董姝君，高昕樂，羅 婷，陳燕玲，何柳樺，王靜蕾，夏雨果，陳應(yīng)瓊

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 病理生理學(xué)教研室，廣東 珠海 519041；2.遂寧市中心醫(yī)院 病理科，四川 遂寧 629000)

對比劑腎病是導(dǎo)致醫(yī)源性急性腎功能損傷的第三大主因，也是缺血性心臟病患者PCI術(shù)后死亡的主要原因[1-2]。對比劑腎病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要與對比劑引起近端腎小管空泡轉(zhuǎn)化、間質(zhì)水腫和腎小管變性，腎臟微血管結(jié)構(gòu)改變，氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)[3-4]。其中，腎小管上皮細(xì)胞損傷在對比劑腎病的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位。課題組前期研究結(jié)果顯示，對比劑可直接激活腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)炎癥小體繼而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。而炎癥小體的激活以及細(xì)胞凋亡均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有密切關(guān)系[6]。在缺血缺氧以及代謝障礙等刺激因素作用下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能出現(xiàn)紊亂，使大量錯誤折疊蛋白質(zhì)堆積，此時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可通過未折疊蛋白反應(yīng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑(泛素-蛋白酶體)來減少錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蓄積，這個過程稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[7]。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有助于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)，但當(dāng)其反應(yīng)過度時則會激活炎癥小體，甚至引起細(xì)胞凋亡。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與炎癥小體及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，而對比劑引起的細(xì)胞損傷又與炎癥小體的激活以及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，我們推測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與了對比劑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷。因此，本研究擬探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA對碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞是否具有保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為對比劑腎病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象 HK-2細(xì)胞株由中山大學(xué)病理生理學(xué)教研室王蔚東教授饋贈，購自美國菌種保藏中心(American type culture collection,ATCC)[8]。

1.1.2 實驗材料及試劑 4-PBA為美國MedChem Express公司產(chǎn)品；碘普羅胺為拜耳醫(yī)藥保健有限公司產(chǎn)品；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；發(fā)光底物HRP為美國Milipore公司產(chǎn)品；胰蛋白酶-EDTA(0.25%)、DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司；熒光探針DCFH-DA、DAPI染色液為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；CCK-8試劑盒為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品；GRP78、eIF2α、p-eIF2α、p-JNK、Bax、Bcl-2及內(nèi)參GAPDH等Ⅰ抗及相應(yīng)的Ⅱ抗均為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗儀器 Multiskan Mk3酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific)；Mini-PROTEAN Tetra電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；CyFlow Cube流式細(xì)胞儀(德國PARTEC公司)；雙色近紅外多功能成像儀(德國Analytik Jena公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞鋪滿T25瓶底約90%時進(jìn)行傳代處理以及后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組 實驗分為5組：對照組、150 mgI/mL碘普羅胺組、碘普羅胺+不同濃度(1、2.5、5 mmol/L)4-PBA處理組。

1.2.3 CCK-8法檢測HK-2細(xì)胞細(xì)胞活力 將HK-2細(xì)胞按5 000個/孔的密度接種到96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔。4-PBA處理組分別用1、2.5、5 mmol/L 濃度的4-PBA預(yù)處理細(xì)胞20 min后，根據(jù)實驗分組加入碘普羅胺繼續(xù)培養(yǎng)3 h。然后去除培養(yǎng)基，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基配制的10% CCK-8溶液，避光作用1.5 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處吸光度值(OD)，細(xì)胞存活率(%)=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)×100%。

1.2.4 DCFH-DA染色觀察細(xì)胞內(nèi)ROS生成 將細(xì)胞按合適密度接種到6孔板中。根據(jù)上述分組對細(xì)胞進(jìn)行處理后，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，然后每組加入1 mL無血清培養(yǎng)基配制的DCFH-DA染液(終濃度為1 μg/L)，37℃避光染色15 min后，用PBS洗3遍，用熒光顯微鏡(200×)觀察細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度并隨機(jī)選取6個不同視野的細(xì)胞進(jìn)行拍照。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平 將細(xì)胞按合適密度接種到6 cm培養(yǎng)皿中，根據(jù)上述分組對細(xì)胞進(jìn)行處理后，去除培養(yǎng)液，用不含EDTA的胰酶消化、離心并收集細(xì)胞，染色方法及處理同“1.2.3”。用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度，F(xiàn)CS express 4.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

1.2.6 Rh123染色法觀察細(xì)胞線粒體膜電位 將細(xì)胞按合適密度接種到6孔板中，根據(jù)上述分組對細(xì)胞進(jìn)行處理后，吸除培養(yǎng)液，然后每組加入1 mL無血清培養(yǎng)基配制的終濃度為1 μg/L的Rh123染液，37℃避光孵育15 min后，PBS洗3次，熒光顯微鏡(200×)觀察細(xì)胞內(nèi)黃綠色熒光并隨機(jī)選取6個不同視野的細(xì)胞進(jìn)行拍照。

1.2.7 DAPI染色法觀察細(xì)胞核形態(tài) 將細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞充分貼壁且鋪滿板底約90%時，去除培養(yǎng)基，根據(jù)上述分組對細(xì)胞進(jìn)行處理后，吸出培養(yǎng)液，每組加入1 mL用甲醇配制的終濃度為1 μg/L的DAPI染色液，放入培養(yǎng)箱避光染色20 min后，PBS洗3次，熒光顯微鏡(400×)觀察細(xì)胞內(nèi)具有凋亡形態(tài)的細(xì)胞核并隨機(jī)選取6個不同視野的細(xì)胞進(jìn)行拍照。

1.2.8 Western blotting檢測 將細(xì)胞接種到6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁并生長至皿底約90%時加入不同藥物處理。藥物處理3 h后去除培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗3次，每皿滴加120 μL RIPA裂解液，冰上裂解細(xì)胞15 min。刮取細(xì)胞并離心取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。根據(jù)蛋白分子量配制SDS電泳凝膠。電泳條件：恒壓80 V，30 min；然后恒壓120 V，60～80 min。電轉(zhuǎn)條件：恒流220 mA，60～120 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、CHOP、GRP78、p-JNK、JNK、p-eIF-2α、eIF-2α及p-IRE1α蛋白Ⅰ抗(1∶1 000)，在4℃孵育過夜。用PBST洗3次，然后加入Ⅱ抗(1∶5 000)在室溫下孵育60 min，PBST洗3次后，加入ECL發(fā)光液后用成像儀掃描成像，然后用Image J軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 4-PBA對碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞存活率的影響 與對照組相比較，碘普羅胺組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)，而加入1、2.5、5 mmol/L的4-PBA處理后[9]，細(xì)胞存活率明顯增高(P<0.01，見表1)。

表1 4-PBA對碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞存活率的影響

2.2 4-PBA碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響 DCFH-DA經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)ROS的氧化可生成DCFH，在熒光顯微鏡下顯示綠色熒光，其含量與細(xì)胞內(nèi)ROS的數(shù)量呈正比。與對照組相比，碘普羅胺組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而加入1、2.5、5 mmol/L濃度的4-PBA處理后細(xì)胞熒光強(qiáng)度均較碘普羅胺組減弱(見圖1)。用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，結(jié)果與顯微鏡下觀察的一致(見圖2，表2)。

A:對照組;B:150 mgI/mL碘普羅胺組;C:150 mgI/mL碘普羅胺+1 mmol/L 4-PBA組;D:150 mgI/mL碘普羅胺+2.5 mmol/L 4-PBA組;E:150 mgI/mL碘普羅胺+5 mmol/L 4-PBA組;×200。

A:對照組;B:150 mgI/mL碘普羅胺組;C:150 mgI/mL碘普羅胺+1 mmol/L 4-PBA組;D:150 mgI/mL碘普羅胺+2.5 mmol/L 4-PBA組;E:150 mgI/mL碘普羅胺+5 mmol/L 4-PBA組。

表2 各組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度

2.3 4-PBA對碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ΔΨm 的影響 Rh123可以穿透細(xì)胞膜并在活細(xì)胞線粒體內(nèi)聚集，在顯微鏡下觀察活細(xì)胞會發(fā)出黃綠色熒光，且強(qiáng)弱程度與ΔΨm呈正比。在熒光顯微鏡下觀察，碘普羅胺組熒光強(qiáng)度較對照組減弱，而加入不同濃度的4-PBA處理后，細(xì)胞熒光強(qiáng)度均較碘普羅胺組增高(見圖3)。

A:對照組;B:150 mgI/mL碘普羅胺組;C:150 mgI/mL碘普羅胺+1 mmol/L 4-PBA組;D:150 mgI/mL碘普羅胺+2.5 mmol/L 4-PBA組;E:150 mgI/mL碘普羅胺+5 mmol/L 4-PBA組；×200。

2.4 4-PBA對碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響 與對照組HK-2細(xì)胞相比，碘普羅胺組Bax蛋白表達(dá)明顯增高，而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Bax/Bcl-2比值以及Cleaved-Caspase-3表達(dá)較對照組上調(diào)。而加入不同濃度的4-PBA處理后，Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2比值均較碘普羅胺組降低(P<0.05，見圖4，表3)。

圖4 4-PBA對碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表3 各組細(xì)胞Bax/ Bcl-2比值以及Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平

2.5 4-PBA對碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)DAPI染色觀察各組細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)變化，對照組細(xì)胞的細(xì)胞核基本呈現(xiàn)均勻的低密度藍(lán)色熒光，而經(jīng)碘普羅胺處理后，部分細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮或核分裂等凋亡細(xì)胞的典型特征，在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞核局部有致密濃染的藍(lán)色熒光。加入1、2.5、5 mmol/L濃度的4-PBA處理后，出現(xiàn)凋亡特征的細(xì)胞數(shù)較碘普羅胺組減少(見圖5)。

A:對照組;B:150 mgI/mL碘普羅胺組;C:150 mgI/mL碘普羅胺+1 mmol/L 4-PBA組;D:150 mgI/mL碘普羅胺+2.5 mmol/L 4-PBA組;E:150 mgI/mL碘普羅胺+5 mmol/L 4-PBA組；白色箭頭所示為發(fā)生凋亡的細(xì)胞；×400。

2.6 4-PBA對碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP、p-IRE1α、p-JNK、JNK及p-eIF-2α、eIF-2α表達(dá)水平的影響 Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比，碘普羅胺組HK-2細(xì)胞GRP78、CHOP、p-IRE1α蛋白表達(dá)水平、p-JNK/JNK及p-eIF-2α/eIF-2α比值增高；而加入不同濃度的4-PBA處理組后GRP78、CHOP、p-IRE1α、p-JNK、JNK及p-eIF-2α/eIF-2α比值均較碘普羅胺組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖6，表4)。

表4 各組細(xì)胞GRP78、CHOP、p-IRE1α蛋白表達(dá)水平及p-JNK/JNK、p-eIF-2α/eIF-2α比值

圖6 4-PBA對碘普羅胺誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

研究報道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與腎小管損傷密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能出現(xiàn)紊亂導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)被錯誤折疊，并激活肌醇必需蛋白1α(Inositol requiring protein-1,IRE1α)、蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)激酶(Protein kinase RNA-like ER kinase,PERK)及激活轉(zhuǎn)錄因子-6(Activating transcription factor-6,ATF-6)等跨膜受體感應(yīng)蛋白，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response,UPR)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑(泛素-蛋白酶體)，減少錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蓄積[10]?；罨腎RE-1α可通過激活JNK以及p38絲裂原活化蛋白激酶誘導(dǎo)前凋亡基因CHOP的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。PERK的激活可使真核翻譯起始因子2α(eIF2α)磷酸化，從而抑制mRNA翻譯，并誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)[12-13]。本研究顯示，150 mgI/mL的碘普羅胺作用HK-2細(xì)胞3h后，細(xì)胞活力降低，Bax/Bcl-2、p-JNK/JNK及p-eIF-2α/eIF-2α比值以及Cleaved-Caspase-3、GRP78、CHOP、p-IRE1α的表達(dá)明顯增高，說明碘普羅胺可能通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，觸發(fā)細(xì)胞凋亡介導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷。

4-PBA是一種低分子量且具有伴侶活性的化合物，可作為特異的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑發(fā)揮其藥理作用，通過阻斷UPR的激活從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)損傷[14]。有研究表明，4-PBA可以通過抑制NF-κB途徑以及Caspase-3的激活減輕脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[15]。在衰老小鼠心臟組織中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激明顯增強(qiáng)，線粒體功能障礙，而經(jīng)過4-PBA預(yù)處理后可顯著降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，恢復(fù)線粒體的功能[16]。本研究結(jié)果顯示，與碘普羅胺處理組相比，細(xì)胞活力隨4-PBA濃度的增加而逐漸上升，而Bax/Bcl-2、p-JNK/JNK、p-eIF-2α/eIF-2α比值以及Cleaved-Caspase-3、GRP78、CHOP、p-IRE1α的蛋白表達(dá)水平均降低。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活UPR后，活化的IRE-1α和PREK可通過調(diào)控硫氧還蛋白結(jié)合蛋白(Thioredoxin interaction protein,TXNIP)轉(zhuǎn)錄水平，誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，從而激活NLRP3炎癥小體，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷、焦亡[17]。NLRP3炎癥小體的激活進(jìn)一步加劇腎小球硬化，使腎小管基底膜增厚，腎小管間質(zhì)纖維化，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡化甚至凋亡。我們前期研究結(jié)果顯示，用不同濃度的碘普羅胺處理HK-2細(xì)胞后，細(xì)胞活力明顯下降，ROS水平、NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β蛋白的表達(dá)均明顯增高[5]，提示碘普羅胺極有可能通過ROS途徑激活NLRP3炎癥小體引起HK-2細(xì)胞損傷。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)碘普羅胺作用3h后的HK-2細(xì)胞，ROS水平明顯升高，不同濃度的4-PBA均可減少ROS的產(chǎn)生，減輕細(xì)胞損傷。說明碘普羅胺可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活UPR，誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，而4-PBA 是否能抑制NLRP3炎癥小體的激活還需進(jìn)一步研究。

此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的Ca2+被釋放到細(xì)胞質(zhì)中導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜去極化，并通過抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax調(diào)節(jié)線粒體途徑，對細(xì)胞凋亡起調(diào)控作用[18-19]。本研究結(jié)果顯示，HK-2細(xì)胞經(jīng)碘普羅胺處理3h后，ΔΨm明顯降低，部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮或核碎裂，凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2比值以及Cleaved-Caspase-3的表達(dá)增高，而不同濃度的4-PBA均可逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)。

雖然本研究在細(xì)胞水平上初步證實了4-PBA的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，但仍存在不足之處。在接下來的實驗中，我們將繼續(xù)研究4-PBA是否能抑制ERS介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活，并通過建立對比劑腎病動物損傷模型進(jìn)一步探討4-PBA的作用機(jī)制。

綜上所述，4-PBA可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕碘普羅胺引起的腎小管上皮細(xì)胞損傷。但4-PBA 是否能抑制NLRP3炎癥小體的激活還需進(jìn)一步研究。