蹇明輝，陳文明，張 怡

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563099；2 遵義醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟報告，目前，糖尿病影響著近 42.5億人[1-2]。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是與糖尿病相關(guān)的主要并發(fā)癥，最初的特點(diǎn)是左心室舒張期功能障礙和間質(zhì)纖維化，隨后收縮功能障礙和射血分?jǐn)?shù)降低，并最終導(dǎo)致心臟衰竭[3-5]。值得注意的是，心肌細(xì)胞凋亡在與 DCM 相關(guān)的病理生理機(jī)制中起著重要作用。Fas/FasL 信號傳導(dǎo)對心肌細(xì)胞凋亡至關(guān)重要，因為它主要調(diào)節(jié) caspase-3[6]。目前，西醫(yī)主要側(cè)重于血糖控制和心血管疾病相關(guān)危險因素的治療或預(yù)防；然而，這些方法并沒有從根本上解決心臟功能障礙的問題。

延胡索乙素(l-tetrahydropalmatine，l-THP)是延胡索WT Wang的主要成分，是公認(rèn)的多巴胺D2受體阻滯劑，具有顯著的鎮(zhèn)靜、催眠和鎮(zhèn)痛作用[7]。l-THP還可以阻斷鈣通道，抑制病原菌，保護(hù)腦組織和心血管系統(tǒng)[8-10]。Yu研究發(fā)現(xiàn)l-THP顯著抑制 CaSr/PLCγ1 通路并保護(hù)輻射誘導(dǎo)的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[11]。本研究通過探索l-THP對高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激的作用，為中藥預(yù)防 DCM 提供新的科學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑 延胡索乙素(成都埃法生物科技有限公司)；低糖 DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gemini公司)；兔抗GAPDH多克隆抗體、兔抗Caspase-3多克隆抗體(美國Proteintech公司)；DyLightTM 800熒光標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白二抗(美國 Cell Signaling Technology 公司)；LDH、SOD和MDA檢測試劑盒(江蘇南京建成生物工程研究所)。

1.2 主要儀器 3131型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、MULTISKAN型全波長酶標(biāo)儀、MULTIFUGE型超速冷凍離心機(jī)、ST16型低速臺式離心機(jī)等(美國 Thermo Fisher Scientific公司)；1450型生物超凈臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；CKX-41 型倒置熒光顯微鏡(日本 Olympus公司)；CFX CONNECT型熒光定量PCR系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、Mini PROTEAN?Tetra Cell 型電泳槽(美國Bio-Rad公司)；Milli-Q Advantage 超純水系統(tǒng)(美國默克公司)；MLS-3780型全自動高壓蒸汽滅菌器(日本三羊公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、分組 大鼠H9c2心肌細(xì)胞來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞培養(yǎng)中心。H9c2心肌細(xì)胞在含有10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中饑餓，并在含有5%CO2的37℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，待細(xì)胞融合度達(dá) 70%～80%時，以含0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將呈對數(shù)生長期的 H9c2 心肌細(xì)胞分為5 組：(1)對照組(Control)：5.5 mM 正常葡萄糖；(2)模型組(Model)：30 mM D-葡萄糖；(3)l-THP高劑量組(l-THP-H)：30 mM D-葡萄糖和 100 μg/mLl-THP 的 DMEM 中培養(yǎng) 24 h；(4)l-THP中劑量組(l-THP-M)：30 mM D-葡萄糖和50 μg/mLl-THP 的 DMEM 中培養(yǎng) 24 h；(5)l-THP低劑量組(l-THP-L)：30 mM D-葡萄糖和 25 μg/mLl-THP 的 DMEM 中培養(yǎng)24 h。

1.4 H9c2心肌細(xì)胞存活率的檢測 通過噻唑藍(lán)(MTT)法檢測H9c2細(xì)胞的活性，待l-THP處理24 h，收集H9c2細(xì)胞，然后用MTT溶液(0.5mg/mL)在37℃培養(yǎng)4 h。采用MULTISKAN型全波長酶標(biāo)儀，選擇波長 490 nm，檢測每孔樣本的吸光度(OD)值，并計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗組 OD 值-空白組 OD 值)/(正常組 OD 值-空白組 OD 值)×100%。

1.5 H9c2心肌細(xì)胞上清液中LDH、ROS和GSH-PX活性的檢測l-THP處理H9c2細(xì)胞24 h，收集培養(yǎng)液，在4℃條件下，3 000 r/min，離心10 min，取其上清液，按照試劑盒說明書的方法進(jìn)行操作，然后采用酶標(biāo)儀分別檢測細(xì)胞上清液中LDH、ROS和GSH-PX的活性。

1.6 細(xì)胞凋亡測定 Annexinvfitc/PI染色檢測H9c2細(xì)胞凋亡。在該操作過程中，使用0.05%胰蛋白酶收集H9c2細(xì)胞，用4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，然后在濃度為1×105cells/mL的500 μg/mL結(jié)合緩沖液中再懸浮。然后在室溫下將細(xì)胞與膜聯(lián)蛋白V-FITC(5 μg/mL)和PI(5 μg/mL)在黑暗中培養(yǎng)15 min。

1.7 蛋白質(zhì)印跡 在l-THP處理H9c2心肌細(xì)胞后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，定量。蛋白變性后，使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。使用Tris緩沖鹽水(TBS)封閉緩沖液封閉細(xì)胞膜，并在4℃下，與一抗Caspase-3多克隆抗體(1∶1 000)孵育過夜。在用Tris緩沖鹽水吐溫-20(TBST)洗滌膜3次后，將其與HRP結(jié)合的二級抗體孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑獲得抗原-抗體復(fù)合物條帶，并使用凝膠成像系統(tǒng)分析獲得條帶強(qiáng)度。Caspase-3與內(nèi)參GADPH 的蛋白灰度值比值表示蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗重復(fù)3次。

1.8 實(shí)時PCR 在l-THP處理H9c2心肌細(xì)胞24h，收集細(xì)胞，使用TRIzol提取總核糖核酸(RNA)，在確定濃度和純度后，使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)。在實(shí)時PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以擴(kuò)增Fas、Fas-L和GAPDH基因?；蛐蛄校篎AS上游引物為5′2TCTAGTTGG AAAGAACCGAAGG2 3′，下游引物為5′ 2TCTAGT TGGAAAGAACCGAAGG2 3′，引物長度為306 bp；

Fas-L：上游引物為5′2GGAATGGGAAGACA CATATGGAACTGC2 3′，下游引物為5′2CATATC TGGCCAGTAGTGCAGTAATTC2 3′，引物長度為237bp；GAPDH：上游引物為5′2AAATCGT2GC GTGACATTAA2 3′，下游引物為5′ 2TCGTC ATACTCCTGCTTG2 3′，引物長度為381 bp。結(jié)果用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析，并與對照組進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1l-THP提高H9c2心肌細(xì)胞的活力 用不同濃度的l-THP 處理高糖誘導(dǎo)的 H9c2心肌細(xì)胞 24 h，觀察l-THP對H9c2心肌細(xì)胞活力的影響。結(jié)果如表1所示，Model組H9c2心肌細(xì)胞活力明顯低于 Control 組(P< 0.05)，與Model組相比，隨l-THP濃度增加，H9c2心肌細(xì)胞的活力呈劑量依賴性恢復(fù)(P< 0.05)。

表1 l-THP對高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞存活率的影響

2.2l-THP對 H9c2 心肌細(xì)胞 LDH 釋放量和氧化應(yīng)激水平的影響 用不同濃度的l-THP 處理高糖誘導(dǎo)的 H9c2心肌細(xì)胞 24 h，觀察l-THP對H9c2心肌細(xì)胞活力的影響。結(jié)果如表2所示，Model組H9c2心肌細(xì)胞LDH 釋放量明顯高于Control 組(P< 0.05)，與Model組相比，H9c2心肌細(xì)胞LDH 釋放量隨l-THP濃度增加，呈劑量依賴性降低(P< 0.05)；Model組H9c2心肌細(xì)胞ROS的活性顯著高于Control 組(P<0.05)，與Model組相比，H9c2心肌細(xì)胞ROS的活性隨l-THP濃度增加，呈劑量依賴性降低(P<0.05)；Model組H9c2心肌細(xì)胞GSH-PX的活性明顯低于Control 組(P<0.05)，與Model組相比，H9c2心肌細(xì)胞GSH-PX的活性隨l-THP濃度增加，呈劑量依賴性升高。

表2 l-THP對 H9c2細(xì)胞 LDH 釋放量和氧化應(yīng)激水平的影響

2.3l-THP對高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果如表 3所示，與Control 組相比，Model組H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率顯著增加(P<0.05)；與 Model組相比，l-THP降低了高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率，在 25、50、100 μg/mL的濃度下，隨l-THP濃度增加，H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率呈劑量依賴性降低(P<0.05)。

表3 l-THP對高糖誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞凋亡的影響

2.4l-THP通過降低 Caspase-3 表達(dá)來抑制高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡 為了確定l-THP 介導(dǎo)的高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡抑制的機(jī)制，我們通過蛋白質(zhì)印跡檢測了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果如圖1所示，Model組的H9c2心肌細(xì)胞Caspase-3表達(dá)水平明顯高于Control 組(P<0.05)，給予l-THP 預(yù)處理后，Caspase-3表達(dá)水平呈濃度依賴性降低(P<0.05)。因此，l-THP 可能通過下調(diào) Caspase-3 表達(dá)來抑制高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與Model組比較，P<0.05。

2.5l-THP 下調(diào)高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞 Fas 和 FasL mRNA 的表達(dá)水平 為了進(jìn)一步闡明l-THP 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抑制的分子機(jī)制，檢測了 Fas 和 FasL 基因表達(dá)水平。RT-PCR結(jié)果表明(見表4)，Model組H9c2心肌細(xì)胞Fas和FasL的 mRNA表達(dá)水平明顯高于Control 組(P<0.05)，與Model組相比，給予l-THP處理后，F(xiàn)as和FasL mRNA的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，然而，25、50 μg/mL的l-THP處理組和Model組之間Fas和FasL mRNA的表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。

表4 Real-time PCR 分析H9c2細(xì)胞Fas和FasL基因表達(dá)水平

3 討論

氧化應(yīng)激在糖尿病心肌細(xì)胞損傷及DCM的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS與機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)不平衡，過量的活性氧介導(dǎo)細(xì)胞蛋白質(zhì)及核酸損傷，引發(fā)細(xì)胞凋亡，從而引起組織器官功能障礙[12]。GSH-Px 是機(jī)體的清除劑，能特異性地清除過氧自由基、超氧陰離子等，從而減輕ROS造成的損傷[13]。LDH主要存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受損時，LDH會泄漏至細(xì)胞外，故可作為反映細(xì)胞損傷程度的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，l-THP可明顯降低高糖誘導(dǎo)的H9c2 心肌細(xì)胞上清液中ROS、LDH 的活性，升高GSH-Px 的活性。證實(shí)l-THP可通過抗氧化應(yīng)激作用來減輕高糖對心肌細(xì)胞造成的損傷。

心肌細(xì)胞異常凋亡是DCM 主要病理特征之一，研究發(fā)現(xiàn)，在DCM 發(fā)病過程中，異常凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)量不斷增加，可導(dǎo)致心肌有效收縮單元不斷減少，從而影響心臟功能[14]。Caspase 是一種促使細(xì)胞凋亡的酶，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的終末剪切酶，是細(xì)胞凋亡的有力執(zhí)行者，可通過催化細(xì)胞基質(zhì)裂解，加速細(xì)胞的凋亡[15]?？鄥A通過下調(diào)Caspase-3、Bax和BCL-2等相關(guān)凋亡因子的表達(dá)，改善高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷[16]。研究觀察到高糖誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細(xì)胞凋亡增加的同時，caspase-3表達(dá)增加，給予l-THP干預(yù)處理后，能夠下調(diào)caspase-3表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡。提示，l-THP 對心肌的保護(hù)作用可能與抑制caspase-3表達(dá)有關(guān)。由此表明，l-THP對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷可能是通過抗凋亡作用而發(fā)揮保護(hù)作用。

為了進(jìn)一步探索l-THP介導(dǎo)抑制高糖誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究還對Fas和FasL進(jìn)行了研究。文獻(xiàn)報道，F(xiàn)as/FasL信號通路可直接觸發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，在心血管疾病相關(guān)研究中已有報道[17]。值得注意的是，F(xiàn)as/FasL結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)“死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物”的積累，這些復(fù)合物為Fas介導(dǎo)的凋亡提供了必要的因素。本研究表明，模型組Fas和FasLmRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)；給予l-THP干預(yù)處理后，F(xiàn)as和FasLmRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)。這表明l-THP減輕細(xì)胞凋亡的作用，還可能與下調(diào)Fas、FasL的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，l-THP通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和抗氧化應(yīng)激作用來保護(hù)H9c2細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的損傷并提高其生存能力。