仍然缺乏理想的有效治療方法[13]。有研究報(bào)道MSCs在局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭芯哂杏幸孀饔肹14]。然而，MSCs治療后腦梗死體積減少和神經(jīng)功能改善的潛在機(jī)制尚不清楚。

正如預(yù)期的那樣，本研究結(jié)果與之前的報(bào)告一致，即移植BMSCs可以減少M(fèi)CAO大鼠腦梗死體積，改善其神經(jīng)功能缺損[15]。細(xì)胞凋亡在腦缺血后神經(jīng)元死亡中起決定性作用，在血供減少后的早期隨訪期，半暗區(qū)尤其易發(fā)生細(xì)胞凋亡。因此，該腦區(qū)細(xì)胞凋亡的減少是治療干預(yù)的主要目標(biāo)之一[16]。既往研究表明，MSCs移植在局灶性缺血模型中具有抗神經(jīng)元凋亡的作用[17-18]。炎癥級聯(lián)反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制[19]。小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中起重要作用。這些因子可誘導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)，增強(qiáng)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，促進(jìn)一氧化氮的合成，誘導(dǎo)氨基酸和自由基的生成，并引發(fā)多重級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致腦缺血腦區(qū)不可逆的神經(jīng)元凋亡[20]。最近的研究表明，BMSCs對潰瘍性結(jié)腸炎、脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷和骨關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)有很強(qiáng)的抑制作用[21-23]。本研究探討了BMSCs對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)BMSCs通過抑制炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡表現(xiàn)出顯著的腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用。

為了進(jìn)一步確定BMSCs依賴神經(jīng)保護(hù)的分子機(jī)制，我們研究了TLR4/NF-κB信號通路，該通路在缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和細(xì)胞死亡中起主要作用。Toll樣受體(TLR)是一種跨膜蛋白，它將細(xì)胞外抗原信息轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)并引發(fā)炎癥反應(yīng)。TLR4是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的TLR成員，通過識別和結(jié)合多種內(nèi)源性和外源性配體在免疫防御和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。TLR4與其配體結(jié)合激活髓樣分化因子88(MyD88)，后者將信號傳遞給IL-1受體相關(guān)激酶(IRAKs)家族的成員。隨后，IRAKs與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF-6)結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)化生長因子β激酶1(TAK1)。它進(jìn)一步激活NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)并磷酸化NF-κB抑制劑激酶(IKK)復(fù)合物[24]?；罨腎KK復(fù)合物(IKKα和IKKβ)誘導(dǎo)IκB泛素化和降解，導(dǎo)致NF-κB激活，并易位至細(xì)胞核與炎癥調(diào)節(jié)基因的啟動(dòng)子結(jié)合，可促進(jìn)TNF-α、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和合成，從而啟動(dòng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[25]。既往研究表明，TLR4參與肝、肺、心I/R炎癥損傷，并在腦I/R過程中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，可以特異性結(jié)合眾多基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，從而參與多種細(xì)胞功能，包括炎癥、細(xì)胞增殖和凋亡。NF-κB在I/R損傷的激活中也起著至關(guān)重要的作用[27]。因此，阻斷和減弱TLR4/NF-κB通路的激活可能是抗腦缺血所致腦損傷的關(guān)鍵機(jī)制之一。之前的研究報(bào)道BMSCs對NF-κB、JNK和MAPK有顯著影響[28-29]，但BMSCs對TLR4的影響尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSCs顯著抑制MCAO大鼠TLR4、NF-κB p65和NF-κB p50的表達(dá)，促進(jìn)IκB蛋白的表達(dá)，表明BMSCs可能抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活，提示BMSCs對缺血性腦卒中的影響，可能至少部分通過抑制TLR4/NF-κB信號通路起作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明BMSCs對腦I/R損傷大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，并且BMSCs的抗炎和抗凋亡作用可能與抑制TLR4/NF-κB通路有關(guān)，從而支持BMSCs作為治療缺血性腦卒中靶點(diǎn)的潛在臨床價(jià)值。